Summary
应用光刻和蚀刻的PDMS制作的微流室探测与欧共体功能障碍和炎症相关的功能性结果。在有代表性的实验，能力差剪应力调节单核细胞粘附因子激活欧共体单层证明。
Abstract
动脉粥样硬化是potentiated高度的全身性炎症的状态，造成血管内皮功能障碍，有助于代谢异常。然而，早在血管内皮细胞的功能变化，意味着个人的风险程度是不直接评估临床治疗策略，以帮助指导。此外，调节局部血流动力学炎症导致动脉粥样硬化的非随机分布，但机制是难以界定， 在体内 。我们描述了实验室在一个芯片为基础的方法，以定量检测人血管内皮细胞（EC）和精确的流量条件下的单核细胞炎症活动的代谢扰动。软光刻技术的标准方法，用于1这些器件具有microfabricate 模仿血管微商会（VMMC）的 ，这必将直接培养欧共体膜。使用小体积，同时试剂的优势直接成像在接触到一个明确的剪切场欧共体膜炎症事件提供了一个平台。我们已成功地应用于这些设备，以探讨细胞因子，脂质3，4和RAGE诱导人类主动脉EC（HAEC）炎症。在这里，我们记录使用的检测单核细胞（THP-1）轧制和逮捕条件下差剪切特性及炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α激活的HAEC单层VMMC。这类研究到atherosusceptibility提供的代谢危险因素在机械洞察力。
Protocol
1。细胞培养和基材的准备
- 削减3英寸100×20 mm组织培养皿（BD猎鹰）使用车床的圆形基板。浸入70％乙醇消毒基板。 4毫升型胶原在室温下为1小时（100微克/毫升）在培养皿和大衣的地方，然后用4毫升1×PBS冲洗。
- 申请1毫升直接基板，暂停在6.5x10 5细胞/ ml和种子的人主动脉内皮细胞（HAEC，通过4-6）。放置在37℃，5％CO 2的孵化器，使细胞坚持以基材为1小时。
- 添加9毫升内皮生长中期辅以1X抗生素抗霉菌解决细胞（EGM-2）。改变媒体每2天，直到细胞达到90％汇合。
- 保持在THP-1细胞的RPMI 1640培养基中10％FBS和：1X抗生素抗霉菌的解决方案。当他们到达密度为1的传代细胞0 6细胞/毫升。
2。细胞剪切协议
细胞习惯于在一个自定义板锥细胞剪切设备（CSD）。设备细节和设计规范，记录在表1和图4。
- 准备惩教署。消毒用乙醇室住房，并用无菌PBS冲洗。住房加热至37°C和水平，以确保锥细胞单层垂直。从外壳底部的细胞组装基板和锥设置到所需的高度。
- 使用莱博维茨-15（L-15的）内皮BulletKit补充中型剪切介质中的CO 2的情况下保持适当的pH值。刺激炎症，肿瘤坏死因子-α（TNF-α0.5毫微克/毫升）加剪切介质和注入设备，通过连接到进气口注射器6毫升，照顾不引进空气气泡室。
- （15达因/厘米2）或振荡剪切应力为4小时（OSS，0±5达因/厘米2，1赫兹）高速钢，高的幅度稳步剪应力剪细胞。所需的SS为实现以上的细胞，而这恰恰是如前面所述的微步进电机控制旋转锥6墙表面SS（τW）近似。
其中，μ为介质的粘度，是圆锥体的角速度ω，α是锥角（0.5°）。锥与基板对齐调整为0.05°内通过精密水准和间隙高度设置在20±10微米，使用深度计，以尽量减少周向和径向在τ 瓦特变化。该设备已被验证，以确保层流特性。删除Ç从设备的ELLS和准备分析单核细胞粘附。
3。制备的PDMS微流控室
- 获得所需的微通道数量和通道的高度，取决于应用程序的主模具。在本协议中所使用的具体设计的特点，详列于表1。 创建这些方法已在文献记载。1简言之，网络渠道使用CAD软件Autodesk Inventor的设计和印刷于5000 DPI透明度。负光阻（SU8）纺到硅片厚度100微米。覆盖的透明度和暴露在紫外线下。非聚合光刻胶去除产生积极的副本主。
- 使用硅胶固化按重量10:1代理在权衡船的PDMS溶液混合硅基地和5毫升血清吸管搅拌。要小心，不要刮墙壁称重船解决方案，以避免增加塑料片。
- 主晶片放置在一个100x15mm培养皿，倒入菜的PDMS解决方案。
- 覆盖的菜，放入真空容器中，15分钟，以消除气泡。 15分钟后，培养皿，在表面轻轻吹空气中删除任何多余的气泡。
- 1小时烤箱放置在培养皿，在70°C。取出盘子切出微腔，用锋利的刀片。
4。大会在显微镜设备
- 打开光源倒置显微镜和设置加热至37°C。连接管10毫升注射器装满蒸馏水等，有没有气泡。将在注射器的注射泵和集流率，诱使1达因/厘米2的墙卫队。沿着通道中心线产生的壁面剪切应力（τW）使用标准的近似平行板流动腔方程为：
其中，μ为介质的粘度，Q为体积流量，H通道高度，w为通道宽度注：因为渠道有限宽度的实际τw将随W的通道长宽比，避免测量的25％，在最近的一面墙壁。1,7 - 放置在水中的PDMS室和使用100μL微量消除空气从各个渠道。将适配器真空室制作确保设置为关闭阀门。
- 将培养皿HAEC单层以上的目标。放置在培养皿中的PDMS室和精心设置的HAEC单层，同时确保无气泡形成之间的设备和单层。关闭阀门，使真空室连接牢固。 削减19个表针生硬等，有金属左侧只有5毫米。缓冲区填充塑料水库和投入的PDMS室门口。重复使用的通道的适当数量。附加油管从注射泵的PDMS通道出口。
5。剪应力下的单核细胞粘附实验
- 暂停在2X10 6个细胞/毫升的HBSS +的Ca 2 + /镁2 + 0.1％HSA的THP-1细胞。激活的THP-1细胞与基质细胞衍生因子1（SDF-1，50微克/毫升）的孵化室温为15分钟。
- 注射泵转动建立流，然后加入50μL细胞悬液，水库没有引入气泡。一旦流充分发展，开始数据采集。
- 运行适当的流速为5分钟，加入缓冲水库解决方案，如果变低。继续流入渠道洗出流流中的任何绑定细胞的缓冲区。
6。数据采集与分析
- 在3帧/秒，2分钟后，沿纵轴通道3通道的位置流充分发展，照顾侧面记录后，立即入口或出境口岸前，或在25％，最近获得的数字图像序列墙壁。
- 每场拘捕细胞的数量计算确定其相明亮的外观，在相同的单层焦平面。
- 细胞周期阻滞是指公司通过运动<半细胞直径在10秒。平均超过3个随机的领域/通道和数据量化使用ImageJ的软件。
7。代表结果
虽然血管内皮细胞均匀地暴露激动剂有助于全身炎症，动脉粥样硬化是一种疫源性疾病动脉流扰动的网站，优先发展，在血管内皮功能的空间异质性暗示。 。9日，10肿瘤坏死因子-α诱导良好的特点，在欧共体的反应，包括上调细胞粘附分子（CAMS如VCAM-1，ICAM-1，E-选择素）和趋化因子，招募单核细胞11血流动力学，从流通，早期动脉粥样硬化的一个标志，是一个重要的调节内皮细胞炎症型12个高幅度剪应力（高速钢。如15达因/厘米2）或脉动剪切应力（PSS;如15±5达因/厘米2）与抗动脉粥样硬化的网站，在动脉下调TNF-α诱导的反应。相反，低幅度剪切应力（LSS，如2达因/厘米2）或振荡剪切（OSS;如0±5达因/厘米2）， 在体内的易感位点的特点，加剧cytokiNE引起的炎症。13，14我们的PDMS微流控设备进行机理研究，测试与流体力学因素在调节血管内皮功能和病理代谢应激叠加的假设提供了一个平台。通过以下的有代表性的成果，大致说明了该方法的实用性和多功能。
图1。剪应力差异调节THP-1细胞粘附肿瘤坏死因子-α发炎的内皮细胞单层。使用上面描述和记录视频的详细协议，这些数据被收购。 HAEC单层同时暴露到低剂量的炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（0.5纳克/毫升，50〜欧共体VCAM-1的上调），要么HSS（15达因/厘米2）或OSS（0±5达因/厘米2，定制惩教署在1赫兹）作为descri 4小时床的详细协议。 THP-1细胞阻滞在PDMS流动腔的剪切流场下的量化。这模仿人类单核细胞表型的细胞系，被选为其重现性和易用性。相比，高速钢抑制炎症反应的OSS，导致下降的THP-1细胞逮捕。学生t检验数据进行分析，并表示为平均值±SEM 3个独立的实验适应从DeVerse等权限5。
下面的数据表明我们的方法的通用性，使用的例子，从我们的出版工作。偏离上述协议表示（如适用）。
图2。调节细胞因子诱导的VCAM-1表达和单核细胞在剪应力梯度招聘。一）HAEC单层4小时刺激下FLO与肿瘤坏死因子-α（0.3毫微克/毫升）w在设计基于海伦-肖流理论VMMC 15在SS幅度沿着通道中心线的直线下降。设计室侧壁配合二维停滞流简化和塑造年底实现通道，以符合ISO-电位线。沿着这个通道从入口（X）的轴向距离中心线产生的壁面剪切应力（τW）计算公式如下：
其中，μ为介质的粘度，Q为体积流量，h是通道的高度，W 1通道入口的宽度，L是总的通道长度，Q被选为生成从16日在SS幅度梯度达因/厘米，在进口2 0驻点“一个”公正的outle近端ţB）-C），VCAM-1表达的原位免疫荧光显微镜使用抗体共轭量子点和比例中位数的荧光强度（MFI）。无刺激的静态控制测量。卫队没有调节VCAM-1的基础水平，这是在未刺激HAEC（灰色三角形）低。然而，VCAM-1表达增加肿瘤坏死因子-α在LSS的程度，高峰在2达因/厘米2，并返回到TNF-α的基线或以下> 5达因/厘米2（黑色正方形），D剪切程度）单核细胞（10 6 /毫升）灌流2达因/厘米2， 在A）为前提的单层，平行流渠道为5分钟。单核细胞向血管内皮细胞的招聘数量与VCAM-1表达，在一个给定的剪应力。值得注意的是，能够探测与罚款在monolaye空间分辨率的VCAM-1表达和单核细胞招聘ŕ透露了在党卫军幅度狭窄的范围内，不会被应用在不同的实验只有几个离散值剪切赞赏显着的变化。数据进行了分析，重复测量方差分析和纽曼的两两比较后测评估差异，静态条件下，* P <0.05从肿瘤坏死因子-α。数据平均值±3-6独立实验的SEM 改编权限由邹族等。2
图3。富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）调节比例捐助者的血清甘油三酯水平和VCAM-1表达的细胞因子诱导的炎症。HAEC膜与肿瘤坏死因子-α（0.3毫微克/毫升）4个小时与TGRL（10 mg / dL的同时刺激载脂蛋白B）分离，从静态培养高脂肪食物后，人类受试者A）测定VCAM-1表达在暂停欧共体分别用流式细胞仪和单核细胞粘附在详细协议中所述，使用VMMC作为量化。数据以％肿瘤坏死因子-α的变化。单核细胞逮捕不同直接比例内皮VCAM-1表达，从而增加直接与捐助者的血清甘油三酯水平B）单核细胞促炎症捐助者的一个子集逮捕被废止的VCAM-1的阻断抗体的存在。配对t检验确定的意义，这意味着±SEM 3-5独立实验。 改编，王等人的许可。4
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Discussion
我们描述了微硅橡胶设备的使用片上，通过实时成像CAM的表达和单核细胞粘附内皮炎症型评估。我们的方法的一个主要优势在于能够量化细胞暴露炎症介质，如饮食中的脂肪和定义的水动力条件下的细胞因子，反映在动脉粥样硬化的血管剪应力的血管内皮功能障碍的相关成果。的VMMC方便使用少量的试剂或材料，可能是在有限的供应，并有增加的优点是价格低廉，可定制的，适合高吞吐量。
微流体装置的使用，替代已使用了几十年的宏观方法，探讨培养欧共体的回应剪切。这些包括平行板流动腔，圆柱管，锥板粘度计，这是每个CA实行稳定，层Poiseuille流条件（审查）在16 pable。修改这些设备可以产生在壁面剪切应力的时间或空间的变化，甚至复述动脉波形。6然而，这些设备一般需要大量的媒体，是制作昂贵，较难适应，忍受相对较低的吞吐量。
限制也存在与使用VMMCs。这些器件的设计基础上平行板流理论，承担无限宽度。这是一个合理的假设，其中宽度大于高度的宏观设备。然而，微通道宽度有限，必须沿纵轴中心的通道，消除侧墙效果进行研究，为实际τw将随W的通道长宽比而定。1，7同样，测量不采取密切ţo通道的入口和出口，以避免入口效果。我们已经排除了任何显著旁分泌信号的影响或炎症引起伤害或损坏EC单层密封装置，作为我们观察到的反应造成的。硅橡胶具有高疏水性分子的亲和力，这可能导致分泌趋化因子和非特异性白细胞和VMMC之间的相互作用的吸收。然而，我们没有发现这是一个问题，我们的研究时间为2。
流动设备的使用与培养细胞构成了还原的方法，有利于与剪应力的机理研究和示范因果。然而，任何限制， 在体外的方法是假设，这将充分概括复杂的环境，在本地动脉内皮细胞在体内 ，长期适应复杂的流动模式和与其他细胞，基质和体液调解，规范自己的行为相互作用。
值得注意的是，所有上述结果是在短期模型等可能没有时间不变。然而，他们代表的实验中，我们通常进行调查机制下的一种急性炎症的挑战。一个相关的策略为我们的研究是从低剂量的肿瘤坏死因子-α刺激，4小时VCAM-1表达的近似峰炎症基线的变化监测。我们在一些研究中，在表面VCAM-1的表达变化在这些条件下，增强单核细胞招聘相关记录。2-4 17
此外，SS的波形选择，可以唤起差的内皮细胞的反应。在我们代表的协议，我们记录的VMMC的使用量化HAEC单核细胞黏附事件条件根据第听到讲是代表网站的相对性（HSS）和易感性（OSS）在动脉粥样硬化的动脉在定制的剪切设备选择。对欧共体的炎症激活体内流干扰网站具有更大的放任与以前的研究结果，在培养欧共体，高速钢减毒细胞因子激活的相对开放源码软件的反应是一致的。12，13的结果是一致的。而这些条件通常用来分别代表原状和扰动流，他们不完全概括复杂的血管中流动。然而，丰富的文献支持其使用简单，充分再现突出的流动特性的近似14。
值得注意的是，我们的锥板基础的惩教署是不再像以前报告期间产生更复杂的波形和调节细胞的能力。因此，惩教署配对中所描述的公关VMMCotocol赋予最大程度的灵活性。在于关于剪切空调在惩教署的方向考虑中的VMMC方向这种方法的一个，它在圆周方向的HAEC经验流。在实践中，VMMC导向，使渠道流场和进口调节细胞上游尽可能平行。渠道是足够小，这代表了一个合理的近似。然而，我们在先前的研究还表明，平行或垂直的方向剪空调在VMMC流动的单核细胞没有影响如图2所示的结果。2
体外技术相关的其他注意事项包括由与串行欧共体在欧共体孤立或单核细胞的传代培养和异质性相关的表型漂移引起的变异。通常应使用第6代和每批HAEC特点一致TNF-α的炎症反应。如THP-1细胞线的使用可以减少使用的单核细胞，不同的捐助者的活动，很容易被激活其隔离相关的变异。为了确保重现性和准确的读数功能，细胞的制备和传输时间，应尽量减少。精心挑选的控制是必要的，有意义的解释结果。根据实验，这些可能包括未经处理或静态培养细胞，肿瘤坏死因子-α治疗，未激活的THP-1细胞，阻断抗体的siRNA或药理抑制剂的使用，和其他人。
我们证明了该方法的通用性，适用于这些设备的调查中HAEC细胞因子，脂质3，4和RAGE诱导炎症。我们的研究包括测量人S炎症潜在的血源性脂质颗粒内皮细胞3，4和单核细胞ubjects 17可提出替代战略，单核细胞衍生与固定，如VCAM-1分子的审查粘附机制与基板。使用这种方法，我们先前表现出粘附分子CD11c的，很晚抗原（VLA）在单核细胞粘附-4 VCAM-1在17人类和小鼠血脂合作的职能作用18。由于单核细胞可以很容易地激活他们的隔离，我们还开发了我们的实验室芯片设备为使用的全血检测，以便更敏感和重复性检测17。
最终，除了提供了潜在的动脉粥样硬化的早期炎症事件的洞察力，我们设想，这项技术的发展将导致个人的炎症介导的心血管疾病的风险评估，以忠实的体外方法，铺平了WAY为开发个性化的诊断报告单核细胞和EC激活。
| 板锥细胞的剪切设备 | ||
| 锥半径 | 0.06985 | 米 |
| 锥角 | 0.00877（0.5°） | RAD（度） |
| 间隙高度 | 20±10 | 微米 |
| 最大角速度（这里列出的实验） | 18.85 | 为rad / s |
| 运动粘度 | 0.00077 | 米2 /秒 |
| 最大数r（这里列出的实验） | 0.000758 | 量纲 |
| VMMC规格 | ||
| 通道长度 | 8 | 毫米 |
| 通道高度 | 60 | 微米 |
| 通道宽度 | 2 | 毫米 |
| 雷诺数 | 1.67 | 量纲 |
表1。CSD和VMMC规范。
图4。由以上固定的细胞培养基材旋转不锈钢圆柱锥细胞剪切锥板装置（CSD）的横截面视图。惩教署。锥角和间隙高度的关键参数定义存在的培养基中产生的剪切场的性质。一种改进的雷诺数显示离心粘滞力的关系是：
<BR />
其中r是圆锥半径，角速度ω，α为锥角，ν为流体的运动速度。当R << 1离心力低，流动是层流和纯粹的方位，和引起的剪应力是在单层不变。在我们的惩教署19，基底细胞培养室，里面的从底部到加载锥。介质添加到室和用于剪切流体。安装与预先加载的精密轴承和由微步进电机驱动的旋转锥。精密的调平系统维护细胞基质垂直对齐。差距的高度（从锥细胞基质的顶点距离定义）设置一个高精度深度计。润滑脂捕捉和媒体密封到位，以确保该室房屋的细胞保持清洁，无油污和杂物。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国立卫生研究院/ NHLBI赠款以R01 HL082689一西蒙斯科特和安东尼·G. Passerini。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
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