Summary
Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.
Abstract
Cristalografia de raios X é o método de escolha para a obtenção de uma visão detalhada da estrutura das proteínas. Tais estudos devem ser complementadas por outras análises bioquímicas para obter insights detalhados em estrutura / função relacionamentos. Avanços no oligonucleótido e tecnologia de síntese de gene tornar estratégias de mutagénese em larga escala cada vez mais viável, incluindo a substituição de resíduos alvo por todos os outros 19 aminoácidos. Ganho ou perda de função de fenótipos então permitir conclusões sistemáticas para ser elaborados, tais como a contribuição dos resíduos específicos a actividade catalítica a estabilidade da proteína, e / ou proteína-proteína especificidade interacção.
De modo a atribuir diferentes fenótipos à natureza da mutação -, em vez de a variação das condições experimentais, - é vital para purificar e analisar as proteínas de uma forma controlada e reprodutível. Alto rendimento estratégias ea automação de protocolos manuais emrobóticos líquido de manipulação de plataformas criaram oportunidades para realizar tais procedimentos complexos moleculares biológicos com pouca intervenção humana e as taxas de erro mínimo de 1-5.
Aqui, nós apresentamos um método geral para a purificação da His-tag proteínas recombinantes de um modo de alto rendimento. Num estudo recente, foi aplicado o método de uma investigação detalhada estrutura-função de TFIIB, um componente da maquinaria de transcrição basal. TFIIB é indispensável para o promotor da transcrição dirigida in vitro e é essencial para o recrutamento de polimerase de ARN em um complexo de pré-iniciação 6-8. TFIIB contém um domínio de ligação flexível que penetra na fenda do local activo da polimerase de ARN 9-11. Este domínio ligante confere dois bioquimicamente actividades quantificáveis em TFIIB, a saber, (i) a estimulação da actividade catalítica durante a fase de 'abortivo' de iniciação transcrição, e (ii) uma contribuição adicional para orecrutamento específica da polimerase de RNA para o pré-iniciação complexo 4,5,12. Nós explorada o método de purificação de alto rendimento para gerar substituição única, dupla e tripla e mutações deleções dentro do linker TFIIB e para posteriormente analisá-las em ensaios funcionais para o seu efeito de estimulação sobre a actividade catalítica da RNA polimerase 4. Ao todo, foram geradas, purificados e analisados 381 mutantes - uma tarefa que teria sido demorada e trabalhosa para executar manualmente. Nós produzimos e ensaiadas as proteínas em multiplicates que nos permitiu apreciar quaisquer variações experimentais e nos deu uma idéia clara da reprodutibilidade dos nossos resultados.
Este método serve como um protocolo genérico para a purificação de proteínas marcadas com His-e tem sido utilizado com sucesso para purificar outras proteínas recombinantes. Actualmente, é optimizada para a purificação de proteínas de 24, mas pode ser adaptado para purificar até 96 proteínas.
Protocol
PARTE A: High-throughput crescimento de culturas bacterianas.
1. As bactérias crescem durante a noite, em 2 ml de Meio autoindução Usando placas de 24 poços
- Esterilizar as placas de 24 poços por microondas.
- Inocular 1,5 ml de meio de auto-indução (Medium Overnight Express) com recém-cultivadas colônias de bactérias ou ações de glicerol congelados. Nós normalmente inocular três poços para cada mutante, com três colónias individuais clonados. Reservar seis poços para controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos que crescem em três clones de tipo selvagem e para os controlos negativos que crescem dois clones que foram transformadas com um plasmídeo não expressar. Verificar para esterilização suficiente da placa, deixando uma cavidade em branco para o controlo do meio-only.
- Cultivar as células durante 18 horas a 37 ° C e agitação a 250 rpm. Usamos lac induzível BL21 (DE3) Rosetta 2 células. Meio de auto-indução contém uma mistura de glucose e lactose. A bactéria inicialmentealimentar de glucose e em seguida começar a utilizar a lactose, o qual também induz a expressão das proteínas recombinantes.
- Remover a tampa e colocar a placa na plataforma robótica.
PARTE B: purificação de proteínas recombinantes Robótica.
2. Prepare a plataforma robótica
Tornar-se o tampão de lavagem consistindo em 20 mM de imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glicerol a 10%, e o tampão de eluição constituído de imidazol 0,5 M, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% de glicerol. Estas memórias intermédias será usado para lavar as esferas após as proteínas marcadas foram ligados a eles, ou para eluir as proteínas a partir dos grânulos, respectivamente.
- Tornar-se o diluente bacteriana (100 ml de água destilada, com 15 ul de reagente anti-espuma). Esta solução será usadapara fazer diluições das culturas bacterianas durante a noite para a densidade óptica (A600) medições. A presença de anti-espuma no diluente evita a formação de bolhas de ar que possam interferir com as medições de leitor de placa.
- O volume da solução de lise composta por reagente fastbreak 10x, 2 lysonase ul por cada amostra e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contém uma mistura de detergentes e sais que quebrar as paredes celulares de bactérias e facilitar a liberação de proteínas intracelulares. Lysonase é uma mistura patenteada de lisozima e uma nuclease. Lisozima auxilia na ruptura da parede celular e a nuclease digere os ácidos nucleicos bacterianos libertados.
- Opcional: Faça-se uma solução de cloridrato de 6 M de guanidina. Algumas proteínas recombinantes tendem a ficar com as agulhas com teflon de pipetagem. A guanidina desnatura as proteínas e solução de cloridrato de lava-los de forma mais eficaz do que a água que é rotineiramente usado para lavar as laváveis robóticos dicas de pipetagem após cada ªep.
- Prepare o BCA (ácido bicinconínico) reagente quantificação de proteínas por mistura de solução de ácido bicinconínico (reagente A) e da solução de sulfato de cobre (reagente B): ligações peptídicas reduzir Cu 2 + a partir do CuSO4 componente presente no reagente BCA de Cu em que 1 + a quantidade de Cu + 1 é proporcional ao número de ligações peptídicas presentes na solução. Num segundo passo, duas moléculas de ácido bicinconínico quelato de Cu 1 + resultando numa mudança de absorvância a 562 nm, o que resulta numa cor púrpura. A reação de cor é dependente do tempo e, geralmente, precisa de várias horas para ser definitiva. Depois que a cor é estável durante várias horas.
- Preencha calhas ou placas do tamanho certo e colocá-los em suas posições pré-alocados na plataforma robótica.
- Coloque uma placa de 24 cavidades para os resíduos de cloridrato de guanidina, duas claras placas de 96 cavidades para a OD 600 e medições de absorvância e um azul placa de 96 poços para poe proteínas purificadas sobre as suas posições sobre a plataforma. Coloque uma placa de 96 deepwell no stand magnético.
- Diluir MagneHis Ni-partículas de proteínas que se ligam através da formação de quelatos com os seus His-Tag de 5 vezes em água destilada e enchê-los para a unidade de pérolas em agitação. Desligue o agitador para manter os grânulos em suspensão.
- Ligue a plataforma robótica e lave as agulhas de pipetagem por vários minutos para remover as bolhas de ar que, de outra forma interferir com a precisão de pipetagem. As agulhas reutilizáveis pipetagem são lavadas entre os passos de pipetagem individuais. Alternativamente, pontas descartáveis podem ser utilizados. Todos os passos subsequentes são realizadas roboticamente. O protocolo de robótica está disponível mediante pedido.
3. Crescimento das células é verificada por medição da OD600
- 10 ul da cultura durante a noite dilui-se em 90 ul de uma solução diluente.
- Medir a OD 600 para assegurar que as bactérias cresceram até densidades semelhantes(Figura 1).
4. As células são quebradas para liberar as proteínas e para permitir Bead vinculativo
- 100 ul de suspensão de Ni-esfera magnética é distribuído em cada cavidade de uma placa de 24 cavidades segundo.
- 900 uL de cada cultura em pequena escala bacteriano é transferido para a placa de 24 poços contendo os grânulos. Adicionar 100 ul da mistura fastbreak / lysonase 10x.
- A placa de 24 poços é transferido para a plataforma de agitação para agitação rápida (800 rpm) durante 30 min à temperatura ambiente. As paredes das células bacterianas são interrompidas por uma combinação de forças mecânicas e acção química e as proteínas produzidas de forma recombinante são libertados para a solução. Com tags sua afinidade imediatamente ligar as esferas paramagnéticas de níquel quelantes.
5. As esferas são lavadas
- Os lisados de células contendo-os grânulos em suspensão magnética são transferidos para uma placa de 96 deepwell que é posicionado sobre um suporte com mhastes agnetic que deslizam entre os poços. As placas de 96 cavidades têm uma parte inferior em forma de cone largo, que facilita a remoção do sobrenadante. As cavidades podem conter volumes de até 2,1 ml, mas são preenchidos com volumes muito pequenos. Isto permite-nos realizar vigorosos passos agitação sem amostra de contaminação cruzada por salpicos.
- As pontas das pipetas são lavadas entre cada passos de pipetagem com 6 M de guanidina-HCl. Este passo é crucial para a depuração de TFIIB e outras proteínas "pegajosos", para evitar a contaminação cruzada. Com outras proteínas pode ser suficiente para enxaguar as agulhas extensivamente com água, entre os passos de pipetagem.
- As hastes magnéticas do suporte magnético atrair as esferas paramagnéticas, puxando-os para fora a partir dos centros dos poços e permitir que as agulhas de pipetagem livre acesso ao sobrenadante. O sobrenadante é descartado.
- 500 ul de tampão de lavagem é adicionado à placa de 24 poços e subsequentemente transferido para a placa de 96 poços e paraNsure a transferência completa dos grânulos. A placa de 24 cavidades é removido do agitador.
- Outra ul 500 de tampão de lavagem é adicionado directamente à placa de 96 poços, a placa foi transferida para o agitador e agitado vigorosamente durante 1 minuto. A placa é movida de volta para o suporte magnético e o tampão de lavagem descartada.
- Este passo é repetido mais duas vezes e o procedimento de lavagem é terminada através da remoção de quaisquer vestígios de tampão da placa.
6. Eluir as proteínas em tampão de eluição
- 100 ul de tampão de eluição é adicionado aos grânulos, a placa é movida para o agitador e agitado vigorosamente durante 30 min à temperatura ambiente.
- A placa é movida de volta para o agitador e o eluato contendo a proteína recombinante purificada, é transferida para uma nova placa.
7. Medir as concentrações das proteínas purificadas
- 190 ul de reagente BCA mistura é transferida para uma placa de 96 poços clara e 10 ul da protein solução adicionada.
- Após várias horas de incubação (normalmente 5-6 ou durante a noite), medir a absorvância e compará-lo com os padrões de BSA para determinar as concentrações de cada uma das preparações de proteína purificada (Figura 2).
- As proteínas purificadas podem agora ser usados para aplicações a jusante, nas concentrações apropriadas (Figura 3).
8. Resultados representativos
O protocolo de purificação oferece duas etapas de controlo de qualidade, exemplos dos quais são mostrados. Nós somos capazes de identificar e documentar os potenciais problemas na fase de crescimento bacteriano (Figura 1) e, mais tarde, mediante a avaliação dos rendimentos das proteínas purificadas (Figura 2). Nós normalmente purificar proteínas e testá-los em triplicado. Isto, em combinação com as duas etapas de controlo de qualidade, dá-nos a certeza de que qualquer variação foi observada nos nossos ensaios funcionais devem-se ao mutante phenotype (Figura 3) e não é causada por variações experimentais ou purificações falhadas. Os rendimentos obtidos variam tipicamente 50-200 ug e são mais do que suficientes para vários ensaios funcionais.
Figura 1. Histograma das medições de OD de uma placa de 24 poços com culturas durante a noite. Três clones de seis TFIIB variantes mutantes, assim como do tipo selvagem TFIIB foram cultivadas. Dois clones que transportam um plasmídeo não expressar e um poço com meio apenas servem como controlos negativos. As medições de OD mostram que existem pequenas variações nas taxas de crescimento entre as diferentes culturas.
Figura 2. Rendimentos proteicos obtidos a partir destas culturas, conforme determinado por um ensaio de BCA e confirmada por SDS-PAGE. Uma das variantes não é expresso em níveis elevados. Em comcombinação com a Figura 1, pode-se concluir que esta não era devida ao crescimento celular diferencial, mas, devido à expressão da proteína não ser induzido adequadamente.
Figura 3. Resultado representativo de um ensaio de transcrição. Medimos a actividade de estimulação de variantes TFIIB sobre a produção de pequenas transcritos abortivos por RNAP. Aqui, os efeitos de estimulação de uma biblioteca completa de substituições de um único aminoácido de TFIIB resíduo K87 são mostrados. O elevado grau de reprodutibilidade é confirmada por pequenas taxas de erro. Um gel de exemplo mostrando o desempenho de três mutantes em relação ao tipo selvagem (wt), controlos negativos (NC) e tampão de eluição apenas controla é descrito abaixo.
Discussion
O método de purificação da proteína recombinante automatizado aqui descrito permite a produção e purificação de um grande número de proteínas mutantes em um formato de pequena escala sob condições altamente reprodutíveis com uma intervenção humana mínima. Figuras 1 e 2 mostram os resultados dos controlos de qualidade-sistemáticos e exemplos do proteínas purificadas. Figura 3 mostra que os factores de transcrição purificados usados neste exemplo realizar de uma maneira altamente reprodutíveis em ensaios funcionais.
Mesmo que o processo foi desenvolvido para a purificação de arquea TFIIB, ele é amplamente aplicável para a purificação de proteínas marcadas com afinidade. A utilização de tais protocolos de purificação automatizados, assim, facilitar consideravelmente a análise bioquímica de proteínas recombinantes e, assim, ainda mais a nossa compreensão de interacções proteína-proteína em uma escala que é difícil de conseguir manualmente.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um Projeto Wellcome Grant (078043/Z/05/Z) para ROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
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