Summary
Chambres d'écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l'inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l'adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.
Abstract
Athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d'inflammation systémique résultant dans la dysfonction endothéliale. Cependant, les premiers changements fonctionnels dans l'endothélium qui signifient au niveau d'un individu de risque ne sont pas directement évaluée en clinique pour aider à la stratégie de guide thérapeutique. En outre, la régulation de l'inflammation par l'hémodynamique locale contribue à la distribution spatiale non aléatoire de l'athérosclérose, mais les mécanismes sont difficiles à délimiter in vivo. Nous décrivons une approche de laboratoire-sur-une-puce basée sur la perturbation métabolique de déterminer quantitativement les événements inflammatoires dans les cellules endothéliales humaines (CE) et des monocytes dans des conditions d'écoulement précis. Les méthodes standard de lithographie douce sont utilisés pour microfabricate vasculaires mimétiques chambres microfluidiques VMMC), qui sont directement liés à la culture des monocouches de la CE. 1 Ces dispositifs ont l'avantage d'utiliser de petits volumes de réactifs, tout enfournir une plate-forme pour l'imagerie directement les réactions inflammatoires à la membrane de CE exposé à un champ de cisaillement bien définie. Nous avons appliqué avec succès ces dispositifs pour étudier les cytokines, 2 lipidique-3, 4 et 5 RAGE-induite dans l'inflammation humaine aortique CE (AHCE). Ici, nous documenter l'utilisation de la VMMC à la cellule de dosage monocytaire (THP-1) de roulement et à l'arrestation sur des monocouches de HAEC qui sont conditionnés selon des caractéristiques de cisaillement différentielles et activé par la cytokine inflammatoire TNF-α. Des études comme celles-ci fournissent une approche mécanistique dans atherosusceptibility sous facteurs de risque métaboliques.
Protocol
1. Culture cellulaire et de préparation des supports
- Couper 3-pouces substrats circulaires à partir d'un 100 x 20 mm boîte de culture de tissus (BD Falcon) en utilisant un tour. Stériliser substrats par immersion dans l'éthanol à 70%. Placer dans une boîte de Pétri et les enrober de 4 ml collagène de type I (100 pg / ml) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 4 ml de PBS 1 x.
- Suspendre les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC, le passage 4-6) à 6.5x10 5 cellules / ml et des semences en appliquant 1 ml directement sur le substrat. Placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur et permettent aux cellules d'adhérer au substrat pendant 1 heure.
- Ajouter 9 ml de croissance de l'endothélium moyen-2 (EGM-2) complétée avec 1x antibiotiques antimycosiques solution aux cellules. Changer les médias tous les 2 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.
- Maintenir cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et 1x antibiotiques antimycosiques solution. Au passage des cellules quand elles atteignent une densité de 10 6 cellules / ml.
2. Protocole Shearing portable
Les cellules sont conditionnés dans une mesure cône-plaque de dispositif de cisaillement cellulaire (CDD). Indications sur l'appareil et les spécifications de conception sont documentées dans le tableau 1 et figure 4.
- Préparer la CDD. Stériliser le boîtier de la chambre avec de l'éthanol et rincer avec du PBS stérile. Chauffer le boîtier à 37 ° C et le niveau de sorte que le cône est perpendiculaire à la monocouche de cellules. Assembler le substrat avec les cellules à partir du fond du boîtier et définir le cône à la hauteur désirée.
- Utilisation Leibovitz-15 (L-15) un milieu supplémenté avec BulletKit endothéliale que le milieu de cisaillement pour maintenir le pH approprié en l'absence de CO 2. Pour stimuler l'inflammation, ajouter facteur de nécrose tumorale α-(TNF-α, 0,5 ng / ml) dans le milieu de cisaillement et d'injecter 6 ml dans le dispositif par l'intermédiaire d'une seringue reliée à un orifice d'entrée, en prenant soin de ne pas introduire de l'airbulles dans la chambre.
- Cellules de cisaillement à une contrainte de cisaillement de forte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm 2) ou une contrainte de cisaillement oscillatoire (OSS, 0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) pendant 4 heures. Le SS désiré est obtenu en faisant tourner le cône au-dessus des cellules, qui est contrôlée avec précision avec un moteur micro-pas à pas, comme décrit précédemment 6 Le SS mur à la surface (τ w) est approchée par.:
où μ est la viscosité du milieu, ω est la vitesse angulaire du cône, et α est l'angle de cône (0,5 °). L'alignement du substrat avec une membrane est ajustée à l'intérieur 0,05 ° par nivellement de précision et la hauteur d'écartement fixé à 20 ± 10 um moyen d'une jauge de profondeur pour minimiser la variation circonférentielle et radiale dans τ w. Le dispositif a été validé pour garantir les caractéristiques d'écoulement laminaire. Retirer caunes de l'appareil et se préparer pour l'analyse de l'adhésion des monocytes.
3. Fabrication de PDMS Microfluidique Chambre
- Obtenir moule maître pour le numéro de canal désiré microfluidique et la hauteur de canal en fonction de l'application. Les caractéristiques de la conception spécifique utilisé dans ce protocole sont détaillées dans le tableau 1. La méthode pour créer ceux-ci est déjà bien documenté dans la littérature 1. En bref, le réseau de canaux a été conçu en utilisant le logiciel de CAO (Autodesk Inventor) et imprimé à 5000 dpi sur un transparent. Photorésist négatif (SU8) est filée sur une plaquette de silicium jusqu'à une épaisseur de 100 microns. La transparence est recouverte et exposée à la lumière UV. Non-polymérisé de photorésist est éliminé pour générer le maître réplique positif.
- Pour faire une solution PDMS mélange à base de silicone avec du silicone agent de durcissement 10:1 en poids dans un bateau peser et mélanger avec une pipette 5 ml sérologique. Veillez à ne pas racler les paroisBateau de la pesée de ne pas ajouter flocons de plastique à la solution.
- Placer la galette maître dans un plat 100x15mm Petri et versez la solution PDMS dans le plat.
- Couvrir le plat et le placer dans un récipient vide pendant 15 minutes pour éliminer les bulles. Après 15 minutes de prendre la boîte de Petri et enlever les bulles excès par soufflage d'air doucement sur la surface.
- Placez la boîte de Petri dans un four pendant 1 heure à 70 ° C. Retirer le plat et découpez les chambres microfluidiques à l'aide d'une lame tranchante.
4. Assemblée des périphériques sur Microscope
- Tournez sur la source de lumière pour microscope inversé et mis en chauffe à 37 ° C. Fixer le tube à une seringue de 10 ml et remplir d'eau distillée de sorte qu'il n'y ait pas de bulles. Placez la seringue dans le pousse-seringue et le débit ensemble pour induire un SS de paroi de 1 dyne / cm 2. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne médiane du canal est approchée en utilisant la normeéquation pour une chambre d'écoulement à plaques parallèles:
où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur de canal note:. depuis les canaux sont de largeur finie de la réelle τ w varie avec w en fonction du canal rapport d'aspect, et les mesures sont évités à 25% plus proche des parois latérales. 1,7 - Placez PDMS chambre dans l'eau et utiliser une micropipette 100 pi pour éliminer l'air à partir des canaux individuels. Fixer l'adaptateur à vide à la chambre de faire en sorte que la vanne est mise hors service.
- Placez boîte de Pétri avec monocouche OAB sur l'objectif. Placez la chambre PDMS sur la boîte de Pétri et mettez sur la monocouche OAB, tout en assurant qu'aucune bulle d'air se forment entre l'appareil et la monocouche. Tournez la vanne de sorte que le vide est en marche et la chambre est fermement attaché. Couper 19 aiguille de calibre émousser telle qu'il n'y a qu'un 5 mm de gauche métallique. Remplissez le réservoir en plastique avec un tampon et de mettre en PDMS chambre d'entrée. Répétez l'opération pour un nombre approprié de canaux qui seront utilisés. Fixer le tube de pompes à seringues pour PDMS exits de canal.
5. Essai d'adhérence des monocytes sous contrainte de cisaillement
- Suspendre cellules THP-1 à 2x10 6 cellules / ml dans du HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + HSA + 0,1%. Activer cellules THP-1 par l'incubation avec le facteur-1 dérivé stromal (SDF-1, 50 pg / ml) pendant 15 min à température ambiante.
- Activer la pompe à seringue pour établir un flux, puis ajouter 50 ul de la suspension cellulaire au réservoir sans introduire de bulles d'air. Une fois le débit est pleinement développé, commencez d'acquisition de données.
- Course à 5 min à un débit approprié, ajout d'un tampon dans le réservoir si la solution est faible. Continuer coule dans les canaux mémoire tampon pour laver toutes les cellules non liées dans le flux.
6. Acquisition et analyse des données
- Acquérir des séquences d'images numériques à 3 images / s pendant 2 min à la suite d'écoulement entièrement développé le long de l'axe longitudinal du canal à 3 endroits dans le canal, en prenant soin de ne pas enregistrer immédiatement après l'entrée ou avant des orifices de sortie ou dans les 25% plus proche du côté murs.
- Comptez le nombre de cellules arrêtées par champ en identifiant leur phase brillante apparition dans le même plan focal que la monocouche.
- Arrestation cellule ferme est définie par le mouvement <diamètre des cellules ½ en 10 s. Les données moyennes de plus de 3 champs aléatoires / canal et de quantifier l'aide du logiciel ImageJ.
7. Les résultats représentatifs
Bien que l'endothélium vasculaire est uniformément exposée à des agonistes qui contribuent à l'inflammation systémique, l'athérosclérose est une maladie focale qui se développe préférentiellement sur les sites de perturbation de débit dans les artères, impliquant l'hétérogénéité spatiale de la fonction endothéliale. 8 9, 10 TNF-α induit une réponse bien caractérisé en CE qui inclut la régulation positive de molécules d'adhésion cellulaire (CAM ; par exemple de VCAM-1, ICAM-1, E-sélectine) et des chimiokines qui recrutent les monocytes de la circulation, une caractéristique de la lésion athéroscléreuse début 11 Hémodynamique est un régulateur important de phénotype inflammatoire endothéliale 12 niveau élevé de stress de cisaillement ampleur (HSS..; p.ex. 15 dynes / cm 2) ou des contraintes de cisaillement pulsatile (PSS; par exemple 15 ± 5 dynes / cm 2) associé à des sites de résistance à l'athérosclérose dans les artères réguler à la baisse du TNF-α-réponses induites. A l'inverse, faible niveau de stress de cisaillement grandeur (LSS; par exemple 2 dynes / cm 2) ou de cisaillement oscillatoire (OSS; par exemple, 0 ± 5 dynes / cm 2), les caractéristiques des sites sensibles in vivo, exacerbent cytokine l'inflammation induite par. 13, 14 microfluidiques Nos appareils PDMS fournir une plateforme pour la réalisation d'études mécanistiques de tester des hypothèses liées à la superposition de stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques dans la régulation de la fonction endothéliale et de la pathologie. L'utilité et la polyvalence de l'approche est largement illustré par les résultats représentatifs suivants.
Figure 1. La contrainte de cisaillement module différentiellement adhérence THP-1 de cellules au TNF-alpha enflammées monocouches endothéliales. Ces données ont été acquises en utilisant le protocole détaillé ci-dessus décrit et documenté dans la vidéo. Monocouches OAB ont été simultanément exposés à une faible dose de la cytokine inflammatoire TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE 50 pour VCAM-1 up-régulation) et soit HSS (15 dynes / cm 2) ou OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) dans un CDD personnalisé pendant 4 heures comme descrilit dans le protocole détaillé. THP-1 arrestation cellules a été quantifiée dans un écoulement de cisaillement dans une chambre d'écoulement PDMS. Cette lignée cellulaire qui imite le phénotype des monocytes humains a été choisi pour sa reproductibilité et sa facilité d'utilisation. HSS atténué la réponse inflammatoire par rapport à l'OSS, ayant entraîné un arrêt des cellules THP-1 a diminué. Les données ont été analysées par Student-test et sont représentées en moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de DeVerse et al. 5
Les données suivantes démontrent la polyvalence de notre approche en utilisant des exemples de notre travail publié. Départs à partir du protocole ci-dessus sont indiquées le cas échéant.
Figure 2. La modulation de cytokine induite par l'expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes dans un gradient de contrainte de cisaillement. A) monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures sous flow dans un VMMC conçue sur la base de la théorie d'écoulement de Hele-Shaw. 15 A diminution linéaire de grandeur SS le long de la ligne médiane du canal a été obtenue en concevant les parois latérales de la chambre de manière à coïncider avec les lignes de courant d'un flux à deux dimensions et la stagnation de mise en forme l'extrémité du canal pour correspondre aux lignes d'iso-potentiels. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne centrale de ce canal à une distance axiale de l'entrée (x) est donnée par:
où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, w 1 est la largeur de canal d'entrée, et L est la longueur totale du canal. Q est choisi pour générer un gradient de grandeur SS de 16 dynes / cm 2 à l'entrée à 0 au point de stagnation "a" juste en amont de l'outlet. B) à C) l'expression de VCAM-1 a été mesurée in situ par immunofluorescence en utilisant des anticorps conjugués à des points quantiques et présenté comme intensité de la fluorescence pourcentage médian (MFI) de contrôle statique non stimulé. SS n'a pas de moduler le niveau basal de VCAM-1, qui est faible en non stimulées OAB (triangles gris). Toutefois, l'expression de VCAM-1 a augmenté par rapport au TNF-α à des amplitudes LSS, avec un pic à ~ 2 dynes/cm2 et le retour à la ligne de base du TNF-α ou au-dessous des magnitudes de cisaillement> 5 dynes / cm 2 (carrés noirs). D) monocytes (10 6 / ml) ont été perfusés à 2 dynes/cm2 pendant 5 min dans des canaux d'écoulement parallèles sur des monocouches préconditionnés comme dans A). Le recrutement des monocytes à l'endothélium quantitativement corrélée à la VCAM-1 'expression d'une magnitude contrainte de cisaillement donné. Notamment, la capacité de sonder l'expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes avec une résolution spatiale fine dans un monolayer ont révélé des changements significatifs au cours d'une gamme étroite de grandeur SS qui ne seraient pas appréciés en appliquant seulement quelques valeurs discrètes de cisaillement dans des expériences séparées. Les données ont été analysées par ANOVA mesures répétées et les différences évaluées par post-test de Newman-Keuls, * P <0,05 à partir de TNF-α dans des conditions statiques. Les données sont la moyenne ± SEM de 3-6 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Tsou et al. 2
Figure 3. Lipoprotéines riches en triglycérides (TGRL) moduler l'inflammation induite par les cytokines en proportion à des niveaux de triglycérides sériques et donateurs de VCAM-1 expression. Monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures en même temps que TGRL (10 mg / dl ApoB) isolés à partir des sujets humains après un repas riche en graisses en culture statique. A) l'expression de VCAM-1 a été mesurée séparément dans suspendue CE par cytométrie en fluxet l'adhésion des monocytes quantifiée en utilisant un VMMC tel que décrit dans le protocole détaillé. Les données sont présentées comme variation en% par le TNF-α. Arrestation des monocytes varié en proportion directe de l'endothélium expression de VCAM-1, qui a augmenté directement avec le niveau de triglycérides de sérum de donneur. B) L'arrestation des monocytes pour un sous-ensemble de pro-inflammatoires donneurs a été abrogée en la présence d'un VCAM-1 anticorps bloquant. La signification a été déterminée par jumelé t de Student-test, des moyens ± SEM de 3-5 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Wang et al. 4
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Discussion
Nous décrivons l'utilisation de dispositifs microfluidiques en PDMS pour l'évaluation sur la puce du phénotype inflammatoire endothéliale par le biais de l'imagerie en temps réel de l'expression CAM et l'adhésion des monocytes. Un avantage majeur de notre approche réside dans la capacité à quantifier les résultats associés à une dysfonction endothéliale dans les cellules exposées à des médiateurs inflammatoires tels que les lipides alimentaires et des cytokines dans des conditions hydrodynamiques définies qui reflètent la contrainte de cisaillement dans les vaisseaux athérogènes. Le VMMC faciliter l'utilisation de petites quantités de réactifs ou les produits qui peuvent être en quantité limitée et présentent les avantages supplémentaires d'être peu coûteux, personnalisable et se prêtent à un débit élevé.
L'utilisation de dispositifs microfluidiques représente une alternative aux approches macro-échelle qui ont été utilisés pendant des décennies pour étudier la réponse de la culture CE au cisaillement. Il s'agit notamment de chambres d'écoulement plaques parallèles, tubes cylindriques, et à cône et plaque viscosimètres, dont chacun est caPable d'imposer des conditions stables, à flux laminaire de Poiseuille (revue dans 16). Les modifications de ces dispositifs peuvent produire des variations temporelles ou spatiales dans la contrainte de cisaillement mur ou même des formes d'onde récapituler artérielle. 6 Toutefois, en général, ces dispositifs nécessitent une grande quantité de médias, sont coûteux à fabriquer, moins adaptables, et souffrent de débit relativement faible.
Il existe également des limitations à l'utilisation des VMMCs. Ces dispositifs sont conçus sur la base de la théorie des écoulements à plaques parallèles, ce qui suppose la largeur infinie. Il s'agit d'une hypothèse raisonnable pour les dispositifs macroscopiques où la largeur est beaucoup plus grande que la hauteur. Toutefois, la largeur finie des canaux microfluidiques nécessite que des études être réalisée le long du centre de l'axe longitudinal du canal afin d'éliminer les effets de paroi latérale, que l'réelle τ w varie avec w selon le rapport d'aspect de canal. 1, 7 même , les mesures ne sont pas prises t procheo l'entrée et la sortie des canaux pour éviter les effets d'entrée. Nous avons exclu toute significatifs paracrines effets de signalisation ou de l'inflammation induite par une blessure ou des dommages causés par la CE du dispositif d'étanchéité à la monocouche comme contribuant à nos réponses observées. PDMS possède une affinité élevée pour les molécules hydrophobes, ce qui pourrait conduire à l'absorption de chimiokines sécrétées et non-spécifiques des interactions entre les leucocytes et l'VMMC. Cependant, nous n'avons pas trouvé que c'était un problème pour la durée de nos études. 2
L'utilisation de dispositifs d'écoulement avec des cellules en culture constitue une approche réductionniste qui facilite les études mécanistes et la démonstration de cause à effet à l'égard de la contrainte de cisaillement. Toutefois, une limitation de toute approche in vitro est l'hypothèse qu'il sera suffisamment récapituler la complexité de l'environnement dans les artères natives. In vivo, les cellules endothéliales sont chroniquement adaptés aux schémas de flux complexes etsont soumis à des interactions avec d'autres cellules, matrice, et des médiateurs humoraux qui régissent leur comportement.
Il est à noter que tous les résultats présentés ci-dessus sont à court terme et des modèles en tant que telle ne peut pas être invariant dans le temps. Cependant, ils sont représentatifs d'expériences que nous couramment effectuer pour enquêter sur mécanisme en vertu d'un défi inflammatoire aiguë. Une stratégie pertinente pour nos études est de suivre l'évolution d'un niveau de référence inflammatoire de faible dose de TNF-α de stimulation, pour laquelle 4 h représente le pic approximative dans l'expression de VCAM-1. Nous avons documenté dans plusieurs études que les changements dans l'expression de surface de VCAM-1 en corrélation avec le recrutement des monocytes renforcée dans ces conditions. 2-4, 17
En outre, le choix de la forme d'onde SS peut évoquer différentielles réponses endothéliales. Dans notre protocole, nous documentons représentant l'utilisation de la VMMC de quantifier les événements l'adhésion des monocytes dans OAB conditionnés vertu de l'artentendre contraintes choisis pour être représentatifs de sites de résistance relative (HSS) et la susceptibilité (OSS) à l'athérogenèse dans les artères dans un dispositif de cisaillement cellule personnalisée. Conformément aux résultats précédents en culture CE, HSS a atténué la réponse à l'activation des cytokines par rapport à l'OSS 12, 13. Les résultats sont compatibles avec une plus grande permissivité à l'activation inflammatoire de la CE sur les sites de perturbation de débit in vivo. Bien que ces conditions sont couramment utilisés pour représenter écoulement non perturbé et perturbé, respectivement, ils ne sont pas pleinement récapituler la complexité des flux dans les artères. Toutefois, une richesse de la littérature prend en charge leur utilisation comme des approximations simples que reproduire adéquatement les caractéristiques de l'écoulement saillants 14.
Notamment, notre cône et plaque à base de CDD est capable de générer des formes d'onde plus complexe et les cellules de conditionnement pour des périodes plus longues comme indiqué précédemment. 6 Ainsi, l'appariement du VMMC avec la CDD dans le décrit protocole confère un degré maximum de flexibilité. Un examen de cette approche réside dans l'orientation de la VMMC à l'égard de la direction de conditionnement de cisaillement dans la CDD, dans laquelle l'écoulement expérience OAB dans la direction circonférentielle. Dans la pratique, l'VMMC est orienté de sorte que les canaux sont parallèles avec le champ d'écoulement et l'entrée en amont de cellules conditionnées autant que possible. Les canaux sont assez petits pour que cela représente une approximation raisonnable. Toutefois, nous avons aussi démontré dans une étude précédente que les monocytes circulant parallèles ou perpendiculaires à la direction de conditionnement de cisaillement dans la VMMC n'a pas d'incidence sur les résultats présentés dans la figure 2. 2
D'autres considérations liées à des techniques in vitro, notamment la variabilité induite par la dérive phénotypique associée à repiquage de série de la CE à la culture et de l'hétérogénéité dans les régions isolées CE ou les monocytes. OAB devrait normalement être utilisée par le passage 6 et chaque lotcaractérisé par une réponse cohérente inflammatoire TNF-α. L'utilisation d'une lignée cellulaire telle que THP-1 peut réduire la variabilité associée à l'utilisation des monocytes, qui varient de l'activité de donneur et sont facilement activé par leur isolement. Afin d'assurer la reproductibilité et la précision lectures fonctionnelles, préparation des cellules et temps de transfert doit être minimisée. La sélection minutieuse des contrôles est nécessaire pour interpréter les résultats de façon significative. Selon l'expérience, il pourrait s'agir des cellules non traitées ou à l'électricité statique de culture, de TNF-α de traitement, non activées cellules THP-1, l'utilisation d'anticorps bloquants, les siARN ou les inhibiteurs pharmacologiques, et d'autres.
Comme témoigne de la polyvalence de l'approche, nous avons appliqué ces dispositifs pour enquêter sur les cytokines, 2 lipides-3, 4 et 5 RAGE induite par l'inflammation dans OAB. Nos études ont porté sur la mesure du potentiel inflammatoire de particules lipidiques du sérum obtenu à partir de s de l'hommeQuestions à sur les cellules endothéliales 3, 4 et les monocytes. Dans 17 une stratégie alternative, les monocytes peuvent être présentés avec des substrats dérivés avec des molécules immobilisées telles que VCAM-1 pour examiner les mécanismes d'adhérence. En utilisant cette approche, nous l'avons déjà démontré un rôle fonctionnel pour la molécule d'adhésion CD11c, qui coopère avec l'antigène très tard (VLA) -4 dans l'adhésion des monocytes à VCAM-1 au cours dyslipidémie chez les humains et les souris 17 18. Depuis monocytes peut être facilement activé par leur isolement, nous avons également développé un test de sang total pour une utilisation avec notre laboratoire-puce de dispositif pour permettre une détection plus sensible et reproductible 17.
En fin de compte, en plus de fournir un aperçu des événements précoces inflammatoires qui sous-tendent l'athérosclérose, nous prévoyons que ce développement de la technologie conduira à des approches ex vivo fidèles pour évaluer le risque d'un individu de l'inflammation médiée par les maladies cardiovasculaires, ouvrant ainsi la way pour l'élaboration de diagnostics personnalisés qui rendent compte de l'activation des monocytes et CE.
| Cône-et-Plate dispositif de cisaillement portable | ||
| Rayon Cône | 0,06985 | m |
| Cône d'angle | 0,00877 (0,5 °) | rad (degrés) |
| Hauteur Gap | 20 ± 10 | um |
| Max Angular Velocity (pour les expériences décrites ici) | 18,85 | rad / s |
| Viscosité cinématique | 0,00077 | m 2 / s |
| Max nombre R (pour les expériences décrites ici) | 0.000758 | dimension |
| Spécifications VMMC | ||
| Longueur Manche | 8.0 | mm |
| Hauteur Manche | 60 | um |
| Largeur du canal | 2 | mm |
| Nombre de Reynolds | 1,67 | dimension |
Tableau 1. Spécifications de la CDD et VMMC.
Figure 4. Vue en coupe du cône et plaque dispositif de cisaillement cellule (CDD). La CDD se compose d'un cône cylindrique en acier inoxydable qui tourne dessus d'un substrat de culture cellulaire fixe. L'angle de cône et hauteur d'écartement sont des paramètres critiques qui définissent la nature du champ de cisaillement produite en présence d'un milieu de culture. Un certain nombre de Reynolds modifiée montrant la relation entre les forces visqueuses centrifuge est donnée par:
<br />
où r est le rayon de cône, ω est la vitesse angulaire, α est l'angle de cône, et ν est la vitesse cinématique du fluide. Lorsque R est << 1 forces centrifuges sont faibles, le débit est laminaire et purement azimutal, et la contrainte de cisaillement induite est constante sur la monocouche 19. Dans notre CDD, le substrat avec des cellules en culture est chargé par le bas dans la chambre qui abrite le cône. Moyen est ajouté à la chambre et utilisé comme fluide de cisaillage. Le cône est monté avec des paliers de précision pré-chargés et la rotation entraînée par un moteur pas à pas de micro-. Un système de nivellement de précision maintient alignement perpendiculaire au substrat cellulaire. La hauteur d'écartement (définie par la distance entre le sommet du cône sur le substrat cellulaire) est fixé avec une jauge de profondeur de haute précision. Une graisse attraper et les médias joint sont en place pour veiller à ce que le boîtier de la chambre des cellules est maintenu propre et exempt d'huile et les débris.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI subvention R01 HL082689 à Scott I. Simon et Anthony G. Passerini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
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