Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til affinitets-taggede oprensning af rekombinante proteiner ved hjælp af væske-handling robot. Denne metode er generelt anvendelig for små oprensning af opløselige His-mærkede proteiner i en high-throughput format.
Abstract
Røntgenkrystallografi er den foretrukne metode til opnåelse af en detaljeret afbildning af strukturen af proteiner. Sådanne undersøgelser skal suppleres med yderligere biokemiske analyser for at opnå detaljeret indsigt i struktur / funktion relationer. Fremskridt inden for oligonucleotid-og gensyntese teknologi gør omfattende mutagenese strategier stadig mere realistisk, herunder substitution af målrester med alle 19 andre aminosyrer. Gain-eller tab af funktion fænotyper derefter give systematiske konklusioner, såsom bidrag især rester til katalytisk aktivitet, protein stabilitet og / eller protein-protein interaktion specificitet.
For at tillægge de forskellige fænotyper til arten af mutationen - i stedet for svingende forsøgsbetingelser - det er nødvendigt at oprense og analysere proteinerne på kontrolleret og reproducerbar måde. High-throughput strategier og automatisering af manuelle protokoller pårobot væske-handling platforme har skabt muligheder for at udføre sådanne komplekse molekylærbiologiske procedurer med lidt menneskelig indgriben og minimale fejlprocenter 1-5.
Her præsenteres en generel fremgangsmåde til oprensning af His-mærkede rekombinante proteiner i en high-throughput måde. I en nylig undersøgelse, anvendte vi denne metode til en detaljeret struktur-funktion undersøgelse af TFIIB, en del af den basale transkription maskiner. TFIIB er uundværlig for promotor-rettet transkription in vitro og er afgørende for rekruttering af RNA-polymerase i en preinitiation kompleks 6-8. TFIIB indeholder en fleksibel linker domæne, der gennemtrænger det aktive sted kløft RNA-polymerase 9-11. Denne linker domæne giver to biokemisk kvantificerbare aktiviteter på TFIIB, nemlig (i) stimulering af den katalytiske aktivitet under 'mislykkede' etape af udskrift indvielse, og (ii) et supplerende bidrag tilspecifik rekruttering af RNA-polymerase til preinitiation komplekse 4,5,12. Vi udnyttede high-throughput rensningsmetode at generere enkelt, dobbelt og tredobbelt substitution og deletioner mutationer i TFIIB linker og derefter analysere dem med funktionelle assays for deres stimulerende virkning på den katalytiske aktivitet af RNA-polymerase 4. Samlet set genererede vi, oprenset og analyseret 381 mutanter - en opgave, som ville have været tidskrævende og besværlig at udføre manuelt. Vi producerede og analyseret proteinerne i multiplicates som tilladt os at sætte pris på eventuelle eksperimentelle variationer og gav os en klar idé om reproducerbarheden af vores resultater.
Denne metode tjener som et generisk protokol til oprensning af His-mærkede proteiner, og er med succes blevet anvendt til at oprense andre rekombinante proteiner. Det er i øjeblikket optimeret til oprensning af 24 proteiner, men kan tilpasses til at rense op til 96 proteiner.
Protocol
DEL A: High-throughput vækst af bakteriekulturer.
1. Vokse bakterier natten over i 2 ml autoinduktion medium ved anvendelse af plader med 24 brønde
- Steriliseres de 24-brøndsplader ved mikrobølgebehandling.
- Inokulér 1,5 ml autoinduktion medium (Overnight Express Medium) med frisk dyrkede bakteriekolonier eller frosne glycerol bestande. Vi normalt inokulere tre brønde pr mutant med tre individuelle klonede kolonier. Reserve seks brønde for positive og negative kontroller. For de positive kontroller vi vokser op tre vildtype-kloner og for de negative kontroller vi vokser op 2 kloner, som er blevet transformeret med en ikke-udtrykkende plasmid. Check for tilstrækkelig sterilisation af pladen ved at forlade et godt emne til mellemlang kun kontrol.
- Dyrke cellerne i 18 timer ved 37 ° C og omrystning ved 250 rpm. Vi anvender lac-inducerbar BL21 (DE3) Rosetta 2-celler. Autoinduktion medium indeholder en blanding af glucose og lactose. Bakterierne første omganglever af glucose og så begynde at anvende lactose, som inducerer også ekspressionen af de rekombinante proteiner.
- Fjern låget og placer pladen på robot platform.
DEL B: Robotic oprensning af rekombinante proteiner.
2. Forbered Robotic Platform
Der fyldes op til vaskepuffer bestående af 20 mM imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol og elueringspuffer bestående 0,5 M imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetat, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol. Disse buffere vil blive anvendt til at vaske perlerne efter de mærkede proteiner er blevet bundet til dem, eller for at eluere proteinerne fra perlerne hhv.
- Udgør den bakterielle fortyndingsmiddel (100 ml destilleret vand med 15 ul antiskumningsmiddel reagens). Denne løsning vil blive brugtat fortyndinger af de bakterielle overnatskulturer for optisk densitet (A600) målinger. Tilstedeværelsen af antiskummiddel i fortyndingsmidlet forhindrer dannelsen af luftbobler, som vil kunne gribe ind pladelæser målinger.
- Der fyldes op til lyseopløsningen bestående af 10x Fastbreak reagens, 2 pi lysonase per prøve og 15 mM MgOAc 2. Fastbreak indeholder en blanding af detergenter og salte, der bryder de bakterielle cellevægge og lette frigivelsen af intracellulære proteiner. Lysonase er en navnebeskyttet blanding af lysozym og en nuklease. Lysozym hjælper med at forstyrre cellevæggen og nukleasen fordøjer de frigivne bakterielle nukleinsyrer.
- Valgfrit: Lav en 6 M guanidinhydrochlorid løsning. Nogle rekombinante proteiner har en tendens til at holde sig til de Teflon-belagte pipetteringstrin nåle. De guanidinhydrochlorid opløsning denaturerer protein og vasker dem ud mere effektivt end vand, som rutinemæssigt anvendes til at skylle det vaskbare robot pipetteringstrin tip efter hver mep.
- Forbered BCA (bicinchoninsyre) protein kvantificering reagens ved at blande bicinchoninsyre opløsning (reagens A) og kobbersulfatopløsning (reagens B): peptidbindinger reducerer Cu2 + fra CuSO4 komponent til stede i BCA reagens til Cu 1 + hvorved mængden af Cu 1 + er proportional med antallet af peptidbindinger til stede i opløsningen. I et andet trin, + to molekyler af bicinchoninsyre chelat Cu 1, hvilket resulterede i en absorbans skift til 562 nm, hvilket resulterer i en lilla farve. Farven reaktion er tidsafhængig og skal normalt flere timer til at være definitive. Efter at farve er stabil i flere timer.
- Fyld trug eller plader i den rigtige størrelse og placere dem i deres præ-tildelte positioner på robot platform.
- Sted en 24-brønds plade til guanidinhydrochlorid affald, to klare plader med 96 brønde for OD600 og absorbansmålinger og en blå 96-brønds plade til the oprensede proteiner på deres holdninger på platformen. Placer en 96-Deepwell plade på den magnetiske fod.
- Fortynd MagneHis Ni-partikler, der binder proteiner ved at danne chelater med deres His-tags 5 gange i destilleret vand og fyld dem i vulsten-omrøring enhed. Tænd omrøreren på at holde perlerne i suspension.
- Tænd for robot platform og skylles pipetteringstrin nåle i flere minutter for at fjerne luftbobler, som ellers ville interferere med den pipettering nøjagtighed. De genbrugelige pipettering nåle er skyllet i mellem de enkelte pipetteringstrin. Alternativt kan engangsspidser anvendes. Alle efterfølgende trin udføres robot. Den robot-protokollen er tilgængelig på anmodning.
3. Cellevækst kontrolleres ved at måle OD600
- 10 ul overnatskultur fortyndes i 90 pi af fortyndingsmiddelopløsning.
- Måle OD600 at sikre, at bakterierne er vokset til ens vægtfylder(Fig. 1).
4. De Celler er brudt op for at frigøre proteiner, og til Tillad Bead-bindende
- 100 ul magnetiske Ni-perlesuspension fordeles i hver brønd af en anden 24-brønds plade.
- 900 pi af hver mindre bakteriekultur overført til 24-brønds plade, der indeholder perlerne. Der tilsættes 100 ul af 10x Fastbreak / lysonase mix.
- Den 24-brønds plade overføres til rystebord for hurtig omrystning (800 rpm) i 30 minutter ved stuetemperatur. Bakteriecellevægge er forstyrret af en kombination af mekaniske kræfter og kemisk påvirkning og rekombinant producerede proteiner, der frigives i opløsning. Med deres affinitetsmærker de straks binder de paramagnetiske chelaterende nikkel perler.
5. Perlerne vaskes
- Den celle-lysater indeholdende de resuspenderede magnetiske perler overføres til en 96-Deepwell plade, som er placeret på et stativ med magnetic stænger, som glider mellem brøndene. De plader med 96 brønde har fået en kvadratisk kegleformet bund, som tillader lettere fjernelse af supernatanten. Brøndene kan rumme mængder op til 2,1 ml, men er fyldt med langt mindre mængder. Det giver os mulighed for at udføre kraftig rystning trin uden prøve krydskontaminering ved sprøjt.
- Pipettespidserne vaskes mellem individuelle pipetteringstrin med 6 M guanidin-HCI. Dette trin er afgørende for oprensning af TFIIB og andre "sticky" proteiner for at undgå krydskontaminering. Med andre proteiner kan det være tilstrækkeligt at skylle nålene omfattende med vand mellem pipetteringstrin.
- De magnetiske stænger af det magnetiske stativ tiltrække de paramagnetiske kugler, trække dem væk fra centrum af brøndene og lade pipetteringstrin nåle fri adgang til supernatanten. Den ovenstående væske kasseres.
- 500 pi vaskepuffer først sættes til 24-brønds plade og derefter overført til 96-brønds plade til ensure den fuldstændige overførsel af perlerne. Den 24-brønds plade fjernes fra rysteapparatet.
- En anden 500 pi vaskepuffer tilsættes direkte til plade med 96 brønde, pladen overføres til rysteapparatet og rystes kraftigt i 1 min. Pladen bevæges tilbage til den magnetiske stativ og vaskepufferen kasseres.
- Dette trin gentages to gange, og vaskeproceduren er afsluttet ved at fjerne eventuelle buffer rester fra pladen.
6. Eluering af proteinerne i elueringsbuffer
- 100 ul elueringspuffer sættes til perlerne, er pladen bevæges til rysteapparatet og rystes kraftigt i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Pladen bevæges tilbage til rysteapparatet og eluatet, som indeholder oprenset rekombinant protein, overføres til en ny plade.
7. Bestemmelse af koncentrationen af de oprensede proteiner
- 190 pi af BCA-reagens blanding overføres til en klar plade med 96 brønde, og 10 pi af protein opløsning tilsat.
- Efter flere timers inkubation (typisk 5-6 eller natten over), måles absorbansen og sammenligne det med BSA-standarder for at bestemme koncentrationerne af hver af de oprensede proteinpræparater (figur 2).
- De rensede proteiner kan nu anvendes til efterfølgende anvendelser på de relevante koncentrationer (figur 3).
8. Repræsentative resultater
Oprensningsprotokollen tilbyder to kvalitetskontrol faser, hvorpå eksempler er vist. Vi er i stand til at identificere og dokumentere potentielle problemer på bakterievækst fase (fig. 1) og senere ved vurdering af indholdet af de oprensede proteiner (figur 2). Vi typisk oprense proteiner og teste dem i tre eksemplarer. Dette i kombination med de to kvalitetskontrol trin, giver os tillid til, at enhver variation vi observeret i vore funktionelle assays skyldes mutant phenotype (fig. 3) og ikke forårsaget af eksperimentelle variationer eller ikke oprensninger. Udbytterne opnået typisk i området fra 50 til 200 ug, og er mere end tilstrækkelige til forskellige funktionelle assays.
Figur 1. Histogram af OD målinger af en 24-brønds plade med overnatskulturer. Tre kloner af seks TFIIB mutantvarianter samt af vild-type TFIIB er blevet dyrket. To kloner, der bærer en ikke-udtrykkende plasmid og en brønd med medium alene tjener som negative kontroller. OD-målinger viser, at der er små variationer i vækstraterne mellem de enkelte kulturer.
Figur 2. Proteinudbytter opnået fra disse kulturer som bestemt ved et BCA-analyse og bekræftet ved SDS-PAGE. En af varianterne ikke udtrykkes i høje niveauer. I comkombination med figur 1, kan man konkludere, at dette ikke skyldtes forskellen cellevækst men på grund af protein-ekspression ikke er induceret korrekt.
Figur 3. Repræsentativt resultat af transskription assay. Vi målte stimulering aktivitet af TFIIB varianter på produktionen af små abortive transskripter af RNAP. Her er de stimulering virkningerne af en komplet bibliotek af enkelte aminosyresubstitutioner i TFIIB rest K87 vist. Den høje grad af reproducerbarhed bekræftes af små fejlrater. En prøve gel, der viser resultaterne af tre mutanter i sammenligning med vildtype (wt), negative kontroller (NC) og elueringspuffer kun kontrollerer er vist nedenunder.
Discussion
Den automatiserede rekombinante proteinoprensning her beskrevne fremgangsmåde muliggør fremstilling og oprensning af et stort antal mutante proteiner i et mindre format under stærkt reproducerbare betingelser med minimal menneskelig indgriben. Figur 1 og 2 viser resultaterne af systematiske kvalitets-kontroller og eksempler på den oprensede proteiner. Figur 3 viser, at de oprensede transkriptionsfaktorer anvendt i dette eksempel udføres på en meget reproducerbar måde i funktionelle assays.
Selv om fremgangsmåden blev udviklet til rensning af archaeal TFIIB, er bredt anvendelig til oprensning af affinitets-mærkede proteiner. Anvendelsen af sådanne automatiserede oprensningsprotokoller vil således i væsentlig grad lette biokemisk analyse af rekombinante proteiner og vil således fremme vores forståelse af protein-protein interaktioner i et omfang, der er vanskelig at opnå manuelt.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) til ROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. Revealing the Function of TFIIB. Transcription. , Forthcoming (2011).
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
