Summary
Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.
Abstract
Las interacciones entre las células y su microambiente circundante tienen consecuencias funcionales para el comportamiento celular. En el nivel de células individuales, distintos microambientes puede imponer diferenciación, migración, proliferación y fenotipos, y en el nivel de los tejidos del microambiente procesos tan complejos como la morfogénesis y la tumorigénesis 1. No sólo el contenido celular y molecular de las células impacto microambientes dentro, pero también lo hacen la elasticidad 2 y 3 de la geometría del tejido. Se define como la suma total de la célula-célula, ECM-, y solubles en interacciones de los factores, además de las características físicas, el microambiente es complejo. Los fenotipos de las células dentro de un tejido son parcialmente debido a su contenido genómico y parcialmente debido a las interacciones combinatorias con el microenviroment. Un reto importante es vincular las combinaciones específicas de componentes microambientales con comportamientos distintivos.
ent "> A continuación, presentamos el microambiente de microarrays (MEArray) plataforma de base de células de cribado funcional de las interacciones con los microambientes combinatorias 4. El método permite el control simultáneo de la composición molecular y el módulo de elasticidad, y combina el uso de microarrays ampliamente disponible y tecnologías micropatterning. pantallas MEArray requieren tan pocos como 10.000 células por matriz, lo que facilita los estudios funcionales de tipos de células raras, tales como células progenitoras adultas. Una limitación de la tecnología es que microambientes enteros de tejido no puede ser completamente recapitulado en MEArrays. Sin embargo, la comparación de los respuestas en el mismo tipo de célula a numerosos microambientes relacionados, por ejemplo combinaciones pareadas de proteínas ECM que caracterizan un tejido dado, se proporciona una visión de cómo los componentes microambientales obtener tejidos específicos de fenotipos funcionales.MEArrays se puede imprimir utilizando una amplia variedad de gro recombinantefactores wth, citoquinas, y proteínas purificadas ECM, y sus combinaciones. La plataforma está limitada sólo por la disponibilidad de reactivos específicos. MEArrays son susceptibles de tiempo-caducada análisis, pero más a menudo se utilizan para el análisis de punto final de las funciones celulares que son medibles con sondas fluorescentes. Por ejemplo, la síntesis de ADN, la apoptosis, la adquisición de estados diferenciados, o la producción de productos génicos específicos se miden comúnmente. En pocas palabras, el flujo básico de un experimento MEArray es preparar portaobjetos recubiertos con sustratos de impresión y para preparar la placa maestra de proteínas que se van a imprimir. A continuación, las matrices se imprimen con un robot de microarrays, las células se dejan adherir, crecer en cultivo, y luego se fija químicamente al alcanzar el punto final experimental. Ensayos fluorescentes o colorimétrico, con imágenes de microscopios tradicionales o escáneres de microarrays, se utilizan para revelar correspondientes fenotipos moleculares y celulares (Figura 1).
Protocol
1. Sustratos de impresión Preparación
La decisión de utilizar polidimetilsiloxano (PDMS)-revestida o poliacrilamida (PA)-portaobjetos recubiertos depende de los parámetros importantes del diseño experimental. El módulo elástico de los dos polímeros se puede ajustar para imitar las rigideces de diferentes tejidos mediante la alteración de la relación base / cura de PDMS, y la proporción de acrilamida / bis-acrilamida de PA. PDMS puede imitar más rígidos los tejidos en el intervalo de 1-10MPa (por ejemplo, cartílago, córnea, y las paredes arteriales), y PA puede imitar tejidos más blandos en el intervalo de 100Pa-100kPa (por ejemplo, mama, cerebro, hígado, próstata y) 5. PDMS es barato, fácil de preparar, y la geometría de las características impresas será idéntico al de la cabeza de los pasadores de impresión. Así, el tamaño y forma de las características puede ser controlado con precisión usando los pins con geometrías de punta diferente. PDMS es más hidrofóbico que PA, que causa algunos problemas durante la manipulación de células y Immunoscontengan pasos, y pueden ser incompatibles con algunas líneas celulares. Debido a que PA es un hidrogel y una superficie resistente al ensuciamiento nativa, las células sólo se adhieren a los puntos en los que hay proteínas que la adhesión célula de apoyo. La geometría de las características impresas sobre geles de PA no seguir con precisión la geometría de la cabeza del alfiler; normalmente se convierten en círculos debido a la difusión, con independencia de la geometría de la cabeza de alfiler que se utiliza. La impresión por contacto parámetros diámetro de tiempo y el pasador se puede determinar empíricamente por tamaño de la característica óptima en geles de PA.
Polidimetilsiloxano (PDMS)
- En un vaso de plástico desechable combinar Sylgard 184 base de elastómero de silicona con el agente de curado en una relación 10:1, mezclar vigorosamente con una lengua de madera o de plástico depresor desgasificar después en una campana de vacío temperatura ambiente durante 30 min.
- Centro de un portaobjetos de microscopio estándar en el mandril vacío accionada de una recubridora de rotación, luego llovizna 0,5 ml de la mezcla de polímero elastómero sobre el centro de la superficie de deslizamiento. Gira a6.000 rpm durante 60 sec.
- Curar los portaobjetos recubiertos con PDMS en un 70 ° C horno o en una placa caliente digitales (protegido del polvo) durante 4 horas a toda la noche.
- Diapositivas secas pueden usarse inmediatamente, o almacenarse durante varios meses en una caja de portaobjetos que está sellado dentro de una bolsa de plástico Ziploc y se mantuvo en un cajón. El PDMS atrae el polvo por lo que debe estar bien protegido de la circulación de aire ambiente.
- Nota: nitrilo u otros guantes que no contengan látex deben ser usados cuando se trabaja con el conjunto de elastómero PDMS. Contacto incidental con los guantes de látex inhibirá la polimerización PDMS.
Poliacrilamida (PA)
- Grabado NaOH: Colocar los portaobjetos en bloque de calor a 80 ° C. Añadir 1 ml de NaOH 0,1 N en cada diapositiva, asegurándose de cubrir toda la superficie de deslizamiento. Deje que se evapore el NaOH (una película blanca debe formar en la superficie de deslizamiento). Dado que el gel PA sólo puede adherirse firmemente en NaOH superficies grabadas, el gel PA se desprenderá durante el secado por paso si el oleaje diapositiva completaas no está cubierto por NaOH. Si la superficie de deslizamiento no estaba completamente cubierto, repetir mediante la adición de 1 ml de 0,1 N NaOH. Diapositivas se pueden almacenar a temperatura ambiente (RT) durante varios días. Nota: Una alternativa al grabado NaOH es la capa de ozono o de plasma limpiar las diapositivas.
- 3-aminopropiltrietoxisilano (APES) Revestimiento: en una campana de extracción, coloque los portaobjetos en una placa de 15 ml y añadir 300 APES mu l en cada diapositiva NaOH grabado. Deje que los APES reaccionar con el NaOH se desliza durante 5 min. Si se supera este tiempo causará dificultades para lavar APES reactivo sin reaccionar. Lavar la APES a fondo con agua desionizada dos a tres veces en ambos lados de las láminas. Si el lavado no es completa, APES se oxida por glutaraldehído para formar un depósito marrón en portaobjetos en el paso 1,8.
- Oxidación Glutaraldehído: Aspirar todas las soluciones de las superficies deslizantes. En cada placa de 15 cm, agregar 25 ml de glutaraldehído al 0,5% en PBS. Reaccionar durante 30 min en una zona oscura. Después de 30 minutos, se aspira todo el glutaraldehído y el uso de mano de obra no-linttoallitas Atory Kimwipes (por ejemplo) para que se seque cuidadosamente las diapositivas. Diapositivas se pueden almacenar a temperatura ambiente durante hasta un día.
- Preparación de gel: Después de la preparación de mezclas de PA incluyen acrilamida, bis-acrilamida y ddH 2 O en de acuerdo con la siguiente tabla, desgasificar durante 30 min, y luego colocar mezclas de PA en hielo para reducir la velocidad de polimerización. Añadir APS y TEMED y mezclar bien justo antes de hacer los geles. Pipetas PA mezclas sobre las superficies de deslizamiento y el lugar 24 mm x 50 mm, número 1 cubreobjetos en la parte superior de la AP. Evite presionar el cubreobjetos y portaobjetos de vidrio juntos y evitar la formación de burbujas. Para geles> 40.000 Pa utilizar 100 l, para otros geles utilizar 350 l.
| Módulo deseado (Pa) | % De acrilamida | Bis-acrilamida% | La acrilamida del 40% de acciones (ml) | Bis-acrilamida del 2% de acciones (ml) | Agua desionizada (ml) | APS (l) | TEMED (l) |
| 480 ± 160 3 | 0,06 | 0,75 | 0,3 | 8,95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0,15 | 1,25 | 0,75 | 8 | 100 | 10 |
| 40.400 ± 2390 | 8 | 0,48 | 2 | 2,4 | 5,6 | 100 | 10 |
Adaptado de 6,7.
- Deje que el gel PA polimerizar durante 2 horas y después quite los cubreobjetos con agua desionizada.
- Lavar los portaobjetos PA gel en grandes tinajas Coplan en agua durante la noche (~ 8 horas) para eliminar la acrilamida sin reaccionar.
- Portaobjetos secos en horno a 37 ° C durante 2-4 horas o hasta que esté completamente PA gel se endurece.
- PA gel de diapositivas se pueden almacenar a 4 ° C durante un mes en una caja de portaobjetos sellado.
2. Maestro Proteína Plate Preparación
- Todas las proteínas de hombrod se tomaron alícuotas de las existencias de las soluciones de 10 veces en los tampones recomendados por el proveedor y se almacenan a -80 ° C. La mayoría de las proteínas ECM son solubles en agua desionizada, pero el pH puede necesitar ser ajustado con gotas de ácido acético. La mayoría de los factores de crecimiento, citoquinas, y los dominios extracelulares del receptor recombinantes se prepararon en PBS con BSA, pero las condiciones del fabricante pueden variar. Filtrar las partes alícuotas de proteínas a través de un 0,45 m 4-mm filtro de jeringa de nylon (Nalgene) antes de su almacenamiento.
- Diseñe una placa capitán de conformidad con combinaciones de proteínas deseadas y diluciones. Las células adherentes generalmente se basan en la presencia de al menos un ECM compatible para mediar en la adhesión celular, pero los anticuerpos contra epítopos de superficie celular también puede mediar la unión a veces. Es una buena idea para añadir colorante libre FITC o una proteína fluorphore-conjugado con al menos un pozo de manera que las matrices pueden ser fácilmente orientado más tarde.
- Preparar la placa maestra por dilución de las combinaciones de proteínas con tampón de impresión compuesto por 100 mMTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5,2. Típicamente, cada pocillo de una placa de 384-y no contiene más de 10 l.
- Grabar el contenido de cada pocillo en cada placa maestra en un archivo delimitado por tabulaciones base de datos y proporcionar a cada placa principal con un número de identificación único. A fecha de seis dígitos seguido de las iniciales del diseñador a menudo sirve al propósito (MMDDYYinitial). Debido a que los volúmenes de pozo son pequeñas, las alícuotas de proteína pueden ser utilizados eficientemente para generar un gran número de placas replicadas. Se recomienda que las placas maestras se almacenan a -80 ° C y cada placa maestra debe someterse no más de dos ciclos de congelación-descongelación.
3. MEArray impresión
- MEArrays se pueden imprimir con robots de impresión más convencionales de microarrays. Impresoras Quill pines que utilizan ya sea de silicona o pins de acero inoxidable funcionan bien, pero la viscosidad proteína puede ser problemático. Impresoras capilares son ideales robots de impresión de microarrays para esta aplicación, ya que trabajanBueno con soluciones de proteínas viscosos.
- Para alcanzar el poder estadístico bien dentro de una matriz, 10 a 12 puntos por duplicado de cada microambiente se recomienda. Este tipo de diseño permite la comparación de la actividad en un microambiente con relación a otro en el mismo array usando sencillos de prueba T-estadísticas. Dunnette prueba se puede utilizar para comparar la actividad en un entorno de control con otros microambientes. Este diseño funciona mejor cuando un fenotipo funcional se ha asociado con el microambiente de control antes de realizar los experimentos MEArray.
- La humedad debe ser mantenido en torno al 50%. Control de la humedad es importante porque una baja humedad puede secar la solución en el interior de los pasadores o en los pocillos de la placa maestra causando deposición ineficaz sobre el sustrato de impresión. La humedad puede ser controlada eficazmente por el robot con drapeado no porosa, láminas de plástico y utilizando tanto un humidificador y un humidificador de-regulada para mantener una humedad del 50%. Cooled platinas de impresión pueden ser USEFul para la conservación de algunas proteínas, pero se debe tener cuidado para evitar que se forme condensación en las diapositivas.
- Cada matriz impresa debe ser etiquetado con etiquetas a prueba de deslizamiento congelador codificados con un número de serie que consta de identificador de la placa principal, seguido de un número de tres dígitos (MMDDYYinitial-nnn). Como cada matriz se utiliza o distribuido, los detalles de los tratamientos experimentales se debe mantener en una base de datos. El seguimiento de las fechas de impresión y el número de ciclos hielo-deshielo de las placas maestras ayudará a identificar las condiciones óptimas para el mantenimiento de la reproducibilidad.
- MEArrays impresión se deben almacenar en cajas porta sellados a -20 º C durante no más de un mes. Reproducibilidad notablemente disminuyendo posteriormente.
4. El cultivo de células de mamíferos en MEArrays para el Análisis Funcional
- Conecte cámaras de cultivo: Para limitar el volumen de los medios de comunicación y el número de cultivos de células necesarias en los MEArrays, una cámara de plástico es fitted para rodear la matriz impreso. Para las matrices de muchos, una cámara individual de un Diapositiva 2-cámara (Nunc) que contiene un área de 4,2 cm 2 puede ser utilizado. Retire las cámaras de la diapositiva cámara fabricada y cortada por la mitad de las cámaras con una hoja de afeitar. Usar una jeringa de 3 ml para aplicar una tira delgada de silicona acuario (DAP) para el borde de una cámara y de prensa sobre la superficie de un MEArray. Evite colocar la cámara acuario de silicona aplicada sobre las características de la matriz.
- El bloqueo y el aclarado: MEArrays tienen que estar bien enjuagado para eliminar los monómeros sin reaccionar, que pueden ser tóxicos para las células. Si PDMS portaobjetos recubiertos se utilizaron, a continuación, en las regiones entre las características impresas primero necesitan ser bloqueado con un recubrimiento no ensuciante para evitar la adhesión celular; incubar las matrices en 1% de Pluronic F108 (BASF) en agua o en 2% de BSA en agua durante 15 minutos bajo vacío. PA diapositivas gel no requieren una etapa de bloqueo. En todos los casos, enjuague matrices con medios de cultivo celular tres veces durante cinco minutos (elección de medios dependesobre las células usadas, pero el uso de antibióticos se recomienda independientemente de los medios o células). Geles PA requieren incubación adicional de 30 minutos en los medios de comunicación para rehidratar el gel.
- La unión celular: Cuatro a cinco matrices pueden caber dentro de una única 15 cm placa de Petri estéril. Cubrir la placa de Petri con una tapa para mantener los arrays estéril. Añadir medio de el volumen final de los medios de comunicación a la MEArray mediante la adición de las células en los medios a una concentración final de 10.000 a 1.000.000 células / ml. Las células se adhieren a las características impresas a velocidades diferentes dependiendo de la composición del microambiente impreso. Compruebe que no se uniforme mediante la visualización de las matrices a través de un microscopio invertido etapa en 15 a intervalos de 20 min. Agitando suavemente el MEArrays atrás y hacia adelante, las células de fijación de una manera modelada se pueden distinguir de las células flotantes, no unidas.
- La eliminación de las células no unidas: El PA recubiertos MEArrays, las células no unidas pueden ser aspirados y los medios de comunicación puede ser reemplazado con un volumen apropiado. El PDMS recubiertos MEArrays, los medios de comunicación nunca puede ser completamente eliminado de la así porque las células secarse y morir casi inmediatamente. Así, en PDMS recubiertos MEArrays, las células no unidas debe ser eliminado por un proceso de intercambios sucesivos de la mitad del volumen de los medios de comunicación hasta que las células no unidos son eliminados, como se determina por inspección microscópica. El efecto de-humectante de PDMS es menos prominente cuando medio que contiene suero se utiliza en comparación con los medios definidos, y cuando BSA se utiliza para bloquear las áreas no impresas en comparación con Pluronics F108.
- Las células pueden ser cultivadas en MEArrays colocados en el interior de 15 cm placas de Petri durante muchos días con cambios de los medios normales. Cambios de los medios en las diapositivas de PDMS se debe hacer con sucesivos cambios de medio del volumen de los medios.
- Fijadores comunes, tales como paraformaldehído y metanol / acetona, son compatibles con los sistemas de MEArray. Cuando la tinción de células en PA recubiertos MEArrays, fijadores pueden añadirse y eliminarse del mismo modo que sería en un procedimiento de tinción convencional.Sin embargo, cuando la tinción de células en PDMS recubiertos MEArrays, la superficie debe permanecer húmedo incluso durante la fijación. Aspirar el medio de los medios de comunicación y reemplazarlo con un fijador. Repetir el proceso varias veces hasta que el pozo se llena con una mayoría de fijador. Después de la fijación, el fijador es reemplazado gradualmente de la misma manera con tampón de bloqueo que es apropiada para el siguiente paso del análisis.
- La inmunotinción se utiliza comúnmente para analizar las funciones celulares. Rutinas de tinción puede variar, pero cuando se trabaja en las MEArrays PDMS, uno debe realizar cada paso de lavado y aspiración como anteriormente, cambiando gradualmente las soluciones y nunca permitiendo que la superficie de-húmedo. De-humectación causar artefactos en las manchas.
- Las cámaras se pueden eliminar con la ayuda de una cuchilla de afeitar. Los cubreobjetos se puede montar en la parte superior de MEArrays teñidas usando Fluoromount-G (Southern Biotech). La detección puede llevarse a cabo con la mayoría de los escáneres de fluorescencia multicolor microarrays o en los microscopios confocales con motorizadobaldosas modos de adquisición de imágenes.
5. Los resultados representativos
Un ejemplo de la deposición de proteínas en un patrón impreso PDMS-costeó MEArray usando algunos pernos de silicio de punta cuadrada sobre una pluma pasador de microarrays de impresión robot se muestra en la Figura 2. La deposición de proteínas diferentes que se han impreso puede ser verificada por inmunofluorescencia utilizando anticuerpos (Figura 2A). Las diluciones de las soluciones de proteína en la placa maestra son un reflejo de la cantidad (intensidad de fluorescencia) que se deposita sobre la superficie del sustrato de impresión (Figura 2B). Las células deben adherirse a las características impresas en una manera obvia patrón (Figura 2C).
Un ejemplo de un experimento que muestra que MEArray diluciones inversas de dos proteínas específicas del microambiente provocada perfiles de expresión de queratina en una proteína dependiente de la concentración en una manera multipotentes mamario humano p epitelialrogenitor línea celular (células D920), se muestra en la Figura 3. Parcelas de burbujas son útiles para determinar si los fenotipos específicos se imponen a las células sobre las características repetidas de una serie de dilución. Por ejemplo, si una molécula en particular en un microambiente causa un fenotipo distinto, una vez que el componente instructivo se ha diluido lo suficiente en un fondo de un ECM neutral el fenotipo debe cambiar o desaparecer. Detección por inmunofluorescencia de queratina 8 y queratina 14 proteínas de filamentos intermedios se realizó con un 4200a Axon (Molecular Devices) escáner de microarrays. Doce serie de dilución réplica se imprimieron en cada MEArray, y el log 2 ratio de queratina 8 y queratina 14 la intensidad media de fluorescencia se representa gráficamente como un gráfico de burbujas para dar una idea realista de la variación y reproducibilidad de la señal. Se muestra datos de un MEArray que se fijó después las células se habían unido y las células no unidas se lavaron de distancia (Figura 3A), y después de 24 hr de culture (Figura 3B). Para este análisis relativamente pequeño, un ANOVA de una vía se utilizó para determinar la varianza a partir de la media de la señal en cada punto de tiempo, y se agrupan de dos colas t-test fueron utilizados para determinar si las diluciones diferentes de colágeno de tipo I y-P humana recombinante cadherina provocado cambios en la expresión de queratina. No hubo una variación de la media entre las células sobre las características sólo después de la unión, sin embargo, hubo diferencias significativas en la expresión de queratina entre las células después de 24 horas de exposición a los diferentes microambientes. T-pruebas verificado que tipo alto que las concentraciones de colágeno suscitado mayor queratina 8 expresión, mientras que altas concentraciones de P-cadherina provocó una fuerte queratina 14 la señal después de 24 horas. Este resultado es consistente con informes anteriores que la P-cadherina que contienen microambientes impondrá de K14-expresión de fenotipo mioepiteliales en bi-potentes células madre mamarias 4.
Un ejemplo de un scanne todad MEArray impreso en un gel de 40.000 Pa PA se muestra en la Figura 4.
Figura 1. Un diagrama de flujo del procedimiento MEArray. En primer lugar, el sustrato de impresión se preparan ya sea con PDMS o PA. En segundo lugar, los platos principales están preparados y anotados en una base de datos. En tercer lugar, los MEArrays se imprimen y codificados con números de serie. En cuarto lugar, cámaras de cultivo están unidos, son superficies de los bloques y / o eliminar, a continuación, las células se que se pueden conectar y las células no unidas se lavan. En quinto lugar, las células pueden ser tratadas con tinción o bioensayo después de un período de incubación basado en el diseño experimental. Finalmente, las imágenes de MEArray puede obtenerse y analizarse con escáner adecuado y software.
Figura 2. DEPOSition abundancia relativa de las proteínas y impresos puede ser verificado con inmunotinción antes de la fijación de las células. A) Los anticuerpos que reconocen el colágeno tipo IV y laminina-111 se utilizaron para verificar su presencia en las características impresas de un MEArray. B) Uso de una intensidad media de píxeles en función de análisis de NIH ImageJ software, la abundancia relativa de las dos proteínas a través de una serie de diluciones, a partir de una solución de proteínas 200 mg / ml, se puede evaluar cualitativamente. C) Fase de micrografía D920 células unidas a la plaza en forma de características de un impreso recubierto de PDMS MEArray.
Figura 3. Un ejemplo de un análisis MEArray utilizando cambios en la expresión de queratina en una línea de células progenitoras multipotentes como una función del tiempo y el microambiente. Cada burbuja representa proporciones de queratina 8 y 14 niveles de proteína queratina 10 a 15 células unidas a una featura en un MEArray. Expresión se determinó con sondas de inmunofluorescencia. A) Muestra las células de queratina en sólo después de la unión, y B) muestra las relaciones de queratina después de 24 hr en una matriz que se colocaron en placas en paralelo. La concentración máxima de ambas proteínas fue de 200 mg / ml y se diluyó 2 veces. El diámetro de una burbuja representa la magnitud de la relación de 2 log de la queratina 8 y queratina 14 intensidad media, y la codificación de color naranja y blanco indica valores> 0 y <0, respectivamente. F-valores de ANOVA de una vía y los valores de p de la prueba t, y los soportes con flechas que identifican las poblaciones comparadas, se muestran.
Figura 4. Un ejemplo de una exploración de MEArray adquiridas mediante un modo de adquisición en mosaico en un microscopio de barrido láser confocal. HCC1569 células que les permite incorporar el ADN analógico EdU durante 4 horas antes de la fijación.DAPI (azul) y Edu (rojo) se muestran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método que aquí se presenta permite MEArray análisis funcionales de las células y las interacciones combinatorias microambiente 4. Análisis MEArray combina el uso de las tecnologías de micropatterning básicos, biología celular, y los robots de microarrays de impresión y dispositivos de análisis que están disponibles en muchas instalaciones multiusuario. MEArray pantallas son compatibles con la mayoría de tipos de células adherentes, aunque sin suero formulaciones de medios puede ser necesario ajustar en algunos casos para incluir BSA o suero <1%, lo que puede mejorar el agarre. Este método está limitado por la disponibilidad de reactivos para el análisis de una función celular dado, los ensayos basados en fluorescencia son compatibles con la mayoría de los sistemas de imágenes basada en matrices, ensayos colorimétricos, pero también puede funcionar bien. Otras variaciones de este método existe y apoyar la idea general de que los microambientes complejos pueden ser funcionalmente diseccionados para revelar qué papeles moléculas individuales microambiente y combinaciones de los mismos desempeñan en una variedad de funciones de célulasciones 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
ML es compatible con el NIA (R00AG033176 y R01AG040081) y por el Laboratorio de Investigación Dirigida y Desarrollo, EE.UU. Departamento de Energía # contrato DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
