Summary
Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.
Abstract
Norovirus humanos son responsables de la mayoría de los casos de gastroenteritis humana (GE) en todo el mundo y son un problema recurrente en los entornos en los que cerca de persona a persona de contacto no pueden ser evitados 1, 2. Durante los últimos años un aumento en la incidencia de los brotes en hospitales se ha informado, causando trastornos significativos en su capacidad operativa, así como grandes pérdidas económicas. La identificación de nuevos enfoques antivirales se ha limitado debido a la incapacidad de los norovirus humanos para completar una infección productiva en cultivo celular 3. El aislamiento reciente de un norovirus murino (MNV), estrechamente relacionado con el norovirus humanos 4, pero que se puede propagar en las células 5 ha abierto nuevas vías para la investigación de estos patógenos 6, 7.
MNV resultados de replicación en la síntesis de nuevo genómico sentido positivo y moléculas de ARN subgenómico, el último de los cuales corresponde a la última thiRD del genoma viral (Figura 1). MNV contiene cuatro diferentes marcos de lectura abierta (ORF), de los cuales ORF1 ocupa la mayor parte del genoma y codifica siete proteínas no estructurales (NS1-7) liberados de un precursor de poliproteína. ORF2 y ORF3 están contenidas dentro de la región subgenómico ARN y codificar las proteínas de la cápside (VP1 y VP2, respectivamente) (Figura 1). Recientemente, hemos identificado que ORF4 adicional superposición ORF2, pero en un marco de lectura diferente es funcional y codifica para un factor de virulencia mitocondrial localizada (VF1) 8.
La replicación de los virus de ARN de sentido positivo, incluyendo los norovirus, tiene lugar en el citoplasma que resulta en la síntesis de nuevos niveladas genomas de ARN. Para promover la traducción viral, los virus explotan diferentes estrategias dirigidas a la contratación de la maquinaria de síntesis proteica celular 11.9. Curiosamente, la traducción norovirus es impulsado por el multifuncional proteína viral-cebador VPgcovalentemente al extremo 5 'final de ambos RNAs genómicos y subgenómico 12-14. Este mecanismo sofisticado de la traducción es probable que sea un factor importante en la eficiencia limitada de recuperación viral mediante enfoques convencionales inversa genética.
Aquí mostramos dos estrategias diferentes en función de la generación de norovirus murino-1 (conocida como la presente MNV) transcripciones de un límite máximo en el extremo 5 '. Uno de los métodos implica tanto en la síntesis in vitro y la nivelación de ARN viral, mientras que el segundo enfoque implica la transcripción de MNV ADNc en células que expresan la RNA polimerasa T7. La disponibilidad de estos sistemas de genética inversa para el estudio de MNV y un modelo de animal pequeño ha proporcionado una capacidad sin precedentes para diseccionar el papel de las secuencias virales en la replicación y la patogénesis de 15-17.
Protocol
1. La transcripción del ARN y la limitación para la Recuperación de Enfermedades Infecciosas MNV
Este protocolo está diseñado para permitir la recuperación eficiente de MNV infeccioso de cDNA a través de la transcripción in vitro y su posterior recubrimiento in vitro (sección 1.1). Las transcripciones resultantes son luego cubiertos de transfectar células para recuperar infecciosa MNV (secciones 1.2 y 1.3). Este enfoque proporciona el método más sensible para la recuperación de MNV, con rendimientos típicos de más de 10 5 unidades infecciosas por 35 mm de diámetro), los platos de las células de MNV. El protocolo se detalla a continuación:
1.1 Síntesis de las transcripciones infecciosas MNV cubiertas:
- Digerir el plásmido que contiene el cDNA de tipo salvaje MNV (pT7: MNV 3'Rz) con Nhe I para obtener ADN lineal Nhe I reconoce un sitio de restricción único después del extremo 3 'poliA cola de MNV genoma (Figura 2).. Plásmidos linealizados típicamente se purificócon el uso de columnas de sílice (por ejemplo, GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit de GE Healthcare) y se eluyó en H 2 O.
- In vitro transcribir el vector linealizado utilizando ARN polimerasa de T7 como se ha descrito previamente 17. Muchos kits comerciales están disponibles para este propósito y proporcionar un método reproducible de grandes cantidades de síntesis de RNA como Megascript (Life Technologies) y RiboMAX (Promega). Las reacciones de transcripción son típicamente DNAsa digerido antes de su posterior análisis, sin embargo, en muchos casos esto no se requiere como purificaciones de cloruro de litio como se describe a continuación no precipitar el ADN de manera eficiente.
- Analizar una pequeña alícuota de la reacción de transcripción del ARN, típicamente 0,5 l ó menos, por electroforesis en gel de agarosa para asegurar la reacción de transcripción ha trabajado de manera eficiente y ARN es de longitud completa. Mientras que muchos usuarios puede que desee ejecutar desnaturalización geles para dimensionar correctamente el ARN, que suelen utilizar no desnaturalizante en gel de agarosa electrophorESIS como un método rápido para analizar la integridad del RNA. El genoma MNV como la producida a partir del clon de cDNA infeccioso pT7: MNV 3'Rz funcionará a aproximadamente 3 Kbp relativa a una escalera de ADN de doble cadena en un gel no desnaturalizante de agarosa (Figura 3).
- Consideremos que otros métodos están disponibles como una alternativa para obtener un análisis rápido de la integridad del ARN como el uso de un Bioanalyser Agilent (Figura 3).
- Tenga en cuenta que la resolución de gel de los pobres se pueden encontrar si demasiado ARN se carga. Tenga mucho cuidado para asegurar que el gel de agarosa se prepara utilizando ARNasa libre de los reactivos para evitar la degradación del ARN durante la electroforesis, que puede afectar a la resolución banda. Calentamiento ARN a 65 ° C seguido de enfriamiento en hielo también puede ayudar en algunos casos.
- Purificar muestra de ARN para eliminar los nucleótidos no incorporados. Hay muchos métodos disponibles para esta columna, incluyendo los enfoques basados en sílice sin embargo en este protocolo, se suelen utilizar cloruro de litio, como una alternativa rentable. ParaCon este fin, añadir H 2 O para alcanzar un volumen final de 100 l, y luego añadir 40 l de solución de cloruro de precipitación de litio (7,5 M LiCl, 50 mM EDTA, pH 8,0, Ambion) y almacenar la muestra a -20 ° C durante al por lo menos 30 minutos.
- Pellet el ARN por centrifugación a 12.000 xg a 4 ° C durante 15 min.
- Eliminar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar la translúcido ARN precipitado y lavarlo en 150 l de etanol al 70%. Centrifugar el tubo a 12.000 X g a 4 ° C durante 15 min.
- Eliminar el etanol y el aire seco de los ARN, evitando el precipitado se seque por completo ya que esto hará difícil la resuspensión.
- A continuación, volver a suspender las transcripciones de MNV en 50-100 l de solución de almacenamiento de ARN (Ambion). Se debe tener cuidado para asegurar que todos los ARN se ha disuelto adecuadamente. En caso de que el ARN parece difícil de disolver completamente, calentando la muestra a 60 ° C puede ayudar a que resuspender. Cualquier material insoluble luego se sacará by antes de ARN cuantificación centrifugación. Las transcripciones purificados se destapó y que requieren una posterior en el paso in vitro limitación de ser infecciosa (Sistema ScriptCap m7G tapado, Biotecnologías Epicentro).
- Cuantificar el RNA por espectrofotometría. Dependiendo de la naturaleza y la escala de la reacción de transcripción, los rendimientos típicos oscilan desde 50 hasta 150 g de ARN por reacción de transcripción 100 l. La integridad de ARN debe ser analizada antes de la reacción tapado por agotando 100-300 ng de muestra en un 1% en gel de agarosa (Figura 3).
- Para mejorar la eficiencia de ARN tapado, calor 60 a 70 g de MNV transcritos de ARN a 65 ° C durante 10 minutos y luego se coloca el tubo inmediatamente en hielo. Este paso puede reducir cualquier efecto inhibidor de la estructura del ARN en la nivelación. Pulso el tubo en una microcentrífuga refrigerada para recoger gotitas formadas durante la etapa de calentamiento.
- Prepare una mezcla de reacción nivelación según lo sugerido por el fabricante (ScriptCap m7GSistema de tapado, Biotecnologías Epicentro). En pocas palabras, añadir 60-70 ug de RNA MNV a un volumen final de reacción de 100 l. La mezcla de reacción puede contener tapado 10 l de 10 x tampón de tamponamiento (500 mM Tris HCl pH 8,0, 60 mM de KCl, 12,5 mM de MgCl 2), 10 l de 10 mM de GTP, 0,5 l de 20 mM de S-adenosil metionina l, 2,5 de Scriptguard (100 unidades), y 4 l de enzima Scriptcap (40 unidades).
- Durante la reacción de configurar, mantener transcripciones de ARN en el hielo para evitar la degradación. Mezclar bien la mezcla de reacción y luego se incuba a 37 ° C durante 1 h. Nótese el tamaño de la reacción puede ser escalado de acuerdo con la cantidad de transcripción tope requerido.
- Purificar el ARN por precipitación LiCl como se explicó anteriormente (véase el punto 1.1.6). Disolver el precipitado en 50 hasta 100 l de solución de almacenamiento de ARN (Ambion) y cuantificar la cantidad de ARN. Típicamente, las muestras de ARN son posteriormente normalizada a 1 g / l. Una vez más, marque todas las que el ARN se ha disuelto adecuadamente. Si no ha sido debidamente disuelto, el calor tque muestra a 60 ° C para permitir su disolución. Eliminar por centrifugación cualquier material insoluble antes de ARN cuantificación.
- Compruebe la integridad del ARN de nuevo antes de proceder a la transfección. Para este objetivo, ejecutar una cantidad de 100-300 ng de muestra en un 1% en gel de agarosa (Figura 3).
1.2 Recuperación de Neon mediada por transfección de ARN en células RAW264.7:
Para la recuperación de los viriones infecciosos MNV en una línea celular permisiva es posible electroporar la transcripción tope MNV en RAW264.7 células por medio de sistema de transfección de neón (Invitrogen). RAW264.7 son células susceptibles a la infección MNV, apoyando múltiples rondas de replicación del virus y la subsiguiente re-infección. Como resultado, los rendimientos típicos se aproximará más de 10 5 unidades infecciosas por ml a 24 horas después de la transfección, pero pico a> 10 7 unidades infecciosas después de 48 horas.
- Un día antes de transfection, semillas RAW264.7 las células en un 50% de confluencia. Típicamente dos matraces T75 de células se requieren para transfecciones 3.
- El día de la transfección, raspar las monocapas de células en el medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) que contenía 10% de suero bovino fetal (FCS), asegurando que genere una suspensión de células individuales por pipeteado repetido.
- Determinar la concentración de células viables en un hemocitómetro con exclusión del azul tripano para etiquetar las células no viables.
- Sedimentar las células a 1.200 X g durante 5 min y se resuspenden en DMEM que contenía 10% de FCS a una concentración final de 8 x 10 6 células / ml.
- Justo antes de la transfección, alícuota de 1 ml de células por transfección y pellets ellos a 1.200 xg durante 2 min. Retire el papel y lavar las células en 500 l de PBS (sin Mg 2 + / Ca 2 +). Gira por las células de nuevo en 1200 X g durante 2 min. Nótese que es aconsejable para mantener las células en DMEM durante tanto tiempo como sea posiblecomo almacenamiento en PBS durante largos períodos de tiempo pueden comprometer la viabilidad celular y la tasa de transfección.
- Quitar PBS de tubos y añadir 130 l de solución de resuspensión (kit de neón sistema de transfección, Invitrogen) a una concentración final de 6 x 10 7 células / ml. Se debe tener cuidado para resuspender las células evitando la formación de burbujas que causan chispas durante la transfección y supervivencia celular compromiso.
- Añadir la cantidad apropiada de transcripción MNV tope a las células (Figura 2), por lo general 1,3 g de tope ARN se añade a 130 l de células resuspendidas y se mezcló suavemente. Luego, recoge 100 l de la mezcla en la punta de 100 l de transfección de neón. Especial cuidado se debe tomar para asegurarse de que no se formen burbujas en la cubeta de electroporación (kit de neón sistema de transfección 100 l punta) ya que esto causará el fracaso del experimento.
- Electroporar las células por medio de un pulso único a 1.700 V para 25 ms, enSuring la ausencia de chispas durante pulsante que indicará la presencia de burbujas en la muestra. En el caso chispas ocurre, desechar la muestra y repetir la transfección. Soltar las células en un tubo Eppendorf conteniendo 1 ml de DMEM libre antibiótico que contiene 10% de FCS. Nota cada punta puede ser reutilizado hasta tres veces con la misma muestra de ARN si un mayor número de células transfectadas se requiere.
- Posteriormente, las células de distribuir el tubo en pozos independientes que contienen una cantidad apropiada de antibiótico precalentado DMEM libre que contiene 10% de FCS. Como una guía general, 150 l de la suspensión de células generada durante el paso 1.2.8 son suficientes para un único pozo de una placa de 24-plato que contiene 0,5 ml de DMEM precalentado, mientras que 300 l son apropiados para un pocillo de una placa 12-plato que contiene 1 ml de DMEM precalentado.
- Se incuban las células a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 24 a 72 horas. Entonces, liberar viriones infecciosos a partir de células por una (o más)congelar y deshielo y determinar título del virus en la muestra utilizando la placa de ensayo o DICT50. Nótese que lisados deben ser eliminadas por centrifugación durante 1-2 minutos a velocidad máxima o por su filtración a través de un filtro de 0,22 micras de poro antes de la titulación. Típicamente, MNV alcanza títulos de alrededor de 1 x 10 6 TCID50/ml menos 24 horas después de la transfección y hasta 1 x 10 9 a 72 horas después de la transfección.
- La presencia y la estabilidad de las mutaciones introducidas en pT7: 3'Rz MNV se determina típicamente por la secuenciación de los virus rescatados después de 2 a 5 pasajes adicionales en RAW264.7 células.
1.3 Recuperación por lipofección en células BHK-21:
Un método más directo y eficaz a menudo cuestan más para la recuperación de MNV infecciosa de las transcripciones de cubiertas es a través de lipofección (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Teniendo en cuenta que RAW264.7 células son difíciles de transfectar el uso de enfoques basados en lípidos que normalmente hacen uso de OTHer fácil para transfectar líneas celulares tales como células BHK-21, que es una línea inmortalizada derivada a partir de fibroblastos de riñón de crías de hamster. Como un método estándar en nuestro laboratorio usamos BSR-T7 células, un derivado de la línea de células BHK-21, como mientras que estas células son fáciles de transfectar y soportar la replicación MNV, carecen de un receptor adecuado para permitir varias rondas de re-infección . Como resultado, el rendimiento de virus generados a partir de este sistema es una indicación de un solo ciclo de replicación del virus. Este enfoque es particularmente útil cuando se examina el efecto de la mutación en el virus de la recuperación, ya que permite múltiples transfecciones se realizaron a un costo reducido sustancialmente en comparación con el Neon transfección mediada y no requiere equipo especializado. Vale la pena señalar que otras líneas de células fácilmente disponibles, tales como riñón embrionario humano 293T también apoyan la recuperación eficiente de las condiciones de MNV de transfección, sin embargo primero debe ser optimizado para garantizar la eficacia en la entrega de ARN.
- TripsinaISE una monocapa de células BHK-21 (o BSR-T7 células), semilla de 7,5 x 10 5 células en un plato de diámetro 35 mm en medio de crecimiento libre de antibióticos y se incuban las células a 37 ° C con 10% de CO 2 durante la noche. Doble de la cantidad de células en cada placa si las transfecciones se han previsto para el mismo día de la siembra, y permitir que las células se adhieran a la placa durante 2-3 horas a 37 ° C con 10% de CO 2. Tenga en cuenta que otras células que son adecuados para este enfoque son las células 293T, las células de carcinoma hepatocelular Huh7 y el mono verde africano células Cos-7.
- Retire el papel de las células y reemplazar con 3 ml de medio fresco sin antibióticos para garantizar la máxima eficiencia de transfección.
- Prepare una mezcla de 2.1 g de transcripción de MNV tope en 100 l de Opti-MEM (Invitrogen) y se mezcla con 4 l de Lipofectamine 2000 previamente mezclada en 100 l de Opti-MEM. Mezclar completamente la muestra con la pipeta hacia arriba y hacia abajo 15 veces. Dejarla mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Añadir los complejos de transfección que contienen transcripciones cubiertas de MNV de forma gota a gota a la monocapa celular y agite suavemente la placa en direcciones perpendiculares.
- Se incuban las células a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 24 a 72 horas. Posteriormente, suelte viriones infecciosos a partir de células por congelación y descongelación y determinar título de virus por ensayo en placa o DICT50. Los rendimientos típicos de alrededor de 1 x 10 6 TCID50/ml se alcanzan.
2. La recuperación directa de MNV infecciosa a partir de cDNA en células que expresan la RNA polimerasa T7
Este protocolo está diseñado para permitir la recuperación de MNV en las células mediante la transcripción de un plásmido acogida infecciosa la secuencia genómica completa de ADNc por una polimerasa de T7 se expresa en las células. Las diferentes líneas de células se puede utilizar para recuperar MNV infecciosa por este enfoque aunque típicamente obtener los mayores rendimientos con BHK-21 y CE BSR-T7LLS 15. Por lo general utilizan BSR-T7, ya que las células crecen más rápido que la línea BHK clon de los padres. Las células se infectaron con la viruela aviar (FPV) que codifica para la RNA polimerasa T7 (FPV-T7) 18 que funciona como un virus auxiliar para conducir la expresión del ARN viral y la recuperación posterior del virus infeccioso (Figura 4). Aunque BSR-T7 células expresan constitutivamente ARN polimerasa de T7, esta expresión no es suficiente para rescatar MNV infecciosa después de la transfección de pT7: MNV 3'Rz en ausencia de ayudante FPV-T7. Mientras que los rendimientos típicos de este sistema son al menos 10 veces menor que las descritas anteriormente, este enfoque proporciona un método rápido de mutantes de detección para permitir la identificación de las mutaciones debilitantes. Normalmente, este método se utilizó por primera vez para evaluar la viabilidad de una construcción de cDNA. En caso de una construcción o bien no producen virus infeccioso o parecen producir el virus a niveles inferiores a la del clon tipo salvaje infeccioso, entonces el ARN basada approaCH descrito anteriormente se lleva a cabo.
- Trypsinise una monocapa de células BHK-21 (o BSR-T7 células) y las semillas de 7,5 x 10 5 células en un plato 35 mm de antibióticos medios de crecimiento libres y se incuban las células a 37 ° C y 10% de CO 2 durante la noche. Añadir el doble de la cantidad de células en cada placa si las transfecciones se han previsto para el mismo día de la siembra, y permitir que las células se adhieran a la placa durante 2-3 horas a 37 ° C y 10% de CO 2.
- Retirar los medios de cultivo de células y añadir 700 l de FPV-T7 a cada pocillo (Figura 4). Una multiplicidad de infección (MOI) de ~ 0,5 PFU por célula, con base en valoraciones en fibroblastos primarios de embriones de pollo, se usa generalmente. Sin embargo vale la pena señalar que la preparación de nuevos virus auxiliar cultiva en fibroblastos primarios son funcionalmente titula para determinar la dosis necesaria para la recuperación eficiente del virus. Los protocolos para la propagación y la titulación del FPV-T7 han sido descritas previamente 18.
- Encubate a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 1 hora para permitir FPV-T7 para infectar las células. A continuación, añadir 2 ml de DMEM libre antibiótico que contiene 10% de FCS y incubar las células durante una hora adicional a 37 ° C y 10% de CO 2 para permitir la expresión de la RNA polimerasa T7.
- Para continuar con la transfección del plásmido infecciosa, en primer lugar retirar los medios de comunicación de las células infectadas, se lava con 2 ml de medio (10% de FCS en DMEM libre de antibiótico), y finalmente cubrir la monocapa celular con 3 ml de medio. Los antibióticos no se deben añadir a los medios, ya que pueden interferir con la eficiencia de Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
- Prepare una mezcla de 1 g de tipo salvaje MNV cDNA plásmido infecciosa (por ejemplo, pT7: MNV 3'Rz) en 100 l de Opti-MEM (Invitrogen) y se mezcla con 4 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) previamente mezclada con 100 l de Opti-MEM (Invitrogen). Mezclar bien la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces y mantener la mezcla en la sala de Temperatura durante 20 minutos.
- La mezcla resultante debe ser transfección añade entonces gota a gota a la monocapa de células y la placa debe ser sacudido suavemente en direcciones perpendiculares.
- Incubar los infectados FPV-T7, MNV plásmido transfección de células a 37 ° C y 10% de CO 2 durante 24 a 72 horas. Las células transfectadas con infecciosa plásmido pT7: MNV 3'Rz normalmente hacen los títulos de 1 x 10 4 a 5 x 10 4 TCID50/ml.
3. Los resultados representativos
Ambas aproximaciones genética inversa son altamente eficientes para la recuperación de MNV infecciosa en cultivo celular como se muestra en la Figura 5. Infecciosas MNV, con títulos superiores a 10 5 TCID50/ml se recuperan en 24 horas después de la transfección de ARN tope MNV en RAW264.7 células. Del mismo modo, la transfección de las enfermedades infecciosas plásmido pT7: MNV 3'Rz en BSR-T7 células previamente infectadas con el ayudante de FPV expresar T7 (FPV-T7) llevó a los títulos virales en gran medida exceeDing 10 4 TCID50/ml (Figura 5). Estos valores título viral obtenidos con el ARN sintéticos y moléculas de ADN son similares a los obtenidos en transfecciones implican naturales VPg ligados ARN aislado a partir de viriones infecciosos en las mismas células (Figura 5). Estos resultados ponen de manifiesto la alta eficacia de los enfoques de genética inversa que se describen aquí para recuperar definidas genéticamente variantes de MNV en cultivo celular.
Figura 1. Ilustración del genoma MNV y el plásmido para la recuperación de virus infeccioso. Una representación, Esquema de MNV genoma organización. Cada proteína región de codificación se ilustra como un cuadro blanco clave. ORF1 se traduce en 7 diferentes proteínas no estructurales (NS1 / 2 a NS7) que se liberan de poliproteína precursora después de auto-procesamiento proteolítico. ORF 2 codifica la principal proteína de la cápside VP1, ORF 3 codifica la tapa menorsid proteínas VP2 y ORF4 superposición con ORF2 región codificante codifica el factor de virulencia VF1. RNAs genómicos y subgenómico contener una cola poliA en sus extremos 3 'de longitud variable. B, plásmido que contiene MNV cDNA utilizado en nuestros enfoques de genética inversa (pT7: MNV 3'Rz). ADNc MNV se fusiona con una cola poli de 26 residuos en su extremo 3 '. La secuencia de ADNc MNV está situado inmediatamente aguas abajo de una secuencia promotora T7 truncada, para permitir T7 impulsado por la transcripción, y aguas arriba de un único sitio Nhe y una secuencia de ADN que codifica para una ribozima auto-escisión después de ella. Estas secuencias son instrumentales para garantizar la terminación de la transcripción de ARN después de la presente cola genómico poliA en el extremo 3 '.
Figura 2. Descripción general del protocolo para la recuperación de enfermedades infecciosas a partir de ARN transcrito MNV y coronó in vitro El plásmido pT7:. MNV 3'Rz se linealiza inmediatamente aguas abajode la secuencia genómica MNV utilizando la enzima de restricción Nhe I (paso 1). Después de la purificación del ADN, MNV transcritos de ARN se generan in vitro utilizando RNA polimerasa de T7 (paso 2). Productos de transcripción que generalmente se ejecuta con una movilidad aparente de 2,5-3Kb en un no desnaturalizante 1% en gel de agarosa (paso 3, Figura 3). La plantilla de ADN se elimina usando una solución a RNasa libre de DNasa. ARN se purifica después de nucleótidos libres por precipitación con LiCl (paso 4). El producto purificado de RNA puede ser entonces in vitro tapado después de haber sido previamente calentada a 65 ° C a desplegarse secundarias estructuras de ARN (pasos 5-6). Después de la purificación por LiCl precipitación, el ARN se transfectaron en células, ya sea RAW264.7 (sistema de neón de la transfección, Invitrogen), o BSR-T7 (células Lipofectamine 2000, Invitrogen) (pasos 7-8). Una vez dentro de la célula, cubiertas de las transcripciones de ARN se traduce a las proteínas virales que catalizan la replicación viral en las transcripciones de nuevas moléculas de ARN MNVque contiene una molécula VPg adecuada en su extremo 5 '. Sucesivos ciclos de replicación viral acompañados de la traducción generaría un gran número de genomas virales que se encapsidado para generar viriones infecciosos. Para facilitar la liberación del virus a partir de células, uno o varios ciclos de congelación y descongelación se realiza (paso 9). Rendimientos virales pueden ser entonces determinada por DICT50 o procedimientos de ensayo de placa.
Figura 3. Análisis de MNV integridad del ARN transcritos a lo largo del protocolo. Una integridad, de MNV de ARN sintetizado in vitro. El plásmido pT7: MNV 3'Rz en primer lugar se linealizado utilizando la enzima de restricción Nhe I. Después de la purificación del ADN, MNV transcritos de ARN se generan in vitro utilizando RNA polimerasa de T7 (carril 2). El ARN es entonces purificación ed de nucleótidos libres por precipitación con LiCl (carril 3). Productos de transcripción se ejecuta en un no desnaturalizante 1% en gel de agarosa en paralelo a 1-Kb escalera de ADN (New England Biolabs, calle 1). Movilidad relativa de los transcritos virales bajo condiciones no desnaturalizantes es similar a un producto ADNbc de 2,5-3 Kb. B, de la integridad del MNV transcripciones de ARN después de tapado. Transcripciones MNV purificados previamente por precipitación con LiCl (carril 2) son sometidos a limitación enzimática (carril 3) y la purificación por precipitación con LiCl (calle 4). C, Análisis de un chip de Agilent 6000 ARN Nano de las transcripciones de MNV (segundo carril) y cubiertas de transcripciones MNV (tercer carril) que han sido previamente precipitado en el LiCl. Una escalera de ssRNA se ejecuta en paralelo.
= "Pdflinebreak"> 
Figura 4. Descripción general del protocolo para la recuperación de MNV infeccioso a partir de cDNA. Inicialmente, BSR-T7 (o BHK) están infectados con un virus de la viruela aviar recombinante (FPV) que expresa el bacteriófago T7 RNA polimerasa (FPV-T7) (paso 1). Las células infectadas se incubaron durante 2 horas antes del tratamiento adicional para permitir la expresión de proteínas que incluye el FPV recombinante ARN polimerasa de T7 (paso 2). Posteriormente, pT7: MNV 3'Rz se transfectaron en las células mediante Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (paso 3). Una vez dentro de la célula, pT7: MNV 3'Rz es reconocido por la RNA polimerasa T7 que sintetiza MNV transcritos de ARN (paso 4). La presencia de un auto-escisión δ-ribozima secuencia en el extremo 3 'del genoma garantiza la transcripción 3' tErminus se encuentra justo después de la cola poli (paso 5). Algunas transcripciones virales se intracelularmente coronada por una enzima FPV tapado (paso 6). Las transcripciones resultantes MNV cubiertas serán traducidos para generar proteínas que catalizan MNV réplica transcripciones MNV. Recién sintetizadas MNV moléculas de ARN que contienen una molécula VPg adecuada en su extremo 5 'se sometería a ciclos sucesivos de replicación acompañados de traducción viral que finalmente puede resultar en la generación de virus infeccioso encapsidado. Para facilitar la liberación del virus a partir de células, uno o varios ciclos de congelación y descongelación se realiza (paso 7). Rendimientos virales pueden ser entonces determinada por DICT50 o procedimientos de ensayo de placa.
Figura 5. Los resultados representativos de los títulos de virus obtenidos a partir de diferentes genética inversa enfoques descritos en el texto. Barras grises representan los títulos de virus obtenidos a las 24 horas después de neón-Transfección de 2 x 10 6 RAW264.7 células, o después de lipo-transfección de 2 x 10 6 BSR-T7 células con transcritos in vitro y nivelada de ARN MNV. Las barras blancas representan el título de virus obtienen típicamente después de lipofección de pT7: MNV 3'Rz (MNV ADNc) en 2 x 10 6 BSR-T7 células infectadas previamente durante 2 horas con el virus de la viruela aviar que expresan recombinante polimerasa T7 (FPV-T7). Como control positivo para la transfección en crudo y BSR T7cells, que suelen utilizar 2 g de ARN extraído de células infectadas con MNV que contengan altos niveles de VPg ligado MNV ARN. Los controles negativos han llevado a cabo ya sea con MNV ARN o pT7: MNV 3'Rz que codifica una mutación frameshift (F / S) que anula la replicación, dando lugar a ningún virus detectable (datos no presentados).
Discussion
Aquí se han puesto de manifiesto dos diferentes enfoques de genética inversa que permiten la recuperación de MNV infecciosa en cultivo celular. Ambos se aproxima efectivamente omitir el requisito absoluto para el ligamiento covalente de VPg al extremo 5 'del genoma viral ARN a través de la generación de cubiertas de transcripciones MNV que luego son reconocidos por los ribosomas celulares. En la transcripción in vitro seguido por enzimáticamente nivelación es más eficiente en la recuperación de MNV infeccioso que la transcripción de los plásmidos infecciosos en las células que expresan la RNA polimerasa T7, en el que las transcripciones puede estar cubierto por las enzimas FPV de tapado. Los títulos de virus recuperados con estos sistemas de ida genética son similares a los obtenidos por transfección de virales VPg ligados ARN purificados a partir de cultivos de células infectadas 17 (Figura 5). La transfección de ARN tope MNV en células permisivas RAW264.7 hace sólo un título vírico 1-registro más bajo que los experimentos que implican la transfection de RNA total de células infectadas contienen viral VPg ligado ARN (Figura 5). Este hecho alienta investigaciones adicionales para determinar si la adición de una molécula VPg al extremo 5 'de los transcritos generados por estos sistemas podrían resultar en rendimientos de virus de aumento, que pueden revelar aspectos funcionales subyacentes infectividad MNV en células asociadas a VPg. Sin embargo, consideramos que este sistema de genética inversa como una alta eficiencia comparable a la de otros virus de ARN de revertir los sistemas de la genética en la actualidad en el cual el ARN transcrito in vitro permite la recuperación de los títulos de sólo 10-100 más bajos que en las infecciones reales con viriones 19, 20.
En general, las metodologías actuales constituyen un importante paso adelante en el campo de la biología molecular de los norovirus y nos proporcionan las herramientas para investigar el papel funcional de las proteínas y los motivos conservados en los genomas de ARN de norovirus. Estos enfoques han sido combinadas con cmodelo de ratón urrent disponibles y han demostrado que el MNV se recuperó de cDNA infeccioso es capaz de causar una infección letal de> 80% STAT1-/ - ratones en menos de 10 días 4, 21. Haciendo uso de este sistema hemos recuperado mutantes viables norovirus murino de la proteína de la cápside y de una zona polypyrimidine implicado en la unión de los diferentes factores del huésped (PTB y PCBP) que muestran un fenotipo atenuado in vivo 21, 22. Además, recientemente se ha demostrado que los virus que carecen de la capacidad de expresar la proteína VF1 de ORF4 eficientemente replicar en cultivo celular, pero de nuevo han reducido la virulencia en ratones con respecto a WT MNV 8. Estos estudios nos animan a diseñar versiones atenuadas de los norovirus humanos basados en estudios de MNV que podrían ser investigados como candidatos potenciales para la vacuna.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por una beca de Wellcome Trust Superior otorgó a Ian Goodfellow, y una beca Marie Curie Intra Europea (7PM Consejo Europeo de Investigación) otorgado a Armando Arias. Nos gustaría dar las gracias a Io Hong Cheong, la Dra. Rebecca Robey y el Dr. Mike Skinner por darnos permiso para usar su Bioanalyser Agilent y ayudar con el funcionamiento de las muestras de ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 | |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
- Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
- Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
- Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
- Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
- McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
- Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
- Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
- Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
- Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
- Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
- Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
- Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
- Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
- Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
- Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
- Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
- Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).
