Summary
يتم تطبيق تدفق غرف ميكروفلويديك محفورا الحجرية التصويرية وملفقة من PDMS لبحث النتائج الفنية المرتبطة ضعف EC والالتهابات. ويتجلى في تجربة الممثلين، وقدرة إجهاد القص الفرق لتعديل الوحيدات التصاق الخلية لتنشيط monolayers EC خلوى.
Abstract
وتصلب الشرايين من potentiated حالات الشذوذ الأيضي التي تسهم في زيادة حالة التهاب النظامية مما أدى إلى ضعف البطانية. ومع ذلك، لا يتم في وقت مبكر من التغييرات الوظيفية البطانة التي تدل على مستوى الفرد من المخاطر المقررة مباشرة سريريا للمساعدة في استراتيجية الدليل العلاجي. وعلاوة على ذلك، تنظيم الالتهاب بواسطة ديناميكا الدم المحلية يسهم في توزيع غير العشوائية المكانية من تصلب الشرايين، ولكن من الصعب آليات لتحديد في الجسم الحي. وصفنا نهج المختبر على واحد في رقاقة القائم على الفحص اضطراب التمثيل الغذائي للأحداث كميا التهابات في خلايا بطانية الإنسان (EC) وحيدات في ظل ظروف تدفق دقيقة. وتستخدم الطرق القياسية من الطباعة الحجرية الناعمة لغرف ميكروفلويديك microfabricate الأوعية الدموية المحاكاة (VMMC)، والتي لا بد مباشرة إلى monolayers EC مثقف. 1 هذه الأجهزة لديها ميزة استخدام كميات صغيرة من الكواشف بينماتوفير منبر للتصوير الأحداث مباشرة التهابات في الغشاء من EC يتعرض إلى حقل القص واضحة المعالم. لقد طبقنا بنجاح هذه الأجهزة للتحقيق خلوى-، 2-3 الدهنية و 4 و RAGE يسببها التهاب-5 EC في الأبهر الإنسان (HAEC). نحن هنا توثيق استخدام VMMC إلى الخلية مقايسة الوحيدات (THP-1) المتداول والقبض على monolayers HAEC التي هي مشروطة في إطار خصائص القص الفرق وتفعيلها من خلال السيتوكينات الالتهابية TNF-α. مثل هذه الدراسات وتقديم رؤية الآلية في atherosusceptibility عوامل الخطر الأيضية تحت.
Protocol
1. زراعة الخلايا وإعداد الركيزة
- قطع 3-بوصة ركائز دائرية من 100 × 20 ملم صحن زراعة الأنسجة (BD فالكون) باستخدام مخرطة. تعقيم ركائز بواسطة الغطس في الايثانول 70٪. مكان في صحن بيتري ومعطف مع 4-I نوع الكولاجين مل (100 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم شطف مع 4 × 1 مل PBS.
- تعليق الإنسان الخلايا البطانية الأبهر (HAEC، مرور 4-6) في 6.5x10 5 خلايا / مل والبذور من خلال تطبيق 1 مل مباشرة إلى الركيزة. المكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة الخلايا وتسمح للالتزام الركيزة لمدة 1 ساعة.
- أضف 9 مل من متوسط نمو بطانة-2 (EGM-2) تستكمل مع الحل للمضادات الحيوية مضاد فطري 1X إلى الخلايا. تغيير وسائل الإعلام كل يوم 2 حتى الخلايا تصل إلى 90٪ confluency.
- الحفاظ على THP-1 في الخلايا المتوسطة 1640 RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و1X حل للمضادات الحيوية مضاد فطري. خلايا مرور عندما تصل كثافة من 10 6 خلية / مل.
2. قص الخلايا البروتوكول
هي مشروطة في خلايا مخروطية مخصصة وجهاز الخليوي لوحة القص (CSD). يتم توثيق تفاصيل الجهاز ومواصفات التصميم في الجدول 1 والشكل 4.
- إعداد لجنة التنمية المستدامة. تعقيم غرفة السكن مع الإيثانول وشطف مع PBS العقيمة. تسخين الإسكان إلى 37 ° C ومستوى لضمان أن مخروط هو عمودي على أحادي الطبقة الخلية. تجميع الركيزة مع الخلايا من الجزء السفلي من السكن وتعيين مخروط إلى الارتفاع المطلوب.
- استخدام ليبوفيتز-15 (L-15) متوسطة تستكمل مع BulletKit غشائي باعتبارها وسيلة للحفاظ على درجة الحموضة القص السليم في غياب CO 2. لتحفيز الالتهاب، إضافة عامل نخر الورم α (TNF-α، و 0.5 نانوغرام / مل) إلى المتوسطة القص وحقن 6 مل في الجهاز عن طريق حقنة متصلة إلى منفذ مدخل، مع الحرص على عدم إدخال الهواءفقاعات في القاعة.
- القص وإجهاد الخلايا حجم القص ثابت عالية (HSS، 15 داين / سم 2) أو إجهاد القص متذبذبة (OSS، 0 ± 5 داين / سم 2، 1 هرتز) لمدة 4 ساعة. يتم تحقيق المطلوب SS عن طريق تناوب مخروط فوق خلايا، والتي يتم التحكم بدقة مع محرك الدقيقة خطوة كما هو موضح سابقا 6 وSS الجدار على السطح (τ ث) تقريب بواسطة:
حيث μ هو لزوجة المتوسط، ω هو السرعة الزاوية للمخروط، وα هي الزاوية المخروط (0.5 درجة). يتم ضبط المحاذاة مخروط مع الركيزة في غضون 0.05 ° التسوية من خلال الدقة وارتفاع الفجوة التي حددت في 20 ± 10 ميكرومتر باستخدام مقياس عمق لتقليل التباين كفافي وشعاعي في τ ث. تم التحقق من صحة الجهاز للتأكد من خصائص تدفق الصفحي. إزالة جells من الجهاز والاستعداد لتحليل التصاق الوحيدات.
3. تصنيع PDMS ميكروفلويديك غرفة
- الحصول على القالب الرئيسي لقناة ميكروفلويديك المطلوب رقم والارتفاع قناة بالاعتماد على التطبيق. وترد تفاصيل خصائص التصميم المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. هو جيد بالفعل توثيق طريقة لخلق هذه في الأدب .. 1 لفترة وجيزة، تم تصميم شبكة من القنوات باستخدام برنامج CAD (أوتوديسك المخترع) وطبع في 5000 نقطة في البوصة على الشفافية. ونسج مقاومة للضوء السلبية (SU8) على رقاقة السيليكون لسمك 100 ميكرون. ومضافين الشفافية وتعرضها للضوء الأشعة فوق البنفسجية. تتم إزالة بلمرة غير مقاومة للضوء لتوليد رئيسية طبق الاصل إيجابية.
- لجعل مزيج سيليكون PDMS قاعدة حل مع سيليكون علاج وكيل وزنا 10:01 في قارب تزن واثارة مع الماصة لالمصلية 5 مل. يجب الحرص على عدم كشط الجدرانمن وزن القارب إلى تجنب إضافة رقائق البلاستيك إلى الحل.
- وضع رقاقة ماجستير في طبق بتري 100x15mm وصب حل PDMS في الطبق.
- تغطية صحن ووضعه في وعاء فراغ لمدة 15 دقيقة لإزالة الفقاعات. بعد 15 دقيقة تأخذ طبق بتري بها وإزالة أي فقاعات تهب بلطف الزائد عن طريق الهواء فوق السطح.
- وضع طبق بتري في فرن لمدة 1 ساعة عند 70 ° C. إزالة الطبق وقطع الدوائر ميكروفلويديك باستخدام شفرة حادة.
4. جمعية مجهر الأجهزة على
- بدوره على مصدر الضوء لمجهر مقلوب وتعيين سخان إلى 37 ° C. نعلق أنابيب إلى حقنة 10 مل وملء مع الماء المقطر مثل عدم وجود فقاعات. وضع الحقنة في مضخة المحاقن ومجموعة معدل التدفق للحث على الجدار SS من 1 داين / سم 2. ويقترب من الجدار إجهاد القص (τ ث) ولدت على طول محور للقناة باستخدام معيارمعادلة دائرة تدفق مواز لوحة:
حيث μ هو لزوجة متوسطة، Q هي معدل التدفق الحجمي، H ارتفاع القناة، وW هو عرض القناة ملاحظة: منذ القنوات من عرض محدود الفعلية τ ث ث سوف تختلف مع اعتمادا على القناة يتم تجنب نسبة الارتفاع، والقياسات في 25٪ أقرب الجدران الجانبية. 1،7 - وضع PDMS غرفة في الماء واستخدام micropipette 100μl لإزالة الهواء من القنوات الفردية. إرفاق محول فراغ لغرفة التأكد من أن يتم تعيين إلى إيقاف صمام.
- وضع طبق بتري مع أحادي الطبقة HAEC على الهدف. ضع دائرة PDMS على طبق بتري وتعيين بعناية على أحادي الطبقة HAEC فيما أكد أنه لا يوجد شكل فقاعات الهواء بين الجهاز وأحادي الطبقة و. تحويل صمام بحيث الفراغ على وترتبط بقوة للغرفة. قطع الإبر قياس 19 تخفف بحيث لا يوجد سوى 5 مم من اليسار المعادن. ملء خزان البلاستيك مع العازلة وضعت في مدخل غرفة PDMS. تكرار لعدد مناسب من القنوات لاستخدامها. إرفاق أنابيب المضخات من حقنة لمخارج قناة PDMS.
5. الوحيدات الفحص التصاق تحت إجهاد القص
- تعليق THP-1 في الخلايا 2X10 6 خلايا / مل في HBSS + كا 2 + / 2 + المغنيسيوم + HSA 0.1٪. تفعيل THP-1 الخلايا اللحمية تفرخ مع عامل المستمدة-1 (SDF-1، 50 ميكروغرام / مل) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تشغيل مضخة محقنة لإنشاء تدفق، ثم تضاف 50 ميكرولتر من التعليق الخلية إلى الخزان دون إدخال فقاعات الهواء. مرة واحدة يتم تطويره بالكامل التدفق، تبدأ الحصول على البيانات.
- تشغيل لمدة 5 دقائق في معدل التدفق المناسب، مضيفا العازلة للخزان إذا كان الحل يحصل منخفضة. تواصل تدفق العازلة في القنوات لتغسل أي خلايا غير منضم في مجرى التدفق.
6. الحصول على البيانات والتحليل
- الحصول على تسلسل الصور الرقمية في 3 إطارات / ثانية لمدة 2 دقيقة بعد تطويره بالكامل تدفق على طول المحور الطولي للقناة في 3 مواقع في القناة، مع الحرص على عدم تسجيل الدخول مباشرة بعد أو قبل الخروج الموانئ أو في أقرب 25٪ الجانب الجدران.
- حساب عدد الخلايا القبض في الميدان على تحديد التخلص مشرق ظهور له في الطائرة التنسيق نفس أحادي الطبقة.
- يتم تعريف شركة اعتقال خلية من حركة <½ قطر خلية في 10 ثانية. البيانات المتوسط على مدى 3 مجالات هي عشوائية / قناة وقياس باستخدام يماغيج البرمجيات.
7. ممثل النتائج
على الرغم من أن يتعرض بشكل موحد البطانة الوعائية إلى منبهات التي تساهم في التهاب النظامية، وتصلب الشرايين هو مرض التنسيق الذي يتطور بشكل تفضيلي في مواقع اضطراب تدفق في الشرايين، تورط التنوع المكاني في وظيفة بطانة الأوعية الدموية .. 8 9 و 10 TNF-α يدفع استجابة جيدة تتميز في EC يتضمن ما يصل تنظيم جزيئات التصاق الخلايا (الحدب ، على سبيل المثال VCAM-1، ICAM-1، E-selectin) و chemokines أن حيدات تجنيد من التداول، وهي السمة المميزة للآفة تصلب الشرايين المبكر 11 ديناميكا الدم هو منظم هام من النمط الظاهري التهاب بطانة حجم القص 12 عالي الضغط (HSS.؛ على سبيل المثال 15 dynes / سم 2) أو نابض إجهاد القص (PSS؛ على سبيل المثال 15 ± 5 dynes / سم 2) المرتبطة المواقع لمقاومة تصلب الشرايين في الشرايين أسفل TNF-α تنظيم الناجم عن الردود. وعلى العكس، القص حجم منخفض الضغط (LSS؛ مثلا 2 dynes / سم 2) أو متذبذبة القص (OSS؛ على سبيل المثال 0 ± 5 dynes / سم 2)، سمة من المواقع عرضة في الجسم الحي، تفاقم cytokiشمال شرق الناجم عن الالتهاب. 13 و 14 أجهزة لدينا ميكروفلويديك PDMS توفير منصة لإجراء دراسات لاختبار الفرضيات الآلية المتصلة تراكب الإجهاد الأيضي مع عوامل الهيدروديناميكية في تنظيم وظيفة بطانة الأوعية الدموية وعلم الأمراض. ويتضح على نطاق واسع فائدة وبراعة النهج من خلال النتائج التالية ممثل.
الشكل 1. إجهاد القص ينظم تفاضلي THP-1 التصاق الخلية إلى TNF-α monolayers البطانية ملتهبة، بينما حصل هذه البيانات باستخدام بروتوكول مفصلة وموثقة المذكورة أعلاه في الفيديو. تعرضت في وقت واحد monolayers HAEC لجرعة منخفضة من السيتوكينات الالتهابية TNF-α (0.5 نانوغرام / مل، ~ EC 50 ليصل VCAM-1-التنظيم) وإما HSS (15 dynes / سم 2) أو OSS (0 ± 5 dynes / سم 2، 1 هرتز) في CSD مخصص لمدة 4 ساعة كما descriالسرير في بروتوكول مفصلة. وكميا THP-1 اعتقال خلية تدفق القص تحت في غرفة تدفق PDMS. وقد تم اختيار هذا الخط الخلية الذي يحاكي النمط الظاهري للحيدات الإنسان للاستنساخ وسهولة الاستخدام. HSS الموهن الاستجابة الالتهابية مقارنة OSS، مما أدى إلى انخفاض THP-1 اعتقال خلية. وقد تم تحليل البيانات عن طريق لطالبة ر الاختبار ويتم تمثيل كما يعني ± SEM من 3 تجارب مستقلة. مقتبس بإذن من DeVerse وآخرون .. 5
البيانات التالية توضح براعة نهجنا باستخدام أمثلة من عملنا المنشورة. يشار إلى الخروج عن البروتوكول أعلاه حيثما ينطبق ذلك.
الشكل 2. التشكيل من خلوى الناجمة عن التعبير-1 VCAM والتوظيف الوحيدات في الانحدار إجهاد القص. A) وحفز monolayers HAEC مع TNF-α (0.3 نانوغرام / مل) لمدة 4 ساعة تحت فلووقد تحقق ث في VMMC مصممة على أساس نظرية تدفق الهيلي شو. انخفاض 15 A الخطي في حجم SS على طول محور للقناة من خلال تصميم الجدران الجانبية من الغرفة ليتزامن مع تدفق يبسط من 2 الركود الأبعاد ورسم نهاية للقناة، لتتناسب مع خطوط ISO-المحتملة. ونظرا للإجهاد القص الجدار (τ ث) ولدت على طول محور من هذه القناة على مسافة من المدخل المحوري (X) من خلال:
حيث μ هو لزوجة متوسطة، Q هي معدل التدفق الحجمي، H ارتفاع قناة، ث 1 هو عرض مدخل القناة، وL هو طول القناة الكلية. تم اختيار Q لإنشاء التدرج في حجم SS من 16 dynes / سم 2 عند مدخل إلى 0 عند نقطة الركود "أ" القريبة عادل لoutleوقد تم قياس ر. B)-C) VCAM-1 التعبير في الموقع بواسطة المجهر المناعي باستخدام الأجسام المضادة مترافق إلى نقاط الكم وكما وردت كثافة مضان متوسط نسبة (MFI) من السيطرة ثابت unstimulated. لم لا تعدل SS مستوى القاعدية من VCAM-1، وهي نسبة منخفضة في HAEC unstimulated (مثلثات الرمادي). ومع ذلك، زيادة VCAM-1 نسبة إلى التعبير TNF-α في مقادير LSS، وتبلغ ذروتها في dynes 2 ~ / سم 2 والعودة إلى خط الأساس TNF-α أو أقل في القص المقادير> 5 dynes / سم 2 (المربعات السوداء). D) وperfused حيدات (10 6 / مل) في 2 dynes / سم 2 لمدة 5 دقائق في القنوات الموازية تدفق أكثر من monolayers اشترط كما في A). تجنيد الوحيدات إلى البطانة ترتبط كميا مع التعبير-1 VCAM في حجم القص الإجهاد معين. تجدر الإشارة إلى أن القدرة على تحقيق VCAM-1 التعبير والتوظيف الوحيدات مع القرار المكانية غرامة في monolayeكشفت R تغييرات كبيرة خلال نطاق ضيق في حجم SS أن لن يقدر من خلال تطبيق سوى عدد قليل من القيم منفصلة من القص في تجارب منفصلة. وقد تم تحليل البيانات عن طريق تدابير ANOVA المتكررة والخلافات المقررة من قبل نيومان Keuls البعدي، * P <0.05 TNF-α من تحت ظروف ثابتة. ويعني البيانات 3-6 تجارب مستقلة SEM ±. مقتبس بإذن من تسو وآخرون 2. آل
الشكل 3. الدهون الثلاثية البروتينات الدهنية الغنية (طغرل) تعدل خلوى الناجمة عن التهاب في نسبة الدهون الثلاثية إلى مستويات المصل المانحة والتعبير VCAM-1. وحفز monolayers HAEC مع TNF-α (0.3 نانوغرام / مل) لمدة 4 ساعة في وقت واحد مع طغرل (10 ملغ / ديسيلتر ApoB) معزولة عن البشر بعد وجبة عالية الدهون في الثقافة ثابتة. A) VCAM-1 تم قياس التعبير بشكل منفصل في EC علقتها التدفق الخلويوالتصاق الوحيدات كميا باستخدام VMMC كما هو موضح في بروتوكول مفصلة. يتم عرض البيانات في التغيير٪ من TNF-α. اعتقال الوحيدات تختلف في نسبة مباشرة إلى التعبير البطانية-1 VCAM، التي زادت بشكل مباشر مع مستوى الدهون الثلاثية في الدم المانحة. B) تم إلغاء القبض الوحيدات لمجموعة فرعية من الجهات المانحة الموالية للالتهابات في وجود الأجسام المضادة VCAM 1-حظر. تم تحديد أهمية من الطلاب في إقران اختبار t، يعني ± SEM 3-5 تجارب مستقلة. مقتبس بإذن من وانغ وآخرون .. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا استخدام أجهزة ميكروفلويديك PDMS لتقييم على رقاقة من النمط الظاهري التهاب بطانة من خلال التصوير في الوقت الحقيقي من التعبير CAM والتصاق الوحيدات. والميزة الرئيسية لنهجنا يكمن في القدرة على تحديد النتائج المرتبطة ضعف في الخلايا البطانية تتعرض لالتهابات وسطاء مثل الدهون الغذائية والسيتوكينات في ظل ظروف محددة الهيدروديناميكية التي تعكس إجهاد القص في الأوعية معصد. وVMMC تسهيل استخدام كميات صغيرة من الكواشف أو المواد التي قد تكون في العرض المحدود ولها مزايا إضافية تتمثل في كونها غير مكلفة، وقابلة للتخصيص إنتاجية عالية.
استخدام أجهزة ميكروفلويديك يمثل بديلا للنهج macroscale التي استخدمت على مدى عقود للتحقيق في استجابة EC لمثقف القص. وتشمل هذه الغرف تدفق مواز لوحة وأنابيب اسطوانية، ومقياس اللزوجة مخروطية ولوحة، كل منها كاليفورنياpable فرض ثابت، وتدفق الصفحي ظروف Poiseuille (تم استعراضها في 16). يمكن إدخال تعديلات على هذه الأجهزة تنتج التغيرات الزمنية أو المكانية في إجهاد القص الجدار أو حتى ألخص الشرايين الطول الموجي .. 6 ومع ذلك، في هذه الأجهزة تتطلب العام كمية كبيرة من وسائل الإعلام، هي مكلفة لتلفيق، وأقل قدرة على التكيف، والإنتاجية المنخفضة يعانون من نسبيا.
وتوجد أيضا قيود مع استخدام VMMCs. تم تصميم هذه الأجهزة على أساس نظرية تدفق مواز لوحة، والتي يفترض العرض لانهائية. هذا هو افتراض معقول لأجهزة macroscale حيث عرض أكبر بكثير من الارتفاع. ومع ذلك، فإن العرض محدود من القنوات ميكروفلويديك فلابد أن يكون إجراء دراسات على طول مركز المحور الطولي للقناة لإزالة آثار الجدار الجانبي، والفعلية τ ث ث سوف تختلف مع اعتمادا على القناة نسبة الارتفاع. 1 و 7 بالمثل ، لا يتم أخذ قياسات ر إغلاقيا مدخل ومخرج من القنوات لتجنب الآثار المدخل. واستبعد أي أننا كبيرة نظير الصماوي الآثار إشارة أو التهاب الناجم عن الإصابة أو الأضرار التي لحقت EC الناجمة عن اغلاق الجهاز أحادي الطبقة إلى أنها تسهم في ردودنا مراعاتها. PDMS لها قابلية عالية للجزيئات مسعور، والتي يمكن أن تؤدي إلى امتصاص كيموكينات يفرز وغير محددة التفاعلات بين الكريات البيض وVMMC و. ومع ذلك، فإننا لم نجد هذا وجود مشكلة لمدة دراستنا .. 2
استخدام أجهزة تدفق مع الخلايا المستزرعة يشكل المقاربة الاختزالية التي تسهل الدراسات الآلي وإثبات السبب والنتيجة فيما يتعلق إجهاد القص. ومع ذلك، وجود قيود من أي نهج في المختبر هو افتراض أنها سوف ألخص بدرجة كافية عن تعقيد البيئة في الشرايين الأصلية. في الجسم الحي، وتكييفها بشكل مزمن الخلايا البطانية لأنماط معقدة وتدفقعلى مدى التفاعل مع الخلايا الأخرى، مصفوفة، والوسطاء الخلطية التي تنظم سلوكهم.
قد تجدر الإشارة إلى أن كل من النتائج المقدمة أعلاه هي في المدى القصير نماذج وعلى هذا النحو لا يكون الوقت قد حان ثابتة. ومع ذلك، فإنها تمثل من التجارب التي نقوم عادة آلية للتحقيق في إطار التحدي التهابي حاد. استراتيجية في المجال لدراساتنا في رصد التغييرات من خط أساس التهابات من التحفيز TNF-α منخفضة الجرعة، التي تمثل 4 ساعات ذروة في التعبير تقريبي-1 VCAM. وقد وثقت العديد من الدراسات ونحن في أن التغيرات في التعبير سطح VCAM-1 ربط مع تجنيد الوحيدات تعزيز في ظل هذه الظروف. 2-4، 17
وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار الموجي SS تثير ردود البطانية الفرق. في بروتوكول ممثلنا نحن توثيق استخدام VMMC لتحديد الأحداث التصاق الوحيدات في HAEC مشروطة تحت قنسمع الضغوط اختارت أن تكون ممثلة لمواقع المقاومة النسبية (HSS) والقابلية (OSS) لتصلب الشرايين في الشرايين في جهاز قص الخلية حسب الطلب. بما يتفق مع النتائج السابقة في EC مثقف، HSS الموهن الرد على تفعيل خلوى نسبة إلى OSS. 12 و 13 والنتائج متسقة مع زيادة الإباحية لتفعيل التهاب EC في مواقع اضطراب تدفق في الجسم الحي. في حين يشيع استخدام هذه الشروط لتمثيل تدفق دون عائق وتزعج التوالي، فإنها لا ألخص بشكل كامل تعقيد التدفق في الشرايين. ومع ذلك، وثروة من الأدب يدعم استخدامهم تقريبية بسيطة التي تتكاثر على نحو كاف الميزات البارزة تدفق 14
والجدير بالذكر أن لدينا مخروطية ومقرها لوحة CSD قادر على توليد الموجات أكثر تعقيدا وخلايا تكييف لفترات أطول كما ذكرت سابقا .. 6 وهكذا، إقران VMMC مع CSD في العلاقات العامة صفهاotocol يضفي أقصى درجة من المرونة. A النظر في هذا النهج يكمن في التوجه للVMMC فيما يتعلق باتجاه تكييف القص في CSD، الذي HAEC تدفق الخبرة في الاتجاه كفافي. في الممارسة العملية، وVMMC موجه بحيث تكون موازية مع قنوات مجال التدفق ومدخل للهواء المنبع من الخلايا بقدر الإمكان. القنوات هي صغيرة بما يكفي أن هذا يمثل تقريب معقول. ومع ذلك، فإننا أيضا أظهرت في دراسة سابقة أن تتدفق حيدات أو موازية لعمودي على اتجاه تكييف القص في VMMC لم تؤثر على النتائج الموضحة في الشكل 2 .. 2
الاعتبارات الإضافية المرتبطة في تقنيات المختبر وتشمل التقلبات الناجمة عن الانجراف المظهري المرتبطة الركض مسلسل EC في الثقافة وعدم التجانس في EC معزولة أو حيدات. وينبغي عادة أن تستخدم من قبل HAEC مرور 6 و الكثير كلتتميز لاستجابة التهابية مستمرة لTNF-α. يمكن استخدام خط الخلية مثل THP-1 الحد من التقلبات المرتبطة استخدام حيدات، والتي تختلف في النشاط من قبل الجهات المانحة ويتم تنشيط بسهولة عن طريق عزلتهم. من أجل ضمان ينبغي التقليل قراءات وظيفية قابلة للتكرار ودقيقة، وإعداد الخلايا ونقل مرات. الاختيار الدقيق للضوابط لا بد من تفسير النتائج بصورة مجدية. اعتمادا على التجربة، وقد تشمل هذه الخلايا غير المعالجة أو ثابت مثقف، TNF-α العلاج، unactivated الخلايا THP-1، واستخدام الأجسام المضادة حظر، أو مثبطات siRNAs الدوائية، وغيرها.
كما شاهدا على براعة هذا النهج، وقد طبقنا هذه الأجهزة للتحقيق خلوى-، 2-3 الدهنية و 4 و RAGE يسببها التهاب-5 في HAEC. وشملت دراستنا قياس القدرة التهابات جزيئات الدهون في الدم المستمدة من ق الإنسانubjects على الخلايا البطانية 3 و 4 و حيدات 17 في استراتيجية بديلة، قد يكون قدم حيدات مع ركائز derivatized مع جزيئات يجمد مثل VCAM-1 لدراسة آليات الالتصاق. باستخدام هذا النهج، ونحن في السابق أثبتت دور وظيفي للالتصاق جزيء CD11c، الذي يتعاون مع مستضد في وقت متأخر جدا (VLA) -4 في التصاق الوحيدات لVCAM-1 خلال دسليبيدميا في البشر 17 و الفئران. 18 منذ حيدات يمكن تفعيلها بسهولة عن طريق عزلتهم، ونحن أيضا بتطوير فحص الدم الكامل للاستخدام مع جهاز لاب رقاقة لدينا للسماح للكشف عن أكثر حساسية وقابلة للتكرار 17
في نهاية المطاف، بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة الأحداث في وقت مبكر التهاب الكامنة وراء تصلب الشرايين، ونحن نتصور أن هذا التطور سيؤدي إلى التكنولوجيا المؤمنين السابقين فيفو نهج لتقييم المخاطر الفرد من التهاب بوساطة أمراض القلب والشرايين، مما يمهد ثAY لتطوير التشخيص الشخصية التي يقدم تقريرا عن تفعيل الوحيدات وEC.
| مخروطية و-اللوحة الأجهزة المحمولة القص | ||
| مخروط الشعاع | 0،06985 | م |
| مخروط زاوية | 0.00877 (0.5 درجة) | راد (درجة) |
| الفجوة الطول | 20 ± 10 | ميكرومتر |
| ماكس السرعة الزاوية (للتجارب المذكورة هنا) | 18،85 | راد / ثانية |
| اللزوجة الحركية | 0،00077 | م 2 / ث |
| R ماكس عدد (للتجارب المذكورة هنا) | 0.000758 | أبعاد |
| VMMC مواصفات | ||
| قناة طول | ثمانية | مم |
| قناة الطول | 60 | ميكرومتر |
| قناة العرض | 2 | مم |
| عدد رينولدز | 1.67 | أبعاد |
الجدول 1. CSD وVMMC مواصفات.
الشكل 4. مستعرضة نظرا مخروطية لوحة الخلية وجهاز القص (CSD)، ويتكون من CSD مخروط الفولاذ المقاوم للصدأ أسطواني التي تدور فوق الركيزة خلية ثقافة ثابتة. زاوية المخروط وارتفاع الفجوة من المعلمات الحرجة التي تحدد طبيعة مجال القص المنتجة في وجود ثقافة المتوسط. ويرد عدد رينولدز معدلة تظهر علاقة الطرد المركزي لقوى اللزوجة حسب:
<ر />
حيث r هو نصف قطر مخروط، هو السرعة الزاوية ω، α هو مخروط زاوية، وν هو السرعة الحركية للسائل. عندما R هو << 1 القوى النابذة منخفضة، وتدفق الصفحي هو والسمتي بحتة، والناجمة عن إجهاد القص هو ثابت على مدى أحادي الطبقة. (19) وفي CSD لدينا، يتم تحميل الركيزة مع الخلايا المستزرعة من أسفل إلى الدائرة التي تضم مخروط. يضاف إلى الدائرة المتوسطة واستخدام السائل القص. هي التي شنت المخروط مع محامل الدقة قبل تحميلها وتناوب يقودها موتور خطوة صغيرة. نظام التسوية الدقة تحافظ عمودي محاذاة إلى الركيزة الخلية. تم تعيين ارتفاع الفجوة (التي يحددها المسافة من قمة المخروط إلى الركيزة خلية) مع قياس عمق عالية الدقة. A الشحوم صيد الفقمة ووسائل الإعلام التي وضعت لضمان أن يتم الاحتفاظ غرفة السكن الخلايا نظيفة وخالية من النفط والحطام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 / NHLBI HL082689 لسكوت سيمون I. وانطوني باسيريني G..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
