Summary
Özellikle proteinleri ile etkileşim yeteneğine fonksiyonel grupları ile dekore nanoelyaflar hazırlamak için etkili bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yaklaşım, ilk olarak uygun bir fonksiyonel grup ile fonksiyonelleştirilmiş bir polimerin hazırlanmasını gerektirmektedir. Işlevsel polimer elektroeğirme nanoelyaflar içine imal edilir. Bir protein ile nanoliflerden bağlanma etkinliği konfokal mikroskopi ile incelenmiştir.
Abstract
Elektroeğirme fonksiyonel grupları ile dekore nanoelyaflar hazırlanması için bir işlem etkili bir yöntemdir. Fonksiyonel grupları ile dekore Nanoliflerin tek molekül detektörleri gibi potansiyeli olan biyosensör olarak hareket yani maddi-biyolojik etkileşimleri çalışmak için kullanılan olabilir. Biz işlevselliği bir model protein ile özellikle bağlama kapasitesine sahip işlevsel polimerler hazırlamak için etkili bir yaklaşım geliştirdik. Bizim model sistem olarak, işlevsel grup 2,4-dinitrofenil (DNP) ve protein anti-DNP IgE (IgE) 'dir. Işlevsel polimer, α, ω-bi [2,4-dinitrofenil kaproik] [poli (etilen oksit)-b-poli (2-methoxystyrene)-b-poli (etilen oksit)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), anyonik canlı polimerizasyonu ile hazırlanmıştır. Polimerizasyonda kullanılan iki fonksiyonlu başlatıcı α-metilstiren, elektron transfer reaksiyonu ve potasyum (ayna) metal kullanılarak hazırlandı. 2-methoxystyrene monomerin eklenmesindenbaşlatıcı ile birinci, ikinci monomer, etilen oksit ilave edildi ve son olarak bir oturma polimer metanol ile sona erdirildi. Α, ω-dihydroxyl polimer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] α, ω-bi oluşumu ile sonuçlanan DCC bağlanması ile N-2 ,4-DNP-∈-amino kaproik asit, ile reaksiyona sokulmuştur [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poli (etilenoksit)-b-poli (2-methoxystyrene)-b-poli (etilen oksit)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polimerler FT-IR, 1H NMR ve Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) ile karakterize edildi. Polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı dar olan (1.1-1.2) ve 50.000 'in moleküler ağırlığa sahip polimerler bu çalışmada kullanılmıştır. Polimerlerin sarı tozlar ve tetrahidrofuran içinde çözünmüştür. Bir suda çözünür CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene glikol) karmaşık bağlar ve birkaç saniye içinde çözüm IgE ile kararlı durum bağlama ulaşır. Daha yüksek moleküler ağırlık (yaklaşık 50.000 suda çözünmez ie) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polimerler,% 1 tek duvar karbon nanotüpler içeren (SWCNT) silikon tabana Elektroaktif nanolifler (100 nm çapında 500 nm) işlenmiştir. Flüoresans spektroskopisi, anti-DNP IgE dekorasyon DNP fonksiyonel gruplar elyaf bağlayıcı ile nanoelyaflar ile etkileşime girer göstermektedir. Bu gözlemler, uygun Fonksiyonlu nanolifler biyomarker algılama cihazı geliştirmek için söz tutun öneririz.
Protocol
1. Α sentezi, ω-dihydroxyl Polimer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi, polimerizasyon reaktörünün bir araya getirin. Bu deney için reaktör standart bir dış konik eklem (Chemglass), stopcocks ile iki akış kontrol bağdaştırıcılar (Chemglass), ve bir Teflon karıştırma çubuğu olan 2-boyunlu şişeye, bir 100 ml'lik yuvarlak tabanlı bir oluşur. Adaptör (Şekil 1) atıl sistemine giren hava ve nemin önlenmesi için sistem aracılığıyla ultra yüksek saflıkta (UHP) Azot akımı sağlamak için kullanılmıştır. Adaptör B (Şekil 1) Reaksiyon şişesi içine çözücü, monomer ve başlatıcı enjekte etmek için kullanıldı.
- Kuru azot gazı altında 6 saat arasında, en az, bir göstergesi olarak benzofenon kullanılarak, Na metal zarfında tetrahidrofuran (THF), 200 ml kuru.
- 24 saat boyunca kalsiyum hidrür fazla 2-methoxystyrene 10 mL kuru.
- ° C'de izopropanol bir bir bulamaç kullanarak -78 tutulan bir soğuk banyo sıcaklığı hazırlanmasınd sıvı azot.
- Azot gazı altında, polimerizasyon reaksiyon şişesine (bkz. Şekil 1) içine THF ve 25 ml ekleyin ve bütün polimerizasyon boyunca azot gazı altında reaktör tutmak.
- Bulamaç haline il 100 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye.
- Reaksiyon şişesi içine, başlatıcı solüsyonun 2 ml (0,27 mmol / mL) ekleyin.
- Reaksiyon şişesi içine ilk olarak, monomer, 2-methoxystyrene (4 ml) enjekte edilir.
- 40 dakika süreyle devam etmek tepki ver.
- Ikinci monomer, etilen oksit ve 1 ml ilave edilir.
- Polimerizasyon iki gün için oda sıcaklığında devam etmesini sağlayın.
- HCI ile polimer (6 M) / metanol (1/20, hacim / hacim) sona erdirme.
- Heksan ve bir vakumlu fırın içinde kuru polimer içine çökelterek polimer temizler.
- NMR ile polimer karakterize eder.
2. Α, fonksiyonel Polym elde edilir N-2 ,4-DNP-Ε-amino kaproik asit ile ω-dihydroxyl Polimer Fonksiyonlandırmaer, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- Bir üç boyunlu bir şişe içinde, α, ω-dihydroxyl polimer (0.05 mmol), N-2 ,4-DNP-e-aminokaproik asit (0.25 mmol), DCC (0.15 mmol) ve DMAP (0.005 mmol) ve koyun 4 saat boyunca vakum hattında kurulayın.
- Balonun içine kuru diklorometan (10 ml) damıtmak.
- Nitrojen altında vakum bırakın ve oda sıcaklığında 12 saat boyunca reaksiyon karıştırın.
- Filtre reaksiyon karışımı ve heksanlar ve metanol içine iki kez çökelterek polimer kurtarabilirsiniz.
- Kuru 40 ° C'da bir vakumlu fırın içinde polimer çökeltildi
- FT-IR ve 1H NMR ile polimer yapısı ve işlevi belirler.
3. Elektrospinning için CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Çözüm hazırlanması
- Klorobenzen yılında CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 20 w% çözülür.
- 20% w çözülür ve klorobenzen içinde Polistiren 40% w (MW 800.000) iki çözüm hazırlamak. Daha yüksek moleküler polistiren increas için kullanılıre polimer zincir-zincir dolaşıklık ve elektrospinning için gerekli olan en uygun viskozite elde etmek.
- Polimerlerin 1:1 ve 1:2 oranlarında oluşturur ve karışım, 1 g% Tek karbon nanotüp (SWCNT) eklenir ve CNT daha iyi dağıtılması için gece boyunca karışmaya birlikte 3.1 ve 3.2 'de hazırlanmış olan polimer çözeltileri karıştırılır.
4. Polimer-CNT Kompozit elektrospinning
- Şekil 2'de gösterildiği gibi ayarlamak elektrospinning birleştirin. Şeklin sağ tarafında Glassman Yüksek Gerilim kaynağıdır. Yanında silikon gofret ekli olduğu bir imbik stand. Sol şırınga monte edilir ve arkasından o ilerledikçe prosedürü görselleştirmek için lamba hangi başka bir imbik stand.
- Bir hipodermik şırınga kullanarak, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT karışımı (1 ml), az bir miktar geri çekmek ve imbik standı üzerine monte derialtı enjektör.
- Bir silikon gofret mount10 cm'lik bir mesafeden güvenli bir şırınga ve yüksek voltaj kaynağının toprak küçük karşısında ed buna eklenir.
- Şırınga iğnesi ile uygulanmak üzere yüksek voltaj taşıyan klipsini, dalma piston biraz (iğne ucu üzerinde bir damla askıya) bastırmak ve bu noktada, elektrospinning hazırdır.
- Yüksek gerilim kaynağı Güç ve 10 kV gerilim metre ayarlayın. Bileşik içinde polimer yapısına bağlı olarak, daha yüksek voltajlar çapında bir yüz nanometre altında nanoelyaflar arzu edilir, özellikle de gerekli olabilir.
- Tamamen kurumasını gecede bir desikatöre Unmount silikon gofret ve yer.
5. Nanoliflerin Karakterizasyonu
- Nanoliflerden başlangıç görüntüleme liflerin genel perspektif gözlemlemek için optik mikroskop ile yapılır.
- Morfolojisi, çap, ortalama gözenek boyutu, vs gibi ince ayrıntıları gözlemlemek için Taramalı Elektron Mikroskobu yararlanın
- Taşımaklifler, vb 3-D topografi gözlemlemek için bir atomik kuvvet mikroskobu ile daha fazla görüntüleme üzerinden
6. Anti-DNP IgE Protein Nanoliflerin bağlama özgünlüğü
- PBS-BSA (fosfat tamponlu tuzlu su-Bovine Serum Albumin) çözeltisi içinde 4 ug / l fluoresan etiketli, FITC IgE (Fluoresein Isothio-siyanat-IgE) bir çözeltisi hazırlayın.
- Bir Mattek iyi lamel nanolifler vardır hangi silikon gofret küçük bir parça yerleştirin. Bir saat boyunca bu çözelti içinde nanoelyaflar inkübe edin. Kuluçka hafifçe silikon gofret üzerine, 10 ul IgE çözüm pipetleme tarafından yapılır.
- İnkübasyondan sonra, PBS-BSA tampon çözelti ile örnek üç kez yıkanarak bağlanmamış IgE çıkarın. PBS çözeltisi direkt olarak nanoelyaflar üzerine tampon püskürtme önlemek için, Mattek çanak duvarı üzerine nazikçe dağıtılır. Nanoliflerde tampon çözelti dağıtmak için hafifçe elle Swirl tabak. Dikkatli bir pipet ile tampon kaldırmak ve yenidenturba Bu iki kez daha.
- Kontrol için, aynı koşullar altında floresan etiketli IgG (DNP için spesifik olmayan) içinde nanoelyaflar inkübe edilir.
- IgE bağlama gözlemlemek için bir Konfokal Mikroskop ile ilişkili lifler gözünüzde canlandırın. Çalışmamızda için kullanılan mikroskop 63x lens ile Leica konfokal TCS SP2 oldu.
7. Nanoliflerin Akım-Gerilim Davranışı
- Keithley 6430 duyarlı sourcemeter gibi çok düşük bir akım kaynağı için iki mikro pozisyonerler bağlayın. Akım gerilim davranış belirlemek için ayarlanmış Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu şekil, nanoliflerden ilk IV özelliklerini belirlemek için kullanılabilir Prob istasyonu gösterilmektedir. Bu Bausch ve Lomb MicroZoom Mikroskop, bir vakum Chuck aşaması, ve sonda olarak kullanılan dört Micropositioners oluşur. Sağ üst üzerinde Agilent 34405A Dijital Multimetre gerilim ölçümünde kullanılan ve aşağıda olduğunu edilir Keithley 6430 Alt-Femtoamp uzak bir kaynaktan Meter kaynak liflerinin içine girilmiştir düşük akımları için kullanılır.
- Liflerinin temas uçları ile karşıt taraflarda elyaf mat üzerinde mikro pozisyonerleri sonda kolları monte edin.
- Dijital multimetre başka iki mikro pozisyoner bağlayın, diğer ikisi arasında-in prob silah monte ve elyaf mat üzerine ipuçları arazi. Dört ipuçlarını olabildiğince collinear gibi olduğundan emin olun.
- Keithley (genellikle nanoamps aralığında) güncel değişen miktarlarda Girdi.
- Kaynaklı akım her büyüklük için dış ipuçları üzerinde gerilim düşümü, ölçün.
- Bu değerler Plotting elyaf mat gibi davranır aygıt türünü gösterir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Fonksiyonel Polimer
"Α sentezi için> yöntem ω-bi [2,4-dinitrofenil kaproik] [poli (etilen oksit)-b-poli (2-methoxystyrene)-b-poli (etilen oksit)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) Şekil 4 'de gösterilmiştir. işlevsel polimer 1 yapı FT-IR (Şekil 5) ve 500 MHz 1H-NMR (Şekil 6) tarafından teyit edilmiştir. FT-IR tamamen yok olmasını göstermektedir -OH -1 CDNP grup ile kantitatif işlevsellik gösteren 3.500 cm civarında geniş emilmesine neden olur. Bu da Şekil 6'da gösterildiği gibi NMR spektrum ile teyit edilir. NMR spektrum içinde piklerin entegrasyonunu kullanarak olduğu belirlenmiştir CDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNP polimerler kantitatif fonksiyonelleştirilmiş edilir.Nanoliflerin
Şekil 7'de, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / klorobenzen gelen polistiren / SWCNT elektrospinning elde iletken nanoliflerden bir paspas shkendi. Elde edilen görüntü konfokal protein IgE lif yüzeyi üzerinde DNP ile bağlanır olduğunu gösterdi. 3 Bu IgE antikor karşı elektrospinning DNP-polimerlerin bağlayıcı özgünlüğü bir göstergesidir. Işık yoğunluğu protein fluoresan etiketli olarak nanoliflerde IgE varlığının bir göstergesidir.
Şekil 8a bu işlem ve Şekil 8b elde nanoelyaflar bu özel nanolif bir boyut çapı 150 nm civarında gösteren tek bir AFM (atomik kuvvet Mikroskop) görüntüsüdür. Bu işlem tarafından 100-700 nm arasında lifler elde edilmiştir. Bu akım zamanda belirli bir boyutu olan lifler hazırlamak zordur. Bu diğer gruplar tarafından gözlenmiştir ne ile tutarlıdır. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistiren / SWCNT nanolifler ve nanoliflerden çapı SEM görüntüleri 9 gösterileri 300 nm ile 200 nm arasında olan 4 Şekil. Üç SEM vardır nanofibe görüntülerirs farklı büyütme gösterildi. Çalışma üç görüntü liflerin morfolojileri ve doğrusal boncuklu olduğunu göstermektedir. Genel amaç çoğunlukla lineer elyaf hazırlamaktır. Şekil 10 CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistiren / SWCNT hazırlanan nanoliflerden paspaslar IV arsa gösterir. Arsa bir direnç (Rezistif) davranışı göstermektedir. Antijen nanolifler bağlı olduğunda, biz direnç bu değişimin fonksiyonel lifler tek molekül tespiti için sensörler aktif bileşen olarak potansiyel uygulama olduğunu öne sürmektedir karakteristik olarak fiber mat IV davranışta bir değişiklik görmeyi bekliyoruz .
Şekil 1. Α, ω-dihydroxyl polimer sentezi için polimerizasyon reaktörü. Akış UHP gaz azot A) enjeksiyon noktası. Çözücü, monomer ve başlatıcı için B) enjeksiyon noktası. C) tepkime kabı.
Şekil 2. Bir Glassman yüksek gerilim kaynağı kullanılarak elektrospinning için kullanılan Kur.
Şekil 3. Alt-femtoamp Uzaktan Sourcemeter (Keithley) kullanarak IV araziler ölçmek için kullanılan Kur.
Şekil 4,. OH-PEO-P2MS-PEO-OH polimerler hazırlanması için A). Sentetik bir yaklaşım. B) arasında Fonksiyonlandırma α, ω-dihidroksi-[poli (etilenoksit)-b-poli (2-methoxystyrene)-b-poli (etilenoksit)].
Şekil 5. FT-IR spektrumları (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP ve (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP habercisidir.
Şekil 6. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP 500 MHz Proton NMR.
Şekil 7. Klorobenzen gelen CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP lifler elektrospinning ile FITC-IgE A) Cilt görüntü. Kontrol B) Konfokal mikroskop görüntüsü (IgG ile nanolif).
Şekil 8. Klorobenzen ve Şekil 5a gösterilen bir lif B) AFM profili yani boyut CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Elyaf elektrospinning A) AFM görüntüsü.
Şekil 9. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistiren / SWCNT nanoliflerden SEM görüntüleri.
Şekil 10. CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistiren / SWCNT hazırlanan nanoliflerden paspaslar IV arsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, biofunctional nanolifler hazırlamak için güçlü bir yaklaşım sergilediler. Nanoelyaflar bir model protein özgü bir işlevsel grup ile dekore edilir. Bu iletişim de bildirilen prosedür ve yaklaşımı genel türde ve arzu edilen herhangi bir işlevsel grup ile dekore nanoelyaflar hazırlamak için kullanılabilir. Anyonik yaşayan polimerizasyon kovalent olarak özel ilgi biyo özgü ilginç işlevsel ya da fonksiyonel grupların herhangi bir sayıda bağlı kontrollü bir polimer yapıları sentezlemek için güçlü bir yöntemdir. Anyonik canlı polimerizasyon monomer 2-methoxystyrene için iyi bilinmektedir. 2 Elektroeğirme lif boyutları kolayca voltaj değiştirerek kontrol edilebilir ve ayrıca elektrospinning olarak çözeltinin konsantrasyonu farklı olabilir ki içinde, bir çok yönlü bir tekniktir. 5 nanoelyaflar IV direnç göstermek davranış ve böylece aktif bileşenler olarak çalışması için umut vericidirbildirilen bir yaklaşım yani biyosensörler biyomarker algılama cihazı geliştirmek için umut vaat ediyor. 6,7
Birinci monomerin polimerizasyonu, 2-methoxystyrene, monomer 40 dakika yani% 100 içinde% 100 tamamlandıktan polimer ve ikinci monomerin polimerizasyonu 2 gün polimerleştirmek için gereken yavaş dönüşür. Diğer bir deyişle, bir monomer hızlı monomer 2 den polimerize. Hiç kullanılmamış monomer biri, ama 2 gün sonu yoktur, bazı kullanılmayan monomer ama bu polidispersite katkıda bulunmamaktadırlar. Biz, 1.2 etrafında birinci monomer örneğin poli (2-methoxystyrene) ve bu polimer PDI homopolimerleri hazırlanmış ve aynı zamanda blok kopolimerler de 1.2 'dir burada Min. Bildiğimiz kadarıyla, hiçbir çalışma elektrospinning liflerinin boyut PDI etkisi bakar ama normalde çünkü c nedenlerle düşük PDI daha kaliteli işlenmiş ürünün katkı beklenmektedir olduğu yapılmıştırHain-zinciri karışıklıklardan.
Biz çünkü poly2-methoxystyrene karbon nanotüp etrafını sarıp SWCNT bir yığılma kırmada etkili olduğunu gösteriyor önceki çalışma SWCNTs kullanılır. 8. Biz bu SWCNTs belirli büyüklüğü ile ilgisi olduğuna inanıyorum. Bu çalışmada için yeterince elektroaktif olan lifler lif sonuçlar Son olarak,% 1 SWCNT içeriği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NSF HRD-0630456 tarafından desteklenen, bir NSF CREST Programı ve NSF DMR-0934142 olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
