Summary
En effektiv metod för framställning av Nanofiber dekorerade med funktionella grupper med förmåga att specifikt interagera med proteiner beskrivs. Den strategi kräver först framställningen av en polymer funktionaliserad med den lämpliga funktionella gruppen. Den funktionella polymeren tillverkas i Nanofiber genom electrospinning. Effektiviteten av bindningen av Nanofiber med ett protein studeras genom konfokal mikroskopi.
Abstract
Electrospinning är en effektiv behandling metod för framställning av Nanofiber dekorerade med funktionella grupper. Nanofiber dekorerade med funktionella grupper kan användas för att studera material-biomarkör interaktioner, dvs fungerar som biosensorer med potential som enda molekyl detektorer. Vi har utvecklat en effektiv metod för att förbereda funktionella polymerer där funktionaliteten har kapacitet att binda specifikt med en modell protein. I vårt modellsystem, är den funktionella gruppen 2,4-dinitrofenyl (DNP) och proteinet är anti-DNP-IgE (Immunoglobulin E). Den funktionella polymeren, α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl kapron] [poly (etylenoxid)-b-poly (2-metoxistyren)-b-poly (etylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), framställes genom anjonisk levande polymerisation. Den difunktionella initiatorn användes i polymerisationen framställdes genom elektronöverföring reaktion av α-metylstyren och kalium (spegel) metall. Den 2-metoxistyren monomeren tillsattesförst initiatorn, följt av tillsats av den andra monomeren, etylenoxid, och slutligen den levande polymeren avslutades med metanol. Den α, ω-dihydroxi polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] omsattes med N-2 ,4-DNP-∈-aminokapronsyra, genom DCC-koppling, vilket resulterar i bildningen av α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poly (etylenoxid)-b-poly (2-metoxistyren)-b-poly (etylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polymererna karakteriserades genom FT-IR, 1 H-NMR och gelpermeationskromatografi (GPC). Molekylviktsfördelningarna hos polymererna var smala (1,1-1,2) och polymerer med molekylvikter större än 50.000 användes i denna studie. Polymererna var gula pulver och lösliga i tetrahydrofuran. Ett vattenlösligt CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene glykol) komplexet binder och uppnår steady state bindning med lösning IgE inom några sekunder. Högre molekylvikt (vatten olöslig dvs ca 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymerer, innehållande 1% enstaka nanorör vägg kol (SWCNT) bearbetades till elektroaktiva Nanofiber (100 nm till 500 nm i diameter) på kiselsubstrat. Fluorescensspektroskopi visar att anti-DNP-IgE interagerar med de Nanofiber genom bindning med DNP funktionella grupperna dekorera fibrerna. Dessa observationer tyder på att på lämpligt sätt funktionaliserade Nanofiber hålla löftet för att utveckla enhetens biomarkör upptäckt.
Protocol
1. Syntes av α, ω-dihydroxi Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- Montera polymerisationsreaktor såsom visas i figur 1. Reaktorn för detta experiment består av en 100 ml rundbottnad 2-halsad kolv med en vanlig konisk yttre leden (Chemglass), två flöden adaptrar kontroll med kranar (Chemglass), och en Teflon omrörarstav. Adapter A (figur 1) användes för att hålla ultrahög renhet (UHP) Kvävgas som strömmar genom systemet för att förhindra att luft och fukt kommer in i inerta systemet. Adapter B (figur 1) användes för att injicera lösningsmedlet, monomer och initiator i reaktionskolven.
- Torka 200 ml tetrahydrofuran (THF) över Na-metall, med bensofenon som indikator, under minst 6 timmar under torr kvävgas.
- Torka 10 ml 2-metoxistyren över kalciumhydrid under 24 timmar.
- Förbered en kall temperatur hölls vid -78 ° C med användning av en uppslamning av en isopropanolnd flytande kväve.
- Tillsätt 25 ml THF till polymerisationsreaktionen kolven (se figur 1) under kvävgas och hålla reaktorn under kvävgas under hela polymerisationen.
- Placera 100 ml rundbottnad kolv i uppslamning.
- Tillsätt 2 ml (0,27 mmol / ml) av initiatorlösningen i reaktionskolven.
- Injicera den första monomeren, 2-metoxistyren (4 ml) i reaktionskolven.
- Låt reaktionen fortsätta i 40 minuter.
- Tillsätt 1 ml av den andra monomeren, etylenoxid.
- Låt polymerisationen fortsätta vid rumstemperatur under två dagar.
- Avsluta polymeren med HCl (6 M) / metanol (1/20, vol / vol).
- Rena polymeren genom utfällning i hexaner och torr polymer i en vakuumugn.
- Karakterisera polymeren med NMR.
2. Funktionalisering av α, ω-dihydroxi polymer med N-2 ,4-DNP-Ε-aminokapronsyra Skaffa den funktionella PolymER, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- I en trehalsad kolv, placera α, ω-dihydroxi polymeren (0,05 mmol), N-2 ,4-DNP-E-aminokapronsyra (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) och DMAP (0,005 mmol) och torka på vakuumledningen under 4 timmar.
- Destillera torr diklormetan (10 ml) till kolven.
- Frigör vakuumet under kväve och rör reaktionsblandningen under 12 timmar vid rumstemperatur.
- Filtrera reaktionsblandningen och återvinna polymeren genom utfällning två gånger i hexaner och metanol.
- Torr utfällda polymeren i en vakuumugn vid 40 ° C.
- Bestäm polymerens struktur och funktionalitet genom FT-IR och 1 H-NMR.
3. Beredning av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT lösning för elektrospinning
- Lös 20 vikt% av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP i klorbensen.
- Lös 20 vikt% och 40 vikt% av polystyren (MW 800.000) i klorbensen att förbereda två lösningar. Den högre molekylära polystyren används till att ökae polymerkedja-kedjeintrassling och få optimal viskositet som krävs för electrospinning.
- Blanda polymerlösningar framställdes i 3,1 och 3,2 för att bilda 1:1 och 1:2 förhållanden av polymererna och tillsätt 1 w% Single kolnanorör (SWCNT) till blandningen och rör om över natten för jämn fördelning av cnts.
4. Elektrospinning av polymer-CNT komposit
- Montera electrospinning inrättas som visas i figur 2. På högra sidan av figuren är Glassman högspänningskällan. Bredvid det är en retort ställning som kiselskivan bifogas. Till vänster är en annan retort stå på vilken sprutan är monterad och bakom är lampan för att visualisera förfarandet som det fortskrider.
- Med hjälp av en injektionsspruta, dra en liten mängd av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT blandningen (ca 1 ml) och montera injektionssprutan på retorten stativet.
- En kiselskiva är Mounted över från sprutan säkert på ett avstånd av 10 cm, och jordklämman av högspänningskällan är ansluten till den.
- Fäst klämman bär höga spänningen som skall appliceras på nålen på sprutan, tryck kolven lite (att upphäva en droppe på nålspetsen) och vid denna punkt, är electrospinning klar.
- Sätt på högspänningskällan och justera spänning mätaren till 10 kV. Beroende på naturen av polymererna i kompositen, kan högre spänningar krävas, särskilt om Nanofiber under hundra nanometer i diameter önskas.
- Avmontera kiselskiva och placera i en exsickator över natten för att torka helt.
5. Karakterisering av Nanofiber
- Inledande avbildning av Nanofiber sker med optiskt mikroskop för att observera helhetsperspektiv av fibrerna.
- Utnyttja Svepelektronmikroskop att observera finare detaljer som morfologi, diameter, genomsnittlig porstorlek, etc.
- Carryut ytterligare avbildning med ett atomkraftsmikroskop att observera 3-D-topografi av fibrer, etc.
6. Bindningsspecificiteten för Nanofiber med anti-DNP IgE protein
- Bered en lösning av 4 ug / l. fluorescensmärkt, FITC-IgE (fluorescein Isothio-cyanat-Immunoglobulin E) i PBS-BSA (fosfatbuffrad saltlösning-bovint serumalbumin) lösning.
- Placera en liten bit av kiselskiva där det finns Nanofiber på en Mattek väl täckglas. Inkubera Nanofiber i denna lösning under en timme. Inkubering sker genom att försiktigt pipettera ut, 10 ul IgE lösningen på kiselskivan.
- Efter inkubation, avlägsna obundet IgE genom tvättning provet tre gånger med PBS-BSA-buffert-lösning. PBS-lösningen dispenseras försiktigt på vägg Mattek skålen, för att undvika att spruta bufferten direkt på Nanofiber. Snurra skålen försiktigt för hand, för att fördela buffertlösning på Nanofiber. Ta försiktigt bort buffert med en pipett och återtorv detta två gånger.
- För kontroll, inkubera Nanofiber i fluorescensmärkta IgG (icke-specifik för DNP) under samma betingelser.
- Visualisera de bundna fibrer med ett konfokalmikroskop att observera bindning med IgE. För vår studie var mikroskop används Leica konfokala TCS SP2 med 63x objektiv.
7. Ström-spänning Beteende Nanofiber
- Anslut två mikro lägesställare till en mycket låg ström källa som Keithley 6430 känsliga SourceMeter. Den inrättas för att bestämma den aktuella spänningen uppförande visas i figur 3. Denna figur visar Probe stationen används för att bestämma de initiala IV egenskaper Nanofiber. Den består av Bausch & Lomb MicroZoom Mikroskop, en vakuumchuck scenen och fyra Micropositioners används sondering. Längst upp till höger är Agilent 34405A Digital multimeter används vid mätning av spänning och under det är Keithley 6430 Sub-Femtoamp avlägsen källa Meter används för att anskaffa låga strömmar som var indata in i fibrerna.
- Montera sonden armar mikro positionerare över fibermattan på motsatta sidor med spetsarna vidrör fibrerna.
- Anslut ytterligare två mikro lägesställare till en digital multimeter, montera sonden armarna i-mellan de andra två och landa tips om fibermattan. Se till att de fyra tips är så linje som möjligt.
- Ingång varierande mängder av ström från Keithley (typiskt inom intervallet nanoamps).
- Mät spänningsfallet över de yttre spetsarna, för varje storlek anskaffas ström.
- Plottning dessa värden indikerar vilken typ av enhet fibermattan fungerar som.
8. Representativa resultat
Funktionell polymer
"> Metoden för syntes av α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl kapron] [poly (etylenoxid)-b-poly (2-metoxistyren)-b-poly (etylenoxid)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) visas i figur 4. bekräftades genom FT-IR (fig. 5) och 500 MHz 1 H-NMR-spektroskopi (figur 6) 1 struktur funktionella polymeren. FT-IR visar det fullständiga försvinnandet av -OH bred absorption cirka 3.500 cm -1 visar kvantitativ funktionalisering med CDNP gruppen. Detta bekräftas också av NMR-spektrum som visas i figur 6. Användning integrationen av topparna i NMR-spektrumet bestämdes att CDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNP polymerer kvantitativt funktionaliserade.Nanofiber
I figur 7, är en matta av ledande Nanofiber erhållna genom electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT från klorbensen shegen. Konfokala erhållna bilderna visade att proteinet IgE binder med DNP på fiberytan. 3 Detta är en indikation på specificiteten av bindning av elektrospunna DNP-polymerer mot IgE-antikroppar. Intensiteten hos ljuset är en indikator på närvaron av IgE på Nanofiber som proteinet fluorescent är taggade.
Figur 8a är en AFM (Atomic Force Microscope) bild av en de Nanofiber som erhålls genom denna process och 8b figur visar dimensionen av denna speciella nanofiber är cirka 150 nm i diameter. Genom detta förfarande fibrer mellan 100-700 nm erhålles. Vid denna tiden är det svårt att framställa fibrer med en specifik dimension. Detta överensstämmer med vad som observeras av andra grupper. 4 Figur 9 visar SEM bilder av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT Nanofiber och diametern på Nanofiber var mellan 200 nm till 300 nm. Finns tre SEM bilder av nanofibers visas vid olika förstoringsgrader. Studie av de tre bilderna visar morfologier hos fibrerna är linjära och pärlstav. Det övergripande målet är att framställa fibrer som oftast linjära. Figur 10 visar IV tomt på mattor av Nanofiber framställda av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT. Tomten visar beteendet hos en resistor (Resistiv). När antigenet är bundet till Nanofiber förväntar vi oss att se en förändring i IV beteende fibermattan som denna förändring i motstånd är en egenskap som tyder på att de funktionella fibrerna har potentiell tillämpning som den aktiva komponenten i sensorer för enda molekyl upptäckt .
Figur 1. Polymerisationsreaktor för att syntetisera α, ω-dihydroxi polymeren. A) insprutningspunkt för flödet UHP gasen kväve. B.) Injektion punkten för lösningsmedlet, monomeren, samt initiator. C) reaktionskärlet.
Figur 2. Inställning för electrospinning med en Glassman högspänningskälla.
Figur 3. Inställning används för att mäta IV tomter med en sub-femtoamp Remote SourceMeter (Keithley).
Figur 4. A). Syntetisk metod för framställning OH-PEO-P2MS-PEO-OH polymerer. B) Funktionalisering av α, ω-dihydroxi [poly (etylenoxid)-b-poly (2-metoxistyren)-b-poly (etylenoxid)].
Figur 5. FT-IR-spektra av (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, föregångaren till CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP och (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figur 6. 500 MHz Proton NMR av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figur 7. A) Bindande bild av FITC-IgE med CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibrer elektrospunna från klorbensen. B) konfokalmikroskop bild av kontrollen (Nanofiber med IgG).
Figur 8. A) AFM bild av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibrer elektrospunna från klorbensen och B) AFM profil, dvs dimensionen av en fiber som visas i figur 5a.
Figur 9. SEM bilder av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT Nanofiber.
Figur 10. IV tomt på mattor av Nanofiber framställda av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport har vi presenterat en kraftfull metod för att förbereda biofunktionella Nanofiber. De Nanofiber är inredda till en funktionell grupp som är specifik för en modell protein. Förfarandet och förhållningssätt redovisas i detta meddelande är av allmän karaktär och kan användas för att framställa Nanofiber dekorerade med valfri funktionell grupp. Den anjoniska levande polymerisation är kraftfull metod för att syntetisera kontrollerade polymerstrukturer kovalent kopplade till valfritt antal intressanta funktionella eller funktionella grupper som är specifika för vissa biomarkörer av intresse. Anjonisk levande polymerisation är väl etablerad för monomeren 2-metoxistyren. Två Electrospinning är en mångsidig teknik att fiberdimensioner lätt kan styras genom att ändra spänningen och även varierande koncentration av lösningen vara elektrospunna. Fem Nanofiber visar resistiv IV beteende och därmed lovar att fungera som aktiva komponenter ibiosensorer dvs rapporterade metoden har förutsättningar för att utveckla enhetens biomarkör upptäckt. 6,7
Polymerisationen av den första monomeren, 2-metoxistyren, är 100% fullständig inom 40 minuter, dvs 100% av monomeren omvandlas till polymeren och den andra monomeren polymerisationen är långsam kräver 2 dagar att polymerisera. Det är, polymeriserar monomeren en snabbare än monomer 2. Det finns ingen oanvänd monomeren, men slutet av de 2 dagar, det finns vissa oanvända monomer men detta kommer inte att bidra till polydispersiteten. Vi har framställt homopolymerer av den första monomeren, dvs poly (2-metoxistyren) och PDI av dessa polymer är omkring 1,2 och även segmentsampolymererna rapporterade här är också 1,2. Så vitt vi vet har ingen studie gjorts som ser på effekten av PDI på dimension elektrospunna fibrer, men det är normalt förväntas att låga PDI bidra till bättre kvalitet bearbetad produkt på grund av skäl som CHain-kedja förvecklingar.
Vi använde SWCNTs grund av tidigare arbete som visar att poly2-metoxistyren är effektivt lindas runt Nanorör och bryta agglomerering av SWCNT. 8 Vi tror att detta har att göra med den specifika storleken på SWCNTs. Slutligen, 1% SWCNT halten i fibrerna resulterar i fibrer som är tillräckligt elektroaktiva för vår studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF HRD-0630456, är en NSF CREST Program och NSF DMR-0.934.142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
