Summary
En effektiv fremgangsmåde til fremstilling af nanofibers dekoreret med funktionelle grupper i stand til specifikt at interagere med proteiner er beskrevet. Den fremgangsmåde kræver først fremstillingen af en polymer funktionaliseret med en passende funktionel gruppe. Den funktionelle polymer fremstilles i nanofibers ved electrospinning. Effektiviteten af bindingen af nanofibers med et protein er undersøgt ved konfokal mikroskopi.
Abstract
Electrospinning er en effektiv behandling fremgangsmåde til fremstilling af nanofibers dekoreret med funktionelle grupper. Nanofibers dekoreret med funktionelle grupper kan anvendes til at studere materiale-biomarkør interaktioner, dvs fungerer som biosensorer med potentiale som enkelt molekyle detektorer. Vi har udviklet en effektiv fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle polymerer, hvor funktionalitet er evnen til specifikt at binde med en model protein. I vores model system, er den funktionelle gruppe 2,4-dinitrophenyl (DNP) og proteinet er anti-DNP IgE (immunglobulin E). Den funktionelle polymer, α, ω-bi [2,4-dinitrophenyl capronsyre] [poly (ethylenoxid)-b-poly (2-methoxystyren)-b-poly (ethylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), fremstilles ved anionisk levende polymerisation. Den difunktionelle initiator anvendes ved polymerisationen blev fremstillet ved elektronoverførsel omsætning af α-methylstyren og kalium (spejlet) metal. Den 2-methoxystyren monomer blev tilsatførste til initiatoren, efterfulgt af tilsætning af den anden monomer, ethylenoxid, og endelig den levende polymer blev afsluttet ved methanol. Den α, ω-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] blev omsat med N-2 ,4-DNP-∈-aminokapronsyre, ved DCC kobling, hvilket resulterer i dannelsen af α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poly (ethylenoxid)-b-poly (2-methoxystyren)-b-poly (ethylenoxid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polymererne blev karakteriseret ved FT-IR, 1H NMR og gelpermeationschromatografi (GPC). De molekylvægtfordelinger af polymererne var smalle (1,1-1,2) og polymerer med molekylvægte større end 50.000 blev anvendt i denne undersøgelse. Polymererne var gule pulvere og opløselige i tetrahydrofuran. En vandopløselig CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene glycol) bindes og opnår steady state binding med opløsning IgE inden for få sekunder. Højere molekylvægt (vanduopløselig dvs. ca 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymerer, indeholdende 1% enkelt væg kulstof-nanorør (SWCNT) blev forarbejdet til elektroaktive nanofibers (100 nm til 500 nm i diameter) på siliciumsubstrat. Fluorescensspektroskopi viser, at anti-DNP IgE interagerer med nanofibers ved binding med DNP funktionelle grupper dekoration fibrene. Disse observationer antyder, at passende funktionaliserede nanofibers lovende for udvikling af biomarkør detektor.
Protocol
1. Syntese af α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- Saml polymerisationsreaktor som vist i figur 1.. Reaktoren til dette eksperiment består af en 100 ml rundbundet 2-halset kolbe med en standard konisk yderledet (Chemglass), to strømningsregulerende adaptere med stophaner (Chemglass), og en Teflon omrørerstav. Adapter A (fig. 1) blev anvendt til at holde ultrahøj renhed (UHP) Nitrogen strømmer gennem systemet for at forhindre luft og fugt trænger ind i inerte system. Adapter B (figur 1) blev anvendt til opløsningsvæsken, monomer og initiator til reaktionskolben.
- Tør 200 ml tetrahydrofuran (THF) i løbet af Na-metal, ved anvendelse af benzophenon som indikator, i mindst 6 timer under tør nitrogengas.
- Tør 10 ml 2-methoxystyren over calciumhydrid i 24 timer.
- Der fremstilles en kold temperatur-bad holdt ved -78 ° C under anvendelse af en opslæmning af isopropanol and flydende nitrogen.
- Tilsættes 25 ml THF i polymerisationsreaktionen kolben (se figur 1) under nitrogengas og holde reaktoren under nitrogengas gennem hele polymerisationen.
- Anbring 100 ml rundbundet kolbe i gylle.
- Tilsættes 2 ml (0,27 mmol / ml) i initiatoropløsning i reaktionskolben.
- Injicere den første monomer, 2-methoxystyren (4 ml) til reaktionskolben.
- Tillade reaktionen at forløbe i 40 min.
- Tilsæt 1 ml af den anden monomer, ethylenoxid.
- Tillade polymerisering at fortsætte ved stuetemperatur i to dage.
- Bringe polymeren med HCl (6 M) / methanol (1/20, vol / vol).
- Renses polymeren ved udfældning i hexaner og tørre polymer i en vakuumovn.
- Karakterisere polymer under anvendelse af NMR.
2. Funktionalisering af α, ω-dihydroxyl polymer med N-2 ,4-DNP-Ε-aminokapronsyre fås den funktionelle Polymis, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- I en trehalset kolbe, placere α, ω-dihydroxyl polymer (0,05 mmol), N-2 ,4-DNP-E-aminocapronsyre (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) og DMAP (0,005 mmol) og tørre på vakuumledning i 4 timer.
- Destillere tør dichlormethan (10 ml) til kolben.
- Slip vakuum under nitrogen og omrøres reaktionen i 12 timer ved stuetemperatur.
- Filter reaktionsblanding og genvinde polymeren ved udfældning to gange i hexaner og methanol.
- Dry udfældede polymer i en vakuumovn ved 40 ° C.
- Bestem den polymere struktur og funktionalitet ved FT-IR og 1H-NMR.
3. Fremstilling af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT opløsning Electrospinning
- Opløses 20 vægt% af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP i chlorbenzen.
- Opløses 20 vægt% og 40 vægt% af polystyren (MW 800.000) i chlorbenzen til fremstilling af to opløsninger. Den højere molekylvægt polystyren anvendes til stigendee polymerkæde-kædesammenfiltring og opnå den optimale viskositet kræves til electrospinning.
- Bland de polymere opløsninger fremstillet i 3.1 og 3.2 sammen til dannelse af 1:1 og 1:2 forhold af polymererne og tilsæt 1 w% Single væg kulstofnanorør (SWCNT) til blandingen og omrøres natten over for jævn fordeling af CNTs.
4. Electrospinning af Polymer-CNT Composite
- Saml electrospinning opstilles som vist i figur 2. I højre side af figuren er Glassman højspændingskilde. Desuden er det en retort stativ, hvor siliciumskiven er fastgjort. Til venstre er en anden retort stå på hvilken sprøjten er monteret og bag det er lampen til at visualisere proceduren, som den skrider frem.
- Ved hjælp af en injektionssprøjte, udtages en lille mængde af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT blanding (ca. 1 ml) og montere den hypodermiske sprøjte på retorten stativ.
- En silicium wafer er mounted tværs fra sprøjten fast i en afstand på 10 cm, og jordklemmen af højspændingskilden er knyttet til den.
- Sæt klemmen forsynet med høj spænding, der skal anvendes til nålen på sprøjten, trykkes stemplet lidt (til at suspendere en dråbe på nålespidsen), og på dette tidspunkt, er electrospinning klar.
- Tænd for højspændingskilden og justere spænding meter til 10 kV. Afhængigt af arten af polymererne i det sammensatte, kan højere spænding er påkrævet, specielt hvis nanofibers under hundrede nanometer i diameter ønskes.
- Afmontér silicium wafer og sted i ekssikkatoren natten over for at tørre helt.
5. Karakterisering af nanofibers
- Første billeder af nanofibers sker med optisk mikroskop til at observere de overordnede perspektiver for fibrene.
- Udnytte Scanning Electron Microscope at observere finere detaljer som morfologi, diameter, gennemsnitlig porestørrelse, etc.
- Carryuden yderligere billeddannelse med en Atomic Force Microscope at observere 3-D topografi af fibre, osv.
6. Bindingsspecificitet af nanofibers med anti-DNP IgE Protein
- Der fremstilles en opløsning af 4 ug / l fluorescensmærket, FITC-IgE (Fluorescein Isothio-cyanat-Immunoglobulin E) i PBS-BSA (phosphatbufret saltvand-bovint serumalbumin)-opløsning.
- Læg et lille stykke silicium wafer, hvor der er nanofibers på en Mattek godt dækglas. Inkubér nanofibers i denne opløsning i en time. Inkubation sker ved forsigtigt at pipettere ud, 10 ul IgE opløsning på siliciumskiven.
- Efter inkubation fjernes ubundet IgE ved at vaske prøven tre gange med PBS-BSA-puffer-opløsning. The PBS-opløsning dispenseres let på væggen af Mattek skålen, for at undgå at sprøjte pufferen direkte på nanofibers. Swirl skålen forsigtigt i hånden, for at distribuere buffer løsning på nanofibers. Fjern forsigtigt puffer med en pipette og retørv denne to gange mere.
- Til kontrol inkuberes nanofibers i fluorescensmærket IgG (ikke-specifik for DNP) under samme betingelser.
- Visualisere de bundne fibre med et konfokalt mikroskop for at observere binding med IgE. For vores undersøgelse, var den anvendte mikroskop Leica konfokal TCS SP2 med 63x linse.
7. Strøm-spænding Behavior af nanofibers
- Tilslut to mikro manipulatorer til en meget lav strøm kilde som Keithley 6430 følsom sourcemeter. Den sat op til bestemmelse af aktuelle spænding opførsel er vist i figur 3.. Denne figur viser Probe station anvendes til at bestemme de første IV karakteristika nanofibers. Det består af Bausch and Lomb MicroZoom Microscope, en Vacuum Chuck Stage, og fire Micropositioners anvendes probning. Øverst til højre er Agilent 34405A digitalt multimeter, til måling af spænding og under det er den Keithley 6430 Sub-Femtoamp fjernbetjening Source Meter bruges til at købe lave strømme, der var input til fibrene.
- Montere sonden arme mikro svejseborde i fibermåtten på modstående sider med spidserne berører fibrene.
- Tilslut yderligere to mikro manipulatorer til en digital multimeter, montere sonden arme ind imellem de to andre og lande de tips om fibermåtten. Sørg for, at de fire spidser er så collinear som muligt.
- Input varierende mængder af strøm fra Keithley (typisk i nanoamps interval).
- Måle spændingsfaldet over de yderste spidser, for hver fremskaffede størrelsen af strøm.
- Plotte disse værdier vil indikere type enhed fibermåtten fungerer som.
8. Repræsentative resultater
Funktionel polymer
"> Fremgangsmåden til syntese af α, ω-bi [2,4-dinitrophenyl capronsyre] [poly (ethylenoxid)-b-poly (2-methoxystyren)-b-poly (ethylenoxid)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) er vist i fig. 4. 1. struktur funktionelle polymer blev bekræftet ved FT-IR (fig. 5) og 500 MHz 1H-NMR spektroskopi (figur 6). FT-IR viser den fuldstændige forsvinden -OH bred absorption omkring 3500 cm-1 indikerer kvantitativt funktionalisering med CDNP gruppen. Dette bekræftes også af NMR-spektret er vist i fig. 6. Ved hjælp af integrationen af toppene i NMR-spektret, blev det bestemt, at CDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNP polymerer er kvantitativt funktionaliseres.Nanofibers
I figur 7 er en måtte af ledende nanofibers opnået ved electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT fra chlorbenzen shselv. Konfokale opnåede billeder viste, at proteinet IgE binder med DNP på fiberoverfladen. 3. Dette er en indikation af specificiteten af binding af Electrospun DNP-polymerer mod IgE-antistof. Lysintensiteten er en indikator for tilstedeværelsen af IgE på nanofibers som proteinet fluorescerende er markeret.
Figur 8a er et AFM (Atomic Force Microscope) billede af en nanofibers opnået ved denne proces og 8b viser den dimension af denne særlige nanofiber er omkring 150 nm i diameter. Ved denne fremgangsmåde fibre mellem 100-700 nm opnås. På dette nuværende tidspunkt er det en udfordring at fremstille fibre med en bestemt dimension. Dette er i overensstemmelse med, hvad der observeres ved andre grupper. 4. Figur 9 viser SEM-billeder af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT nanofibers og diameteren af nanofibers var mellem 200 nm til 300 nm. Der er tre SEM billeder af nanofibers vist ved forskellige forstørrelser. Undersøgelse af de tre billeder viser morfologier af fibrene er lineære og beaded. Det overordnede mål er at forberede fibre, som for det meste lineær. Figur 10 viser IV plot af måtter af nanofibers fremstillet ud fra CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT. Plottet viser adfærden af en modstand (Ohmsk). Når antigenet er bundet til nanofibers, forventer vi at se en ændring i IV opførsel af fibermåtten, som denne ændring i modstand er en egenskab, som tyder på, at de funktionelle fibre har potentiel anvendelse som den aktive bestanddel i sensorer til enkelt molekyle detektion .
Figur 1. Polymerisationsreaktor til syntese af α, ω-dihydroxyl polymer. A) injektionspunktet for strømningen UHP gas nitrogen. B.) indsprøjtningspunktet for opløsningsmidlet, monomeren og initiatoren. C) Reaktionsbeholderen.
Figur 2. Opsætning der anvendes til electrospinning anvendelse af en Glassman højspændingskilde.
Figur 3. Opsætning bruges til at måle IV plots ved hjælp af en Sub-femtoamp fjernbetjening Sourcemeter (Keithley).
Fig. 4. A). Syntetisk fremgangsmåde til fremstilling af OH-PEO-P2MS-PEO-OH polymerer. B) Funktionalisering af α, ω-dihydroxy [poly (ethylenoxid)-b-poly (2-methoxystyren)-b-poly (ethylenoxid)].
Figur 5. FT-IR-spektre af (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, forløber for CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP og (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figur 6. 500 MHz proton-NMR af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Fig. 7. A) Binding billede af FITC-IgE med CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibre Electrospun fra chlorbenzen. B) konfokalt mikroskop billede af kontrollen (nanofibers med IgG).
Fig. 8. A) AFM image CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibers Electrospun fra chlorbenzen og B) AFM profil dvs dimension af en fiber vist i figur 5a.
Figur 9. SEM billeder af CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT nanofibers.
Figur 10. IV plot af måtter af nanofibers fremstillet ud fra CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport har vi præsenteret en stærk tilgang til fremstilling biofunctional nanofibers. De nanofibers er indrettede til en funktionel gruppe, der er specifik for en model protein. Proceduren og tilgang rapporteret i denne meddelelse er af generel karakter og kan anvendes til fremstilling af nanofibers dekoreret med nogen funktionel ønskede gruppe. Den anioniske levende polymerisation er kraftfuld metode til at syntetisere kontrollerede polymerstrukturer kovalent forbundet til et vilkårligt antal interessante funktionelle eller funktionelle grupper, som er specifikke for bestemte biomarkører af interesse. Anionisk levende polymerisation er veletableret for monomeren 2-methoxystyren. 2 electrospinning er en alsidig teknik i at fiberen dimensioner kan let styres ved at ændre spænding og også varierende koncentration af opløsningen for at være Electrospun. Fem nanofibers viser resistive IV adfærd og dermed er lovende til at fungere som aktive bestanddele ibiosensorer, dvs den rapporterede fremgangsmåde det lover godt for udviklingen af biomarkør detektor. 6,7
Polymerisationen af den første monomer, 2-methoxystyren, er 100% fuldstændig i løbet af 40 min dvs. 100% af monomeren omdannes til polymer, og den anden monomer polymerisationen er langsom krav 2 dage at polymerisere. Det vil sige, monomer en polymeriserer hurtigere end monomer 2. Der er ikke nogen ubrugt monomer én, men udgangen af den 2 dage, er der en ubrugt monomer men det vil ikke bidrage til polydispersitet. Vi har fremstillet homopolymerer af den første monomer, dvs poly (2-methoxystyren) og PDI af disse polymere er omkring 1,2 og også blokcopolymererne rapporteret her er også 1.2. Så vidt vi ved, er ingen undersøgelse er foretaget, der ser på effekten af PDI på dimensionen af Electrospun fibre, men det er normalt forventes at lav PDI bidrage til bedre kvalitet forarbejdet produkt på grund af hensyn til cHain-kæde sammenfiltringer.
Vi brugte SWCNTs grund af tidligere arbejde, som viser, at poly2-methoxystyren er effektiv indpakning omkring kulstof nanorør og bryde i byområdet SWCNT. 8 Vi tror, at dette har noget at gøre med den specifikke størrelse af de SWCNTs. Endelig 1% SWCNT indhold i fibre medfører som er tilstrækkeligt elektroaktive for vores undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF HRD-0630456, en NSF CREST Program og NSF er DMR-0.934.142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
