Summary
Een combinatorische functionele screening methode voor het verkrijgen van inzicht in de effecten van de moleculaire samenstelling van micro-omgevingen op cellulaire functies beschreven. De methode maakt gebruik van bestaande micro-array gebaseerde technologieën voor het genereren van arrays van gedefinieerde combinatorische micro-omgevingen die ondersteuning bieden voor celadhesie en functionele analyse.
Abstract
De interacties tussen cellen en hun omgeving micro-omgeving hebben functionele gevolgen voor cellulaire gedrag. Op enkele cel kunnen verschillende micro-omgevingen opleggen differentiatie, migratie en proliferatie fenotypes en op weefselniveau de micro verwerkt complex als morfogenese en tumorigenese 1. Niet alleen de cel en moleculaire inhoud van micro-omgevingen invloed hebben op de cellen binnen, maar dat doen de elasticiteit 2 en geometrie 3 van het weefsel. Gedefinieerd als de som van cel-cel-ECM en oplosbare factor interacties, in aanvulling op fysieke kenmerken, is het micro complex. Het fenotype van cellen in een weefsel gedeeltelijk vanwege hun genomische inhoud en mede door de combinatorische interacties met de microenviroment. Een belangrijke uitdaging is om specifieke combinaties van microenvironmental componenten verbinden met onderscheidende gedrag.
ent "> Hier geven we de micro microarray (MEArray) platform voor cel-gebaseerde functionele screening van combinatorische interactie met micro-omgevingen 4. Werkwijze maakt gelijktijdig regelen van de moleculaire samenstelling en de elastische modulus, en combineert de van veelgebruikte microarray en micropatterning technologieën. MEArray schermen moet zo weinig 10.000 cellen per array, welke functionele studies van zeldzame celtypen zoals volwassen stamcellen vergemakkelijkt. Een beperking van de technologie is dat gehele weefsel micromilieus niet volledig worden samengevat op MEArrays. Uit een vergelijking van reacties in hetzelfde celtype talrijke verwante micromilieus bijvoorbeeld paarsgewijze combinaties van ECM eiwitten die een bepaald weefsel karakteriseren zal inzicht in hoe microenvironmental componenten opwekken weefselspecifieke functionele fenotypes.MEArrays kunnen worden afgedrukt met een groot aantal recombinant growth factoren, cytokines en gezuiverde ECM eiwitten en combinaties daarvan. Het platform wordt alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke reagentia. MEArrays vatbaar zijn voor time-lapsed analyse, maar meestal worden gebruikt voor eindpunt analyse van cellulaire functies die meetbaar met fluorescerende probes. Zo worden DNA synthese, apoptose, verwerving van gedifferentieerde toestanden of productie van specifieke genproducten gewoonlijk gemeten. Kort de basis luchtstroom van een MEArray experiment is bekleed met dia afdrukken substraat te bereiden en de masterplaat van eiwitten die moeten worden afgedrukt bereiden. Dan de arrays zijn bedrukt met een microarray robot worden cellen mogen hechten, in cultuur groeien en vervolgens chemisch gefixeerd bij het bereiken van de experimentele eindpunt. Fluorescerende of colorimetrische testen, afgebeeld met traditionele microscopen of microarray scanners, gebruikt om relevante moleculaire en cellulaire fenotypes (figuur 1) tonen.
Protocol
1. Afdrukken Substrata Voorbereiding
De beslissing om polydimethylsiloxaan (PDMS) bekleed of polyacrylamide (PA)-gecoate glaasjes hangt af van de belangrijke parameters van de experimentele design. De elasticiteitsmodulus beide polymeren kan worden afgestemd op de stijfheid van verschillende weefsels na te bootsen door het veranderen van de base / genezing verhouding van PDMS en acrylamide / bis-acrylamide verhouding PA. PDMS kan nabootsen stijver weefsel in het gebied van 1-10MPa (bijvoorbeeld kraakbeen, cornea en arteriële wanden) en PA kunnen zachtere weefsels nabootsen in het gebied van 100 Pa-100 kPa (bijvoorbeeld borstkanker, hersenen, lever, prostaat en) 5. PDMS is goedkoop, gemakkelijk te bereiden, en de geometrie van de gedrukte functies identiek zijn aan het hoofd van de gedrukte pennen. Dus de grootte en vorm van de functies kunnen nauwkeurig worden geregeld met pennen met verschillende geometrieën tip. PDMS meer hydrofoob is dan PA, waardoor bepaalde problemen tijdens de cel behandeling en immunoste handhaven stappen en niet compatibel met sommige cellijnen. Omdat PA is een hydrogel en een natief aangroeiloze oppervlak zal hechten aan cellen alleen plaatsen waar eiwitten die steun celadhesie. De geometrie van de gedrukte functies van PA gels niet exact volgen de geometrie van de pinhead, meestal ze cirkels door diffusie, ongeacht de pinhead geometrie gebruikt. Printing contacttijd en pin diameter parameters kan empirisch worden bepaald voor optimale feature size on PA gels.
Polydimethylsiloxaan (PDMS)
- In een wegwerp plastic beker combineren Sylgard 184 silicone elastomeer basis met verharder in een 10:1 verhouding krachtig mengen met een houten of kunststof tongdepressor waarna wordt ontgast in een kamertemperatuur vacuumklok gedurende 30 minuten.
- Center een standaard microscoopglaasje op de vacuüm aangedreven as met een spin coater, en besprenkel 0,5 ml van de gemengde elastomeer polymeer op het midden van het glijvlak. Spin op6000 rpm gedurende 60 sec.
- Hard de PDMS-gecoate glaasjes in een 70 ° C oven of een digitale verwarmingsplaat (stofvrije) gedurende 4 uur tot 's nachts.
- Uitgeharde dia's kunnen onmiddellijk worden gebruikt, of worden opgeslagen voor enkele maanden in een dia doos die is verzegeld in een plastic hersluitbaar zakje en bewaard in een lade. De PDMS trekt stof dus het moet goed worden beschermd tegen kamer luchtcirculatie.
- Opmerking: Nitril of andere niet-latex handschoenen te dragen bij het werken met de PDMS elastomeer kit. Incidenteel contact met latex handschoenen zal remmen PDMS polymerisatie.
Polyacrylamide (PA)
- NaOH etsen: Plaats de glaasjes op warmte blok bij 80 ° C. Voeg 1 ml 0,1 N NaOH op elke dia, en zorg ervoor dat de volledige dia bedekken. Laat de NaOH verdampen (een witte film moeten vormen op de dia oppervlak). Omdat de PA gel kan alleen stevig bevestigen op NaOH geëtste oppervlakken, zal de PA gel los tijdens het drogen uit stap over als de volledige dia surfaas valt niet onder de NaOH. Als het glijvlak niet volledig bedekt, herhaalt door 1 ml 0,1 N NaOH. Dia kan vervolgens worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) gedurende enkele dagen. Opmerking: Een alternatief voor NaOH ets is om ozon-of plasma-het reinigen van de dia's.
- 3-Aminopropyltriethoxysilaan (APES) coating: In een zuurkast plaatsvinden dia's in een 15 ml schaal en voeg 300 ul APES op elke NaOH geëtste dia. Laten de apen reageren met NaOH glijdt gedurende 5 minuten. Overschrijding van deze tijd zal leiden tot moeilijkheden bij het uitwassen van niet-gereageerde APES reagens. Spoel APES grondig met gedeïoniseerd water twee tot drie keer aan beide zijden van de schuiven. Als de was onvolledig is, wordt APES oxideren Glutaraldehyde een bruine afzetting op objectglaasjes in stap 1.8 vormen.
- Glutaaraldehyde oxidatie: Zuig alle oplossingen uit de dia oppervlakken. In elk 15 cm schaal Voeg 25 ml 0,5% glutaaraldehyde in PBS. Reageren gedurende 30 minuten in een donkere omgeving. Na 30 minuten zuigen alle glutaraldehyde en gebruik non-lint arbeidAtory doekjes (bv. Kimwipes) zorgvuldig Droog de glaasjes. Dia's kunnen vervolgens worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende een dag.
- Gelbereiding: Na bereiding van PA mengsels zoals acrylamide, bis-acrylamide en ddH 2 O in overeenstemming met onderstaande tabel ontgas gedurende 30 min en PA mengsels op ijs te vertragen polymerisatie. Voeg APS en TEMED toe en meng goed vlak voor het maken van de gels. Pipet PA mengsels op de glijvlakken en plaats 24 mm x 50 mm, nummer 1 dekglaasjes bovenop de PA. Druk niet te dekglaasje en glasplaatje samen en zonder blaasjes vorming. Voor gels> 40.000 Pa gebruiken 100 pl van andere gels 350 pl.
| Gewenste modulus (Pa) | Acrylamide% | Bis-acrylamide% | Acrylamide van 40% voorraad (ml) | Bis-Acrylamide van 2% voorraad (ml) | Gedeïoniseerd water (ml) | APS (pl) | TEMED (pl) |
| 480 ± 160 3 | 0,06 | 0,75 | 0,3 | 8,95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0,15 | 1,25 | 0,75 | 8 | 100 | 10 |
| 40.400 ± 2390 | 8 | 0,48 | 2 | 2,4 | 5,6 | 100 | 10 |
Aangepast van 6,7.
- Laat de PA gel polymeriseren gedurende 2 uur, en daarna dekglaasjes te verwijderen onder gedeïoniseerd water.
- Was de PA gel dia's in grote potten Coplan een nacht in water (~ 8 uur) om niet-gereageerde acrylamiden te verwijderen.
- Droge glaasjes in een 37 ° C oven gedurende 2-4 uur of totdat PA gel verhardt volledig.
- PA gel-dia kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand in een gesloten box dia.
2. Protein Master Plate Bereiding
- Alle eiwitten should worden gealiquoteerd in voorraad 10X oplossingen in de buffers aanbevolen door de provider en opgeslagen bij -80 ° C. De meeste ECM eiwitten oplosbaar in gedeïoniseerd water, maar de pH kan aangepast worden met druppels azijnzuur. Meeste groeifactoren, cytokines en recombinante receptor extracellulaire domeinen worden bereid in PBS met BSA, maar fabrikant omstandigheden variëren. Filter het eiwit aliquots door een 0,45 urn 4 mm nylon spuitfilter (Nalgene) voor de opslag.
- Ontwerp een meester plaat in overeenstemming met de gewenste eiwit combinaties en verdunningen. Adherente cellen gewoonlijk afhankelijk van de aanwezigheid van ten minste een compatibel ECM om celhechting mediëren, maar antilichamen tegen epitopen celoppervlak kan soms bemiddelen bijlage. Het is een goed idee om vrije FITC kleurstof of een fluorphore-geconjugeerde eiwit aan minstens een putje zodat arrays kunnen later gemakkelijk georiënteerd.
- Bereid de meester plaat door verdunning van het eiwit combinaties met afdrukken buffer bestaat uit 100 mMTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5,2. Typisch elk putje van een 384-wells plaat niet meer dan 10 gl.
- Noteer de inhoud van elk putje in elke master plaat in een door tabs gescheiden database bestand en geef elke master plaat met een uniek identificatienummer. Een zes-cijferige datum, gevolgd door de initialen van de ontwerper vaak dient het doel (MMDDYYinitial). Omdat de volumes ook klein zijn, kunnen eiwitten aliquots efficiënt worden gebruikt voor een groot aantal herhaalde platen genereren. Het wordt aanbevolen moederplaten opgeslagen bij -80 ° C en elke masterplaat moeten ondergaan niet meer dan twee vries-dooi cycli.
3. MEArray afdrukken
- MEArrays kunnen worden afgedrukt met de meeste conventionele microarray afdrukken robots. Quill pen printers die siliconen of roestvrij stalen pinnen te gebruiken goed werken, maar eiwit viscositeit kan problematisch zijn. Capillaire printers zijn ideaal microarray afdrukken robots voor deze toepassing, als ze werkenGoed met viskeuze eiwitoplossingen.
- Om een goede statistische power te bereiken binnen een array, is 10 tot 12 repliceren plekken van elk micro-omgeving aan te bevelen. Een dergelijk ontwerp zal een vergelijking van de activiteit in een micro opzichte van een ander in dezelfde array met eenvoudige T-test statistieken. Dunnette's test kan worden gebruikt om de activiteit te vergelijken in een besturingselement omgeving met andere micro-omgevingen. Dit ontwerp werkt het beste als een functionele fenotype is geassocieerd met de controle micro voordat de MEArray experimenten.
- Luchtvochtigheid moet worden gehandhaafd rond de 50%. Vochtigheid is van belang vanwege een lage luchtvochtigheid kan drogen de oplossing in de pinnen of in de putjes van de masterplaat waardoor inefficiënte afzetting op de grafische substraten. Vochtigheid kan effectief gecontroleerd worden door draperen de robot met niet-poreus plastic zeilen en het gebruik van zowel een luchtbevochtiger en een de-luchtbevochtiger ingesteld op 50% luchtvochtigheid te handhaven. Afgekoeld afdrukken plattens kan USEFul voor het conserveren sommige eiwitten, maar voorzichtigheid moeten worden genomen om condensatie te voorkomen vorming van de dia.
- Elke afgedrukte array worden geëtiketteerd met vriesvak-proof slide labels gecodeerd met een serienummer dat bestaat uit identificatie van de meester plaat, gevolgd door een getal van drie cijfers (MMDDYYinitial-nnn). Zoals elk array wordt gebruikt of verspreid, moeten de details van de experimentele behandelingen worden gehandhaafd in een database. Volgen de data van afdrukken en het aantal vries-dooi cycli van de moederplaten helpt om de optimale voorwaarden voor handhaving reproduceerbaarheid identificeren.
- Afgedrukte MEArrays dient in verzegelde dozen dia bij -20 ° C gedurende niet langer dan een maand. Reproduceerbaarheid merkbaar af te nemen daarna.
4. Het kweken van zoogdiercellen op MEArrays voor functionele analyse
- Bevestig cultuur kamers: Om het volume van de media en het aantal cellen gewenste cultuur op de MEArrays te beperken, een kunststof kamer is fitted te omringen de gedrukte array. Voor veel arrays kan een kamer van een 2-kamer slide (Nunc) met een oppervlakte van 4,2 cm 2 bevat worden gebruikt. Verwijder de kamers van de vervaardigde kamer glijbaan en snijd de kamers in de helft met een scheermesje. Met een 3 ml spuit met een dunne strook aquarium silicone (DAP) van toepassing op de rand van een kamer en druk op het oppervlak van een MEArray. Vermijd het plaatsen van de toegepaste aquarium siliconen kamer op de array functies.
- Blokkeren en spoelen: MEArrays moeten goed gespoeld om niet-gereageerde monomeren, die giftig zijn voor cellen te verwijderen. Als PDMS-gecoate glaasjes werden vervolgens in de gebieden tussen de gedrukte kenmerken eerst worden geblokkeerd met een aangroeiloze coating om celhechting te voorkomen, incuberen van de arrays in 1% Pluronic F108 (BASF) in water of 2% BSA in water gedurende 15 minuten onder vacuüm. PA gel dia's niet nodig een blokkerende stap. In alle gevallen spoel arrays met celkweekmedia drie keer vijf minuten (media keuze hangtvan de gebruikte cellen, maar gebruik van antibiotica ongeacht media of cellen aanbevolen). PA gels extra 30 min incubatie in de media gel hydrateren.
- Celhechting: Vier tot vijf arrays kunnen passen binnen een enkele 15 cm steriele petrischaal. Bedek de petrischaal met een deksel om de arrays steriel. Voeg de helft van het uiteindelijke volume van de media MEArray door toevoeging van de cellen in medium tot een eindconcentratie van 10.000 tot 1.000.000 cellen / ml. Cellen hechten aan de gedrukte functies met verschillende snelheden afhankelijk van de samenstelling van de gedrukte micromilieu. Controleer op uniforme bevestiging door het bekijken van de arrays door middel van een omgekeerde fase microscoop in 15 tot 20 minuten intervallen. Door zachtjes schudden MEArrays heen en weer kunnen cellen verbonden in een patroon wijze worden onderscheiden van de drijvende, losse cellen.
- Verwijdering van ongebonden cellen: On PA-coated MEArrays, de ongebonden cellen kunnen worden opgezogen en de media kunnen worden vervangen door een geschikt volume worden. Op PDMS-coated MEArrays kan de media nooit helemaal uit de put omdat de cellen uitdrogen en sterven bijna onmiddellijk. Dus op PDMS beklede MEArrays moet het ongebonden cellen worden verwijderd door een proces van opeenvolgende uitwisseling van de helft van het volume van media tot alle ongebonden cellen worden verwijderd, zoals bepaald door microscopische inspectie. De de-wetting effect van PDMS minder prominent bij serumbevattende media gebruikt vergeleken met gedefinieerde media en wanneer BSA wordt gebruikt om de bedrukte zones in vergelijking met Pluronics F108 blokkeren.
- Cellen kunnen worden gekweekt op MEArrays geplaatst in van 15 cm petrischaaltjes gedurende vele dagen met normale media veranderingen. Media wijzigingen op PDMS dia's moet worden gedaan met de opeenvolgende wijzigingen van de helft van de media volume.
- Gemeenschappelijke fixatieven, zoals paraformaldehyde en methanol / aceton verenigbaar zijn met MEArray systemen. Wanneer kleuring cellen PA beklede MEArrays kan fixeermiddelen worden toegevoegd en weggespoeld zoals ze in een conventionele kleuringswerkwijze.Echter wanneer gekleurde cellen op PDMS beklede MEArrays moet het oppervlak vochtig blijven ook tijdens de fixatie. Zuig de helft van de media en te vervangen door een fixeermiddel. Herhaal dit proces een aantal keren totdat het putje wordt gevuld met een meerderheid van fixeermiddel. Na fixatie wordt het fixeermiddel geleidelijk vervangen op dezelfde wijze met blokkerende buffer die geschikt is voor de volgende stap van de analyse.
- Immunokleuring wordt vaak gebruikt om cellulaire functies te analyseren. Kleuring routines zal variëren, maar bij werkzaamheden aan de PDMS MEArrays, moet men elke wassen en aspiratie stap zoals hierboven uit te voeren, geleidelijk aan het veranderen van de oplossingen en nooit toestaan het oppervlak de-nat. De-wetting zal artefacten in kleuring.
- De kamers kunnen worden verwijderd met behulp van een scheermesje. Dekglaasjes worden gemonteerd bovenop gekleurd met MEArrays Fluoromount-G (Southern Biotech). Detectie kan worden uitgevoerd met de meeste meerkleuren fluorescentie microarray scanners of op confocale microscopen met gemotoriseerdebetegelde beeldacquisitie modi.
5. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van gevormde eiwit depositie op een gedrukte PDMS-vrijlopen MEArray met een vierkante tip silicium kunnen op een schacht pin microarray-printing robot wordt getoond in Figuur 2. Depositie van verschillende eiwitten die afgedrukt kan worden geverifieerd door immunofluorescentie met behulp van antilichamen (Figuur 2A). Verdunningen van het eiwit oplossingen in de masterplaat zijn representatief voor de hoeveelheid (fluorescentie-intensiteit) die wordt afgezet op het substraat afdrukken (figuur 2B). Cellen moeten hechten aan de gedrukte functies in een duidelijke patroon wijze (Figuur 2C).
Een voorbeeld van een MEArray experiment blijkt dat inverse verdunningen van twee eiwitten die specifiek micro keratine expressieprofielen opgewekt in een eiwitconcentratie-afhankelijke wijze in een menselijke mammaire epitheliale p multipotenterogenitor cellijn (D920 cellen), wordt getoond in Figuur 3. Bubble percelen zijn handig voor het bepalen of specifieke fenotypes worden opgelegd aan cellen op repliceren kenmerken van een verdunningsreeks. Als bijvoorbeeld een bepaald molecuul in een micro veroorzaakt een duidelijke fenotype, wanneer de leerzame component is voldoende verdund in een achtergrond van een neutrale ECM het fenotype te veranderen of verdwijnen. Immunofluorescentie detectie van keratine 8 en keratine 14 intermediaire filament eiwitten werd uitgevoerd met een Axon 4200a (Molecular Devices) microarray scanner. Twaalf repliceren verdunningsreeks werden gedrukt op elke MEArray, en de log 2 verhouding van keratine 8 tot en met keratine 14 gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd getekend als een zeepbel complot om een realistisch beeld van variatie en reproduceerbaarheid van het signaal te geven. Getoond wordt data van een MEArray die is vastgesteld nadat de cellen waren bevestigd en ongebonden cellen werden weggewassen (figuur 3A), en na 24 uur van culture (Figuur 3B). Voor deze relatief kleine analyse werd een one-way ANOVA gebruikt om af van het gemiddelde signaal te bepalen op elk tijdstip, en gegroepeerd tweezijdige T-tests werden gebruikt om te bepalen of de verschillende verdunningen van type I collageen en recombinant humaan P- cadherine, veranderingen in expressie keratine. Er was geen verandering van het gemiddelde tussen cellen van de kenmerken net na bevestiging, maar er significante verschillen in expressie tussen keratine cellen na 24 uur blootstelling aan de verschillende micro-omgevingen. T-tests gecontroleerd of hoge type I collageen concentraties opgewekt hoger keratine 8 uitdrukking, terwijl hoge P-cadherine concentraties wekte een sterke keratine 14 signaal na 24 uur. Dit resultaat was in overeenstemming met eerdere berichten dat P-cadherine-bevattende micro-omgevingen zullen van K14-expressie myo fenotype op te leggen aan bi-krachtige borst progenitorcellen 4.
Een voorbeeld van een volledig scanned MEArray gedrukt op 40.000 Pa PA gel is weergegeven in figuur 4.
Figuur 1. Een stroomschema van de procedure MEArray. Eerst worden de afdrukken substraat zijn opgesteld met PDMS of PA. Ten tweede, de meester platen zijn bereid en geannoteerd in een database. Ten derde worden de MEArrays gedrukt en gecodeerd met serienummers. Vierde cultuur kamers zijn verbonden, oppervlakken blokken en / of gespoeld, vervolgens cellen mogen hechten en ongebonden cellen weggewassen. Ten vijfde kunnen cellen worden behandeld met kleuring of bio-assay na een incubatietijd gebaseerd op experimentele design. Ten slotte kan Beelden van MEArray worden verkregen en geanalyseerd met geschikte scanner en software.
Figuur 2. Deposslagen stand en relatieve overvloed van gedrukte eiwitten kan worden geverifieerd met immunokleuring voor celhechting. A) antilichamen die type IV collageen erkend en laminine-111 werden gebruikt om hun aanwezigheid in gedrukte functies van een MEArray verifiëren. B) Met een gemiddelde pixelintensiteit analyse functie in NIH ImageJ software, de relatieve hoeveelheden van de twee eiwitten in een serie verdunningen, uitgaande van een 200 pg / ml eiwitoplossing, kwalitatief kan worden beoordeeld. C) Fase micrograaf D920 cellen aan vierkant kenmerken van een gedrukte PDMS bekleed MEArray.
Figuur 3. Een voorbeeld van een analyse met behulp MEArray veranderingen in keratine expressie in een multipotente progenitor cellijn als functie van de tijd en micromilieu. Elke bel vormt verhoudingen van keratine 8 en keratine 14 eiwitniveaus 10 tot 15 cellen aan een featuur in een MEArray. Expressie werd bepaald met immunofluorescentie probes. A) toont de keratine's in cellen net na hechting en B) toont de keratine's na 24 uur van een array die werd uitgeplaat in parallel. De maximale concentratie van beide eiwitten was 200 ug / ml verdund en 2-voudig. De diameter van een bubble stelt de grootte van de log 2 verhouding van keratine 8 en keratine 14 gemiddelde intensiteit en de oranje en witte kleurcodering geeft waarden> 0 en <0, respectievelijk. F-waarden one-way ANOVA en P-waarden van T-tests, en beugels met pijlen identificeren van de bevolking vergeleken, worden getoond.
Figuur 4. Een voorbeeld van een MEArray scan verkregen met een betegelde verwervingsmodus een laser scanning confocale microscoop. HCC1569 cellen lieten we de DNA analoge edu nemen gedurende 4 uur voorafgaande aan fixatie.DAPI (blauw) en Edu (rood) worden getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MEArray methode hier gepresenteerde maakt functionele analyses van cel-en combinatorische micro-omgeving interacties 4. MEArray analyse combineert het gebruik van elementaire micropatterning technologieën, celbiologie, en microarray afdrukken robots en analyse apparaten die beschikbaar zijn in een groot aantal multi-user faciliteiten. MEArray schermen zijn compatibel met de meeste hechtende celtypen, maar serumvrije media formuleringen kunnen aangepast worden in sommige gevallen BSA of <1% serum, die kunnen worden gebruikt, waaronder verbeteren. Deze methode is beperkt door de beschikbaarheid van reagentia bij een bepaalde cellulaire functie, fluorescentie gebaseerde assays zijn compatibel met de meeste array gebaseerde beeldvorming, maar colorimetrische testen kan ook goed werken. Andere variaties van deze werkwijze bestaan en het algemene idee dat complex micromilieus kan functioneel worden ontleed om te onthullen welke rollen afzonderlijke micro moleculen en combinaties daarvan spelen in een verscheidenheid van cel funcgen 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
ML wordt ondersteund door de NIA (R00AG033176 en R01AG040081) en door Laboratorium Gerichte Research and Development, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
