Summary
कार्यात्मक प्रोटीन के साथ विशेष रूप से बातचीत करने के लिए सक्षम समूहों के साथ सजाया nanofibers तैयार करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण वर्णित है. कार्यात्मक समूह के साथ उपयुक्त functionalized बहुलक की दृष्टिकोण 1 तैयारी की आवश्यकता है. कार्यात्मक बहुलक nanofibers में electrospinning द्वारा निर्मित है. एक प्रोटीन के साथ nanofibers के बंधन की प्रभावशीलता confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अध्ययन किया है.
Protocol
1. Α के संश्लेषण, पॉलिमर ω dihydroxyl [हो लोगों P2MS पीईओ-OH]
- इकट्ठा polymerization रिएक्टर के रूप में चित्र 1 में दिखाया. इस प्रयोग के लिए रिएक्टर एक 100 मिलीलीटर 2 गर्दन फ्लास्क दौर नीचे एक मानक शंकु बाहरी (Chemglass) संयुक्त, stopcocks साथ दो प्रवाह नियंत्रण एडाप्टर (Chemglass), और एक Teflon सरगर्मी छड़ी होने से मिलकर बनता है. एडाप्टर A (1 चित्रा) प्रणाली के माध्यम से अल्ट्रा उच्च शुद्धता नाइट्रोजन (UHP) बह रखने के क्रम में निष्क्रिय सिस्टम में प्रवेश करने से हवा और नमी को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एडाप्टर बी (1 चित्रा) प्रतिक्रिया फ्लास्क में विलायक, monomer, और सर्जक इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- सूखी ना धातु पर Tetrahydrofuran (THF) के 200 मिलीलीटर, संकेतक के रूप में Benzophenone सूखी नाइट्रोजन गैस के तहत 6 घंटा की एक न्यूनतम के लिए,.
- 24 घंटे के लिए कैल्शियम hydride पर 2 methoxystyrene के 10 मिलीलीटर सूखी.
- एक ठंडे तापमान -78 पर बनाए रखा स्नान तैयार डिग्री सेल्सियस एक isopropanol का एक घोल का उपयोगएन डी तरल नाइट्रोजन.
- नाइट्रोजन गैस के तहत polymerization प्रतिक्रिया कुप्पी (चित्रा 1 देखें) में THF की 25 मिलीलीटर जोड़ें और नाइट्रोजन गैस के तहत polymerization के माध्यम से सभी रिएक्टर रखना.
- जगह घोल में 100 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क.
- प्रतिक्रिया फ्लास्क में सर्जक समाधान के 2 मिलीलीटर (0.27 mmol / मिलीलीटर) जोड़ें.
- प्रतिक्रिया फ्लास्क में 1 monomer, 2 methoxystyrene (4 मिलीलीटर) सुई.
- 40 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें.
- 2 monomer, ethylene ऑक्साइड के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- Polymerization कमरे के तापमान पर दो दिनों के लिए जारी रखने के लिए अनुमति दें.
- एचसीएल के साथ बहुलक (6 एम) / मेथनॉल (1/20 / खंड खंड) बर्खास्त.
- वैक्यूम ओवन में hexanes और सूखी बहुलक में precipitating बहुलक शुद्ध.
- एनएमआर का उपयोग कर बहुलक विशेषताएँ.
2. Α, N-2 ,4-DNP - Ε अमीनो कैप्रोइक कार्यात्मक polym प्राप्त एसिड के साथ पॉलिमर ω dihydroxyl functionalizationएर, CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP
- एक तीन गर्दन फ्लास्क, α, ω-dihydroxyl (0.05 mmol) बहुलक, N-2 ,4-DNP ई अमीनो कैप्रोइक एसिड (0.25 mmol), डीसीसी (0.15 mmol) और DMAP (0.005 mmol) और जगह 4 घंटा के लिए वैक्यूम लाइन पर सूखी.
- फ्लास्क में आसव सूखी dichloromethane (10 मिलीग्राम).
- नाइट्रोजन की वैक्यूम रिलीज और कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए प्रतिक्रिया हलचल.
- फ़िल्टर प्रतिक्रिया मिश्रण और hexanes और मेथनॉल में दो बार precipitating द्वारा बहुलक ठीक.
- सूखी एक वैक्यूम ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक उपजी
- बहुलक और फुट आईआर और 1 एच एनएमआर संरचना कार्यक्षमता का निर्धारण करते हैं.
3. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT समाधान electrospinning के लिए तैयार
- भंग 20-CDNP पीईओ - P2MS लोगों CDNP के chlorobenzene में w%.
- 20 डब्ल्यू% भंग और 40 Polystyrene w chlorobenzene में% (800,000 मेगावाट) के लिए तैयार करने के लिए दो समाधान. उच्च आणविक polystyrene बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता हैई बहुलक उलझाव श्रृंखला श्रृंखला और इष्टतम चिपचिपापन electrospinning के लिए आवश्यक प्राप्त करने के.
- मिश्रण बहुलक समाधान 3.1 और 3.2 में एक साथ पॉलिमर के 01:01 और 01:02 के अनुपात के रूप में तैयार करने के लिए और मिश्रण करने के लिए 1% w एकल दीवारों कार्बन नैनोट्यूब (SWCNT) जोड़ने और CNTs के वितरण के लिए भी रातोंरात हलचल.
4. पॉलिमर CNT समग्र electrospinning
- सेट अप के रूप में चित्रा 2 में दिखाया electrospinning इकट्ठे. आंकड़े के दाहिने हाथ की तरफ Glassman उच्च वोल्ट स्रोत है. जो सिलिकॉन वफ़र जुड़ा हुआ है एक मुंहतोड़ जवाब स्टैंड इसे करने के लिए अगले है. बाईं करने के लिए एक और मुंहतोड़ जवाब स्टैंड पर जो सिरिंज घुड़सवार और पीछे यह प्रक्रिया visualizing के रूप में यह प्रगति के लिए चिराग है.
- एक चमड़े के नीचे सिरिंज का प्रयोग, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT मिश्रण (1 मि.ली.) की एक छोटी मात्रा में वापस लेने और मुंहतोड़ जवाब स्टैंड पर चमड़े के नीचे सिरिंज माउंट.
- एक सिलिकॉन वफ़र माउंट है10 सेमी की दूरी पर सुरक्षित सिरिंज, और उच्च वोल्टेज स्रोत के जमीन क्लिप से भर एड इसे करने के लिए जुड़ा हुआ है.
- उच्च वोल्टेज असर सिरिंज पर सुई के लिए लागू किया जा क्लिप संलग्न सवार एक छोटा सा (सुई की नोक पर एक बूंद को निलंबित) दबाना और इस बिंदु पर, electrospinning तैयार है.
- उच्च वोल्टेज स्रोत पर पावर और 10 केवी वोल्टेज मीटर समायोजित करें. कम्पोजिट में पॉलिमर की प्रकृति पर निर्भर करता है, उच्च voltages, आवश्यक हो सकता है, खासकर अगर व्यास में एक सौ नैनोमीटर के तहत nanofibers वांछित हैं.
- अनमाउंट करें सिलिकॉन और एक रातोंरात dessicator पूरी तरह से सूखे में वफ़र जगह.
5. Nanofibers की विशेषता
- Nanofibers की प्रारंभिक इमेजिंग ऑप्टिकल फाइबर की समग्र दृष्टिकोण का पालन खुर्दबीन के साथ किया जाता है.
- स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग आकारिकी, व्यास, औसत ताकना आकार, आदि की तरह महीन विवरण का पालन
- ले जानाफाइबर, आदि की स्थलाकृति 3-D का निरीक्षण करने के लिए एक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी के साथ आगे इमेजिंग बाहर
6. Nanofibers की विरोधी DNP IgE प्रोटीन के साथ बंधन विशिष्टता
- पीबीएस (फास्फेट Buffered Saline गोजातीय सीरम albumin) BSA समाधान में 4 स्नातकीय / एल fluorescently लेबल, FITC IgE (Fluorescein ई Isothio cyanate - इम्यूनोग्लोबिन) के एक समाधान तैयार.
- सिलिकॉन वफ़र का एक छोटा सा टुकड़ा है जिस पर एक मटेक अच्छी तरह coverslip पर nanofibers रखें. इस समाधान में एक घंटे के लिए nanofibers सेते हैं. ऊष्मायन धीरे सिलिकॉन वफ़र पर, 10 उल IgE समाधान pipetting द्वारा किया जाता है.
- ऊष्मायन के बाद, नमूना बफर पीबीएस BSA समाधान के साथ तीन बार धोने से अनबाउंड IgE हटा दें. पीबीएस समाधान धीरे मटेक पकवान की दीवार पर तिरस्कृत किया है, के क्रम में nanofibers पर सीधे बफर squirting से बचने के लिए. हाथ से धीरे पकवान भंवर, nanofibers पर बफर समाधान वितरित. ध्यान से एक विंदुक के साथ बफर को हटाने और फिरयह दो से अधिक बार पीट.
- नियंत्रण के लिए, एक ही परिस्थितियों में fluorescently लेबल आईजीजी (DNP के लिए गैर विशिष्ट) में nanofibers सेते हैं.
- एक Confocal माइक्रोस्कोप IgE साथ बंधनकारी (नियम आदि का) पालन करना बाध्य फाइबर कल्पना. हमारे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया खुर्दबीन Leica 63x लेंस के साथ confocal टीसीएस SP2 था.
7. वर्तमान वोल्टेज Nanofibers के व्यवहार
- एक बहुत कम Keithley 6430 संवेदनशील SourceMeter की तरह वर्तमान स्रोत के लिए दो सूक्ष्म positioners कनेक्ट. वर्तमान वोल्टेज व्यवहार का निर्धारण करने के लिए स्थापित चित्रा 3 में दिखाया गया है. यह आंकड़ा जांच nanofibers के प्रारंभिक चतुर्थ विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया स्टेशन से पता चलता है. यह Bausch और Lomb MicroZoom माइक्रोस्कोप, एक वैक्यूम चक स्टेज, और चार की जांच में इस्तेमाल Micropositioners से बना है. ऊपर सही पर Agilent 34405A डिजिटल मल्टीमीटर वोल्टेज को मापने में प्रयोग किया जाता है और नीचे है कि Keithley 6430 उप femtoamp रिमोट स्रोत मीटर कम धाराओं कि तंतुओं में इनपुट स्रोत के लिए प्रयोग किया जाता है.
- फाइबर को छू सुझावों के साथ विपरीत पक्षों पर फाइबर चटाई पर सूक्ष्म positioners की जांच हथियार माउंट.
- एक और दो सूक्ष्म positioners कनेक्ट एक डिजिटल मल्टीमीटर, के बीच जांच हथियार माउंट अन्य दो और फाइबर चटाई पर सुझावों भूमि. सुनिश्चित करें कि चार सुझावों संभव के रूप में समरेख के रूप में कर रहे हैं.
- Keithley (आमतौर पर nanoamps रेंज में) से वर्तमान की मात्रा बदलती इनपुट.
- बाहरी सुझावों भर में वोल्टेज वर्तमान के हर परिमाण sourced के लिए, ड्रॉप उपाय.
- इन मूल्यों की साजिश रचने युक्ति के प्रकार फाइबर चटाई की तरह काम करता है का संकेत होगा.
8. प्रतिनिधि परिणाम
कार्यात्मक बहुलक
"> Α के संश्लेषण के लिए, विधि ω द्वि [2,4-dinitrophenyl कैप्रोइक] [पाली - ख पाली (ethylene ऑक्साइड) (2-methoxystyrene) ख पाली (ethylene ऑक्साइड)] (CDNP - पीईओ फुट आईआर की पूरी गायब से पता चलता है P2MS लोगों CDNP) 4 चित्र में दिखाया गया है 1 कार्यात्मक बहुलक की संरचना. फुट आईआर (चित्रा 5) और 500 मेगाहर्ट्ज एच 1 एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (6 चित्रा) द्वारा पुष्टि किया गया था. -OH पैंतीस सौ सेमी -1 मात्रात्मक functionalization CDNP समूह के साथ संकेत के आसपास व्यापक अवशोषण. यह भी एनएमआर स्पेक्ट्रम चित्रा 6 में दिखाया द्वारा पुष्टि की है एनएमआर स्पेक्ट्रम में चोटियों के एकीकरण, यह निर्धारित किया गया था कि CDNP पीईओ - P2MS लोगों CDNP पॉलिमर मात्रात्मक functionalized कर रहे हैं.Nanofibers
7 चित्रा में, प्रवाहकीय - CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP / polystyrene / chlorobenzene से SWCNT electrospinning करके प्राप्त nanofibers के एक चटाई श हैखुद की. Confocal प्राप्त चित्रों से पता चला है कि प्रोटीन IgE फाइबर सतह पर DNP के साथ बांध 3 इस IgE एंटीबॉडी की ओर electrospun DNP पॉलिमर के बंधन की विशिष्टता का एक संकेत है. प्रकाश की तीव्रता nanofibers के रूप में प्रोटीन fluorescently टैग पर IgE की उपस्थिति का एक संकेतक है.
चित्रा 8a एक इस प्रक्रिया और चित्रा 8b द्वारा प्राप्त nanofibers से पता चलता है कि इस विशेष nanofiber के आयाम व्यास में 150 एनएम के आसपास है के एक AFM छवि (परमाणु सेना माइक्रोस्कोप) है. इस प्रक्रिया के द्वारा 100-700 एनएम के बीच फाइबर प्राप्त कर रहे हैं. इस वर्तमान समय में यह एक विशिष्ट आयाम के साथ फाइबर को तैयार करने की चुनौती दे रहा है. यह क्या अन्य समूहों द्वारा मनाया जाता है के साथ संगत चित्रा 4 - CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP / / polystyrene SWCNT nanofibers और nanofibers के व्यास की छवियों SEM 9 शो 200 एनएम से 300 एनएम के बीच थे. वहाँ तीन SEM nanofibe की छवियोंरुपये विभिन्न magnifications में दिखाया गया है. तीन छवियों के अध्ययन से पता चलता है तंतुओं के morphologies रैखिक और मनके हैं. समग्र लक्ष्य फाइबर जो ज्यादातर रैखिक रहे हैं तैयार करने के लिए 10 आंकड़ा CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP polystyrene / / SWCNT से तैयार nanofibers के मैट के चतुर्थ साजिश से पता चलता है. साजिश एक रोकनेवाला (Ohmic) के व्यवहार से पता चलता है. जब प्रतिजन nanofibers करने के लिए बाध्य है, हम फाइबर चटाई की चतुर्थ व्यवहार में परिवर्तन देखने के प्रतिरोध में इस परिवर्तन के रूप में एक विशेषता है जो यह पता चलता है कि कार्यात्मक फाइबर एकल अणु का पता लगाने के लिए सेंसर में सक्रिय घटक के रूप में संभावित आवेदन की उम्मीद .
चित्रा 1 α, बहुलक ω dihydroxyl synthesizing के लिए polymerization रिएक्टर. ए) प्रवाह UHP गैस नाइट्रोजन के लिए इंजेक्शन बिंदु. बी) विलायक, सर्जक, और monomer के लिए इंजेक्शन बिंदु. सी) प्रतिक्रिया पोत.
चित्रा 2 सेटअप एक Glassman उच्च वोल्टेज स्रोत का उपयोग कर electrospinning के लिए प्रयोग किया जाता है.
चित्रा 3 चतुर्थ भूखंडों का उपयोग कर एक उप femtoamp रिमोट SourceMeter (Keithley) को मापने के लिए इस्तेमाल किया सेटअप.
चित्रा 4 ए). OH लेना P2MS पीईओ-OH पॉलिमर की तैयारी के लिए सिंथेटिक दृष्टिकोण. बी) α की functionalization, ω dihydroxy [पाली (ethyleneoxide) ख पाली (2-methoxystyrene) ख पाली (ethyleneoxide)].
चित्रा 5 फुट आईआर (ए) के स्पेक्ट्रा ओह, पीईओ P2MS लेना ओह, अग्रदूत साबित करने CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP और (बी) CDNP लोगों P2MS - लोगों CDNP.
![चित्रा 6]("files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg)
चित्रा 6 500 मेगाहर्ट्ज प्रोटॉन एनएमआर CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP की.
चित्रा 7) chlorobenzene से CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP फाइबर electrospun साथ FITC IgE के बंधन छवि. बी) के नियंत्रण के Confocal माइक्रोस्कोप छवि (आईजीजी साथ nanofibers).
8 चित्रा) - chlorobenzene और बी) एक चित्रा 5a में दिखाया फाइबर की AFM प्रोफाइल यानी आयाम से CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP फाइबर electrospun AFM छवि.
9 चित्रा CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP / polystyrene / SWCNT nanofibers SEM छवियों.
10 चित्रा CDNP - पीईओ P2MS लोगों CDNP polystyrene / / SWCNT से तैयार nanofibers के मैट के चतुर्थ साजिश.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस रिपोर्ट में, हम biofunctional nanofibers तैयार करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है. nanofibers एक कार्यात्मक समूह जो प्रोटीन एक मॉडल के लिए विशिष्ट है सजाया जाता है. प्रक्रिया और दृष्टिकोण इस संचार में रिपोर्ट प्रकृति में सामान्य है और किसी भी कार्य वांछित समूह के साथ सजाया nanofibers को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. anionic जीवित polymerization नियंत्रित बहुलक covalently दिलचस्प कार्यात्मक या कार्यात्मक समूह जो ब्याज की विशेष biomarkers विशिष्ट हैं की किसी भी संख्या से जुड़ा संरचनाओं synthesize शक्तिशाली तरीका है. Anionic जीवित polymerization है 2 - methoxystyrene monomer के लिए अच्छी तरह से स्थापित दो Electrospinning में एक बहुमुखी तकनीक है है कि फाइबर आयाम वोल्टेज बदलने के द्वारा आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है और भी हो समाधान electrospun की एकाग्रता अलग है. 5 nanofibers प्रतिरोधक चतुर्थ शो और इस तरह व्यवहार में सक्रिय घटक के रूप में कार्य करने का वादा कर रहे हैंरिपोर्ट दृष्टिकोण यानी biosensors biomarker पता लगाने डिवाइस के विकास के लिए वादा धारण 6,7.
पहली monomer की polymerization, 2 methoxystyrene, 100% monomer की 40 मिनट यानी 100% के भीतर पूरा हो गया है बहुलक और 2 monomer polymerization धीमी है polymerize करने के लिए 2 दिन की आवश्यकता के लिए बदल जाती है. यही कारण है, एक monomer 2 monomer की तुलना में तेजी polymerizes. वहाँ कोई अप्रयुक्त एक, monomer, लेकिन 2 दिन के अंत है, वहाँ कुछ अप्रयुक्त monomer है, लेकिन इस polydispersity में योगदान नहीं होगा. हम 1 monomer यानी (2-methoxystyrene) पाली और इन बहुलक का PDI homopolymers तैयार किया है 1.2 के आसपास हैं और भी ब्लॉक copolymers यहाँ बताया भी 1.2. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए कोई अध्ययन नहीं किया गया है कि electrospun तंतुओं के आयाम पर PDI के प्रभाव में दिखता है, लेकिन यह आम तौर पर ग के कारणों की वजह से उम्मीद है कि कम PDI बेहतर गुणवत्ता प्रसंस्कृत उत्पाद योगदानहैं श्रृंखला entanglements.
हम पहले काम है जो दिखाता है कि poly2 methoxystyrene कार्बन नैनोट्यूब के चारों ओर लपेटकर और SWCNT के ढेर को तोड़ने में प्रभावी है क्योंकि SWCNTs इस्तेमाल किया. 8 हम मानते हैं कि यह SWCNTs के विशिष्ट आकार के साथ क्या करना है. अंत में, हमारे अध्ययन के लिए पर्याप्त electroactive जो फाइबर में फाइबर परिणामों में 1% SWCNT सामग्री.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मानव संसाधन विकास - 0630456 NSF द्वारा समर्थित किया गया एक NSF शिखा कार्यक्रम और NSF, DMR-0934142 है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
