Summary
我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。
Abstract
X線結晶構造解析は、タンパク質の構造の詳細なビューを得るための最適な方法である。このような研究は、構造/機能の関係を詳細に洞察力を得るために、さらに生化学的解析によって補完される必要があります。オリゴヌクレオチド及び遺伝子合成技術の進歩により、全19の他のアミノ酸による標的残基の置換を含む、大規模な突然変異誘発戦略がますます実現可能にする。ゲインまたは機能喪失型の表現型は、そのような触媒活性、タンパク質の安定性および/または蛋白質 - 蛋白質相互作用の特異性への特定の残基の寄与として、体系的な結論を引き出すことができます。
突然変異の性質に異なる表現型を属性にするために - ではなく変動する実験条件に - それは、制御された再現可能な方法でタンパク質を精製し、分析することが不可欠である。高スループットの戦略やマニュアルのプロトコルの自動化にロボット液体処理プラットフォームは、少し人間の介入と最小限のエラー率1-5から 、このような複雑な分子生物学的な手順を実行する機会を作成しました。
ここでは、ハイスループットな方法でHisタグ組換えタンパク質の精製のための一般的な方法を提示する。最近の研究では、TFIIBの詳細な構造と機能の研究、基礎転写機構のコンポーネントにこの手法を適用した。 TFIIB は 、in vitro でプロモーター特異的転写のために不可欠であり、前開始複合体6から8へのRNAポリメラーゼの募集のために不可欠なものです。 TFIIBはRNAポリメラーゼ9-11の裂け目活性部位を貫通フレキシブルリンカードメインが含まれています。このリンカードメインはTFIIB、すなわち（i）転写開始の "失敗に終わった"段階での触媒活性の刺激に2生化学的に定量化できる活動を与える、および（ii）の追加拠出前開始複合体4,5,12にRNAポリメラーゼの特異的動員。我々はTFIIBリンカー内シングル、ダブル、トリプルの置換や削除突然変異を生成し、その後RNAポリメラーゼ4の触媒活性に及ぼす刺激効果のための機能的アッセイにおいて、それらを分析するために、ハイスループット精製法を利用した。要するに、我々は、精製し、381変異体を解析し、生成された - 時間がかかり、手動で実行することが面倒だっただろう作業を行います。我々は、生産され、私たちはどんな実験的な変形を理解させ、私たちの結果の再現性の明確な考えを与えたmultiplicates中のタンパク質を測定した。
この方法では、Hisタグ融合タンパク質の精製のための一般的なプロトコルとして機能し、首尾よく他の組換えタンパク質を精製するために使用されています。それは現在、24のタンパク質の精製のために最適化されていますが、最大96個のタンパク質に精製するために適合させることができます。
Protocol
パートA：細菌培養物のハイスループット成長。
1。 24ウェルプレートを用いた自己誘導培地2mlで一晩細菌を培養
- マイクロ波で24ウェルプレートを滅菌する。
- 新たに増殖させた細菌コロニーまたは冷凍グリセロールストックと自己誘導培地（オーバーナイトエクスプレス媒体）の1.5ミリリットルを接種する。我々は通常、3つの個々のクローン化されたコロニーで変異につき3ウェルに接種。陽性および陰性対照引当金6ウェル。我々は3つの野生型クローンが育つポジティブコントロールのため、我々は非発現プラスミドで形質転換された2つのクローンを育てるネガティブコントロール用。培地のみの対照のためのよく空白の1を残すことによって、プレートの十分な殺菌を確認してください。
- ℃、250 rpmで振盪しながら37℃で18時間細胞を成長させる。我々は、lac誘導BL21（DE3）のロゼッタ2細胞を使用しています。自己誘導培地は、グルコースとラクトースの混合物を含んでいます。当初は細菌ブドウ糖を餌にしてから、また、組換えタンパク質の発現を誘導する乳糖を使用し始める。
- 蓋を外し、ロボットプラットフォームの上にプレートを置きます。
パートB：組換えタンパク質の精製ロボット。
2。ロボットプラットフォームを準備
20 mMイミダゾール、0.1％トリトンX-100、0.5M NaCl、20mMのTris-酢酸、pHは7.9、10mMのMgOAc 2、0.7 mMのZnOAc 2、10％グリセロール、および構成された溶出緩衝液からなる洗浄緩衝液を作る0.5Mのイミダゾール、0.1％トリトンX-100、0.5M NaCl、20mMのTris-酢酸、pHは7.9、10mMのMgOAc 2、0.7 mMのZnOAc 2、10％グリセロール。これらのバッファは、タグ付けされたタンパク質は、それらに結合された後、ビーズを洗浄したり、それぞれ、ビーズからタンパク質を溶出するために使用されます。
- 細菌の希釈液（15μlの消泡剤と100mlの蒸留水）を作る。この溶液は、使用されます光学密度（A600）測定のための細菌の一晩培養物の希釈液を作る。希釈剤中に消泡剤の存在は、プレートリーダーの測定を妨害する気泡の形成を防止する。
- 10xのファーストブレイク試薬、サンプルあたり2μlのlysonaseおよび15mM MgOAc 2からなる溶解液を作ります。ファーストブレイクは、細菌の細胞壁を破壊し、細胞内タンパク質の放出を容易にする洗剤と塩の混合物を含んでいます。 Lysonaseはリゾチームとヌクレアーゼの独自のミックスです。リゾチームは、細胞壁を破壊することを支援し、ヌクレアーゼがリリースされました細菌の核酸を消化。
- オプション：6 Mグアニジン塩酸塩溶液を構成してください。いくつかの組換えタンパク質は、テフロンコーティングペッティング針に固執する傾向がある。グアニジン塩酸塩溶液が変性タンパク質と日常的にそれぞれのST後に洗えるロボットピペットチップをすすぐために使用される水よりも効果的にそれらをオフに洗うEP。
- ペプチド結合は+ BCA試薬中に存在CuSO 4のコンポーネントからCu 1にCu 2を軽減+それによって：ミキシングビシンコニン酸溶液（試薬）と硫酸銅溶液（試薬B）によってBCA（ビシンコニン酸）タンパク質定量試薬を調製Cuの1の量+は溶液中に存在するペプチド結合の数に比例します。第二段階では、ビシンコニン酸キレート銅1の2つの分子は+紫の色で、その結果、562 nmの吸光度のシフトが生じる。呈色反応は、時間に依存しており、通常は決定的であるといくつかの時間を必要とします。その後色は数時間安定です。
- 正しいサイズのトラフまたはプレートを記入し、ロボットのプラットフォーム上で、事前に割り当てられた位置に配置します。
- グアニジン塩酸塩の廃棄のための場所1 24ウェルプレート、OD 600及び吸光度測定のための2つの明確な96ウェルプレートと1番目の青の96ウェルプレート電子プラットフォーム上で自分の位置でタンパク質を精製した。マグネットスタンドの上に置いて1 96ディープウェルプレート。
- 蒸留水で5倍に彼らのHis-タグとキレートおよびビーズ攪拌部にそれらを埋めるを形成することにより、タンパク質を結合MagneHisニッケル粒子を希釈します。懸濁液中にビーズを保つためにスターラーを切り替えます。
- ロボットプラットフォームの電源を入れて、そうでなければペッティング精度を妨害する気泡を除去するために数分間ピペッティング針をフラッシュします。再利用可能なピペッティング針は個々のピペッティング·ステップの間にフラッシュされます。あるいは、使い捨てチップを使用することができる。全ての後続ステップは、ロボットにより行われている。ロボットのプロトコルは、リクエストに応じて利用可能です。
3。細胞増殖がOD600を測定することによってチェックされる
- 一晩培養した培養液10μlの希釈液の90μlに希釈される。
- 細菌が同様の密度に成長していることを確認するために、OD 600を測定（ 図1）。
4。細胞はタンパク質を放出するとビーズの結合を許可するために分割され
- 磁気のNi-ビーズ懸濁液100μlを2番目の24ウェルプレートの各ウェルに分配される。
- 各小規模な細菌培養900μlのビーズを含む24ウェルプレートに移しています。 10xのファーストブレイク/ lysonaseミックスの100μlを添加する。
- 24ウェルプレートを室温で30分間急速振とう（800 rpm）で振とうプラットフォームに転送されます。細菌の細胞壁は、機械的な力と化学作用の組み合わせによって破壊されており、組換えにより産生されたタンパク質は溶液中に放出されています。それらの親和性タグを使用して、彼らはすぐに常磁性キレートニッケルビーズをバインドします。
5。ビーズを洗浄し
- 再懸濁した磁性ビーズを含有する細胞溶解物はmで、スタンド上に配置され、96ディープウェルプレートに転送されますagneticロッドウェル間でそのスライド。 96ウェルプレートの上清容易に取り外すことができます正方形円錐形の底部を持っている。井戸は2.1ミリリットルまでのボリュームを保持することができますが、はるかに少量で満たされている。これは飛散して、サンプルのクロスコンタミせず精力的な揺れの手順を実行することを可能にする。
- ピペットチップを6Mグアニジン-HClで個々のピペット操作の間に洗浄される。このステップでは、交差汚染を回避するためTFIIBと他の "スティッキー"タンパク質の精製のために重要です。他のタンパク質と、それはピペット操作の間に水で広範囲に針をリンスするのに十分かもしれません。
- マグネットスタンドの磁気ロッドは、常磁性ビーズを引き付ける井戸の中心からそれらを引き離し、ピペッティング針の上清への無料アクセスを許可します。上清は廃棄されます。
- 洗浄緩衝液500μlの最初の24ウェルプレートに添加し、続いてeに96ウェルプレートに移し、ビーズの完全移転をnsure。 24ウェルプレートをシェーカーから削除されます。
- 洗浄緩衝液の別の500μlを96ウェルプレートに直接追加され、プレートをシェーカーに移し、精力的に1分間振とうする。プレートは磁気スタンドに戻って移動し、洗浄緩衝液は廃棄されます。
- このステップは2回繰り返されており、洗浄手順をプレートから任意のバッファ残骸を除去することによって完了します。
6。溶出バッファー中でタンパク質を溶出
- 溶出緩衝液100μlをビーズに添加され、プレートをシェーカーに移し、精力的に室温で30分間振とうする。
- プレートが精製された組換えタンパク質を含む、シェーカー、溶出液に戻され、新しいプレートに移しています。
7。精製したタンパク質の濃度を測定
- BCA試薬ミックスの190μlを明確に96ウェルプレートに移し、プロの10μlさTEIN溶液を添加した。
- インキュベーション（通常は5月6日または一晩）の数時間後、吸光度を測定し、精製されたタンパク質製剤（図2）のそれぞれの濃度を決定するためにBSAの基準と比較します。
- 精製されたタンパク質は、現在適切な濃度（図3）下流のアプリケーションに使用することができます。
8。代表的な結果
精製プロトコルは、2つの品質管理段階に示されており、それらの例を提供しています。我々は、精製されたタンパク質の収率（ 図2）を評価する際に細菌の成長段階（ 図1）およびそれ以降の潜在的な問題を識別して文書化することができます。我々は通常、タンパク質を精製し、三重にしてテストします。これは、2つの品質制御ステップと組み合わせることで、私たちは私たちの機能的アッセイで観察された任意のバリエーションが変異phenotypによるものであることを自信を与える実験的な変動したか失敗した精製によって引き起こされる電子（ 図3）としない。収量は一般的に50から200μgの範囲を取得しており、様々な機能アッセイのために十分以上です。
図1。一晩培養した培養物を24ウェルプレートのOD測定値のヒストグラム。同様に野生TFIIBのように6 TFIIB突然変異体の3つのクローンが栽培されている。媒体と非発現プラスミドと井戸を運ぶ2つのクローンが唯一ネガティブコントロールとして機能します。 OD測定は、個々の文化の間で成長率のわずかな変動があることを示している。
図2。タンパク質収量は、BCAアッセイによって決定されるように、これらの培養物から得られ、SDS PAGEにより確認した。亜種の一つが高レベルで発現されていません。 comの図1とbinationは、我々は、これが差分細胞増殖に起因するが、適切に誘導されていないタンパク質の発現によるものではなかったと結論付けることができます。
図3。転写アッセイの代表的な結果 。我々はRNAPによる小頓挫転写産物の生産にTFIIBの変異体の刺激活性を測定した。ここでは、TFIIB残基K87の単一のアミノ酸置換の完全なライブラリの刺激効果が示されています。再現性の高い度合いが小さいエラー率によって確認された。野生型（WT）、ネガティブコントロール（NC）と溶出バッファーに比べて3変異体の性能を示すサンプルゲルが唯一コントロールが下に描かれている。
Discussion
自動化された組換えタンパク質の精製方法は、ここで説明する最低限の人間の介入と再現性の高い条件下での小規模な形式で変異多数のタンパク質の産生および精製を可能にします。体系的な品質コントロールとの例を図1および図2の結果は、タンパク質を精製した。 図は、この例で使用される精製された転写因子が機能アッセイに再現性の高い方法で実行することを図3に示す。
手順は古TFIIBの精製のために開発されたにもかかわらず、それは親和性タグ融合タンパク質の精製のための広く適用することができる。このような自動化された精製プロトコルの使用は、大幅に組換えタンパク質の生化学的解析を容易にするでしょう、したがって、手動で達成することは困難であるスケールでのタンパク質 - タンパク質相互作用の理解を促進します。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品はROJWにウェルカムプロジェクト無償（078043/Z/05/Z）によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
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