Summary
Microfluidic प्रवाह photolithography द्वारा etched और PDMS से निर्मित कक्षों कार्यात्मक चुनाव आयोग शिथिलता और सूजन के साथ जुड़े परिणामों की जांच करने के लिए लागू कर रहे हैं. एक प्रतिनिधि प्रयोग में, अंतर कतरनी तनाव की क्षमता cytokine सक्रिय ईसी monolayers monocytic कोशिका आसंजन मिलाना प्रदर्शन किया है.
Abstract
मेदार्बुदजनन चयापचय असामान्यताएं कि प्रणालीगत सूजन का बढ़ राज्य endothelial रोग में जिसके परिणामस्वरूप योगदान द्वारा potentiated है. हालांकि, endothelium में जल्दी कार्यात्मक परिवर्तन है कि एक व्यक्ति के जोखिम के स्तर को दर्शाता है सीधे चिकित्सकीय मूल्यांकन नहीं कर रहे हैं के लिए गाइड रणनीति चिकित्सकीय मदद. इसके अलावा, स्थानीय hemodynamics द्वारा सूजन के विनियमन गैर यादृच्छिक atherosclerosis के स्थानिक वितरण के लिए योगदान देता है, लेकिन तंत्र vivo में चित्रित करना मुश्किल हैं. हम एक प्रयोगशाला-on-a-चिप मानव endothelial कोशिकाओं (ईसी) और सटीक प्रवाह शर्तों के तहत monocytes में सूजन की घटनाओं की मात्रात्मक परख चयापचय गड़बड़ी आधारित दृष्टिकोण का वर्णन. नरम लिथोग्राफी का मानक तरीकों संवहनी अनुकरण करनेवाला microfluidic (VMMC) कक्षों, जो सीधे सुसंस्कृत ईसी monolayers के लिए बाध्य कर रहे हैं microfabricate करने के लिए उपयोग किया जाता है 1 इन उपकरणों अभिकर्मकों की छोटी मात्रा जबकि का उपयोग करने का फायदा हैसीधे इमेजिंग एक अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र कतरनी उजागर चुनाव आयोग की झिल्ली में सूजन की घटनाओं के लिए एक मंच प्रदान करते हैं. हम सफलतापूर्वक इन उपकरणों लागू है cytokine, 2 लिपिड 3 4, और क्रोध प्रेरित मानव महाधमनी चुनाव आयोग (HAEC) में 5 सूजन की जांच की. यहाँ हम परख monocytic (THP-1) सेल रोलिंग और कि अंतर कतरनी विशेषताओं के तहत वातानुकूलित हैं और भड़काऊ cytokine TNF-α द्वारा सक्रिय HAEC monolayers पर गिरफ्तारी VMMC उपयोग दस्तावेज़. इस तरह के रूप में इन अध्ययन atherosusceptibility में चयापचय जोखिम वाले कारकों के तहत यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहे हैं.
Protocol
1. सेल संस्कृति और सब्सट्रेट तैयारी
- एक 100 x 20 मिमी टिशू कल्चर (बी फाल्कन) पकवान एक खराद का उपयोग कर से 3 इंच परिपत्र substrates कट. 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा substrates जीवाणुरहित. एक पेट्री डिश और कोट में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 4 मिलीलीटर कोलेजन प्रकार मैं (100 ग्राम / एमएल) के साथ रखें, तो 4 मिलीलीटर 1 x पीबीएस के साथ कुल्ला.
- 6.5x10 5 कोशिकाओं / एमएल और बीज पर 1 मिलीग्राम लागू सब्सट्रेट करने के लिए सीधे मानव महाधमनी endothelial कोशिकाओं (HAEC, 4-6 मार्ग) निलंबित. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए सब्सट्रेट का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
- Endothelial वृद्धि मध्यम-2 (ईजीएम-2) 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी कोशिकाओं के लिए समाधान के साथ पूरक की 9 मिलीलीटर जोड़ें. मीडिया बदलें हर 2 दिन जब तक कोशिकाओं की 90% confluency तक पहुँचने.
- RPMI 1640 10% FBS और 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी समाधान के साथ पूरक मध्यम THP में 1-कोशिकाओं को बनाए रखने. जब वे 1 के एक घनत्व तक पहुँचने के पारित होने कोशिकाओं0 6 कोशिकाओं / एमएल.
2. सेल कर्तन प्रोटोकॉल
सेल एक कस्टम सेल शंकु और प्लेट कर्तन डिवाइस (सीएसडी) में वातानुकूलित हैं. डिवाइस विवरण और डिजाइन विनिर्देशों तालिका 1 और 4 चित्र में दस्तावेज हैं.
- सीएसडी तैयार करो. इथेनॉल के साथ कक्ष आवास जीवाणुरहित और बाँझ पीबीएस के साथ कुल्ला. 37 करने के लिए आवास गर्मी डिग्री सेल्सियस और स्तर को सुनिश्चित करने के लिए कि कोन सेल monolayer सीधा करने के लिए है. आवास के नीचे से कोशिकाओं के साथ सब्सट्रेट इकट्ठा और वांछित ऊंचाई शंकु सेट.
- (एल -15) कर्तन सीओ 2 के अभाव में उचित पीएच बनाए रखने के माध्यम के रूप में Endothelial BulletKit साथ पूरक मध्यम लेबोविट्ज़-15 का प्रयोग करें. सूजन को प्रोत्साहित करने के लिए, कर्तन मध्यम ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α, 0.5 एनजी / मिली) जोड़ने और डिवाइस में एक इनलेट पोर्ट से जुड़ा सिरिंज के माध्यम से 6 मिलीलीटर इंजेक्षन, देखभाल करने के लिए हवा नहीं परिचयकक्ष में बुलबुले.
- एक उच्च परिमाण स्थिर कतरनी तनाव पर कतरें कोशिकाओं (HSS, डाएन / 15 2 सेमी) या 4 घंटे के लिए एक oscillatory कतरनी तनाव (ओ.एस.एस., 0 ± 5 डाएन / 2 सेमी, 1 हर्ट्ज). वांछित एसएस कोशिकाओं है, जो ठीक एक मोटर सूक्ष्म कदम के रूप में पहले से वर्णित के साथ नियंत्रित किया जाता है ऊपर शंकु घूर्णन द्वारा हासिल की है 6 दीवार की सतह पर एसएस (w τ) द्वारा approximated.
जहां μ माध्यम का चिपचिपापन है, ω शंकु के कोणीय वेग है, और α कोन कोण (0.5 °) है. सब्सट्रेट के साथ शंकु संरेखण परिशुद्धता leveling के माध्यम से 0.05 डिग्री और अंतराल 20 में निर्धारित ऊंचाई ± 10 सुक्ष्ममापी τ w में परिधीय और रेडियल भिन्नता को कम करने के लिए एक गहराई नापने का यंत्र का उपयोग कर के भीतर निकाला जाता है. डिवाइस के लिए लामिना का प्रवाह विशेषताओं को सुनिश्चित करने के लिए मान्य किया गया है. ग निकालेंडिवाइस से Ells और monocyte आसंजन के विश्लेषण के लिए तैयार करते हैं.
3. PDMS Microfluidic चैंबर का निर्माण
- इच्छित microfluidic चैनल संख्या और चैनल ऊंचाई के आधार पर आवेदन करने के लिए मास्टर ढालना प्राप्त. विशिष्ट डिजाइन इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की विशेषताओं तालिका 1 में विस्तृत कर रहे हैं इन बनाने के लिए पद्धति पहले से ही अच्छी तरह से साहित्य में प्रलेखित है. 1 संक्षेप में, चैनलों के नेटवर्क सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया गया है (Autodesk आविष्कारक) और 5000 डीपीआई पर मुद्रित एक पारदर्शिता पर. नकारात्मक photoresist (SU8) एक सिलिकॉन वफ़र पर 100 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई घूमती है. पारदर्शिता मढ़ा और पराबैंगनी प्रकाश में अवगत कराया. गैर - polymerized photoresist सकारात्मक प्रतिकृति मास्टर उत्पन्न करने के लिए हटा दिया है.
- वजन से सिलिकॉन एक नाव वजन में 10:01 एजेंट का इलाज करने के साथ PDMS समाधान मिश्रण सिलिकॉन आधार बनाने के लिए और एक 5 मिलीग्राम सीरम वैज्ञानिक pipet साथ हलचल. सावधान करने के लिए दीवारों नहीं परिमार्जनकी नाव तौलना के लिए समाधान प्लास्टिक गुच्छे जोड़ने से बचने के.
- एक 100x15mm पेट्री डिश में मास्टर वफ़र प्लेस और डिश में PDMS समाधान डालना.
- पकवान कवर और एक वैक्यूम कंटेनर में बुलबुले को दूर करने में 15 मिनट के लिए जगह है. 15 मिनट के बाद पेट्री डिश बाहर ले और धीरे सतह पर हवा में उड़ा द्वारा किसी भी अतिरिक्त बुलबुले निकालें.
- 1 घंटे के लिए एक ओवन में 70 पेट्री डिश प्लेस ° सी. पकवान हटाने और बाहर microfluidic एक तेज ब्लेड का उपयोग कर कक्षों में कटौती.
4. डिवाइस के माइक्रोस्कोप पर विधानसभा
- प्रकाश स्रोत पर औंधा माइक्रोस्कोप और 37 हीटर ° सी. सेट एक 10 मिलीलीटर सिरिंज टयूबिंग संलग्न है और ऐसी है कि वहाँ कोई बुलबुले हैं आसुत पानी के साथ भरें. सिरिंज पंप सेट और प्रवाह की दर में सिरिंज 1 डाएन / 2 सेमी की एक दीवार एसएस प्रेरित रखें. दीवार कतरनी (w τ) चैनल के centerline के साथ उत्पन्न तनाव के मानक का उपयोग approximated हैएक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष के लिए समीकरण:
जहां μ मध्यम, क्यू बड़ा प्रवाह की दर का चिपचिपापन है, ज चैनल ऊंचाई है, और w चैनल चौड़ाई नोट: के बाद से चैनल परिमित चौड़ाई के वास्तविक τ w w चैनल पर निर्भर करता है के साथ अलग अलग होंगे पहलू अनुपात, और माप के 25% से कम की ओर दीवारों निकटतम से परहेज कर रहे हैं 1,7. - पानी में PDMS कक्ष प्लेस और एक 100μl micropipette का उपयोग करने के लिए अलग - अलग चैनलों से हवा निकालने. वैक्यूम अनुकूलक संलग्न कक्ष बनाने के लिए यह सुनिश्चित करें कि वाल्व बंद करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
- पेट्री डिश उद्देश्य से अधिक HAEC monolayer के साथ रखें. पेट्री डिश पर PDMS कक्ष रखें और ध्यान यह HAEC monolayer पर सेट करते समय आश्वस्त है कि कोई हवाई बुलबुले डिवाइस और monolayer के बीच फार्म. वाल्व मुड़ें इतना है कि वैक्यूम पर है और चैम्बर मजबूती से जुड़ा हुआ है. कट 19 गेज सुई कुंद ऐसी है कि वहाँ धातु छोड़ के केवल 5 मिमी है. बफर के साथ प्लास्टिक जलाशय भरें और PDMS कक्ष प्रवेश द्वार में डाल दिया. चैनलों के लिए इस्तेमाल किया जा उपयुक्त संख्या के लिए दोहराएँ. सिरिंज पंप से PDMS चैनल रास्ते टयूबिंग संलग्न.
5. कतरनी तनाव के तहत Monocyte आसंजन परख
- 2x10 6 कोशिकाओं / HbSS + 2 + मिलीग्राम / 2 + 0.1% + HSA Ca मिलीग्राम पर THP 1-कोशिकाओं निलंबित. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए stromal व्युत्पन्न कारक 1 (एसडीएफ-1, 50 ग्राम / एमएल) के साथ incubating द्वारा सक्रिय करें THP 1 कोशिकाओं.
- सिरिंज पंप पर चालू करने के लिए प्रवाह की स्थापना के लिए, तो जलाशय हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना सेल निलंबन के 50 μl जोड़ने. एक बार प्रवाह पूरी तरह से विकसित की है, डाटा अधिग्रहण शुरू करते हैं.
- उचित प्रवाह दर पर 5 मिनट के लिए भागो, जलाशय के लिए बफर जोड़ने अगर समाधान कम हो जाता है. प्रवाह धारा में किसी भी अबाध कोशिकाओं के धो लो चैनलों में बफर बह जारी.
6. डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण
- 3 / फ्रेम में 2 मिनट के लिए चैनल में 3 स्थानों पर चैनल के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ पूरी तरह से विकसित प्रवाह के बाद, देखभाल करने के लिए पक्ष निकटतम रिकॉर्ड नहीं प्रवेश द्वार के तुरंत बाद या बाहर निकलें बंदरगाहों से पहले या 25% में डिजिटल छवि दृश्यों मोल दीवारों.
- Monolayer के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में उनकी उपस्थिति चरण उज्ज्वल की पहचान द्वारा प्रति फ़ील्ड गिरफ्तार कोशिकाओं की संख्या की गणना.
- फर्म सेल गिरफ्तारी आंदोलन से परिभाषित किया गया है <साढ़े 10 एस में सेल व्यास. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 यादृच्छिक क्षेत्रों / चैनल और अधिक औसत डेटा यों.
7. प्रतिनिधि परिणाम
हालांकि संवहनी endothelium agonists है कि प्रणालीगत सूजन के लिए योगदान के लिए समान रूप से अवगत कराया है, atherosclerosis एक फोकल रोग है कि प्रवाह अशांति की धमनियों में साइटों पर preferentially विकसित, endothelial समारोह में स्थानिक विजातिता implicating 8. 9, TNF-α 10 चुनाव आयोग में एक अच्छी तरह से विशेषता प्रतिक्रिया है कि सेल आसंजन अणुओं की विनियमन (CAMs लाती है. Vcam-1 जैसे, ICAM-1, ई selectin) और chemokines कि परिसंचरण, जल्दी atherosclerotic घाव की एक बानगी से भर्ती monocytes 11 hemodynamics endothelial भड़काऊ phenotype के एक महत्वपूर्ण नियामक 12 उच्च परिमाण कतरनी तनाव (HSS. उदा Dynes 15/2 सेमी) या स्पंदनकारी कतरनी तनाव (PSS, जैसे 15 ± 5 Dynes / 2 सेमी) atherosclerosis करने के लिए प्रतिरोध की साइटों धमनियों में TNF-α प्रेरित प्रतिक्रियाओं नीचे विनियमित के साथ जुड़ा हुआ है. इसके विपरीत, कम परिमाण कतरनी तनाव (LSS, जैसे 2 Dynes / 2 सेमी) या oscillatory कतरनी (ओ.एस.एस., 0 उदा ± Dynes 5/2 सेमी), vivo में अतिसंवेदनशील स्थलों में से एक विशेषता, cytoki ख़राब करनापूर्वोत्तर प्रेरित सूजन 13, 14 हमारा microfluidic PDMS उपकरणों यंत्रवत अध्ययनों का आयोजन करने के लिए endothelial समारोह और विकृति के नियमन में hydrodynamic कारकों के साथ चयापचय तनाव के superposition से संबंधित hypotheses परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं. उपयोगिता और दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा को मोटे तौर पर निम्न प्रतिनिधि परिणामों के माध्यम से सचित्र है.
चित्रा 1. कतरनी तनाव differentially TNF-α सूजन endothelial monolayers THP 1 कोशिका आसंजन modulates इन आंकड़ों विस्तृत वर्णित ऊपर और वीडियो में प्रलेखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया. एक साथ HAEC monolayers भड़काऊ cytokine TNF-α (0.5 एनजी / एमएल, ~ Vcam-1 अप - नियमन के लिए 50 ईसी) और या तो (15 Dynes / 2 सेमी) HSS या ओ.एस.एस. (0 ± 5 Dynes के एक कम खुराक से अवगत कराया गया / 2 सेमी, हर्ट्ज 1) descri के रूप में 4 घंटे के लिए एक कस्टम सीएसडी मेंविस्तृत प्रोटोकॉल में बिस्तर. THP-1 सेल गिरफ्तारी एक PDMS प्रवाह चैम्बर में कतरनी प्रवाह के तहत मात्रा निर्धारित किया गया था. यह सेल लाइन है कि मानव monocytes की phenotype mimics अपनी reproducibility और उपयोग में आसानी के लिए चुना गया था. HSS भड़काऊ प्रतिक्रिया तनु ओ.एस.एस. की तुलना में, की कमी हुई THP 1 सेल गिरफ्तारी में जिसके परिणामस्वरूप. डेटा छात्र टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया और ± 3 स्वतंत्र प्रयोगों के SEM मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं DeVerse एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित. 5
निम्न डेटा हमारे प्रकाशित काम से उदाहरण का उपयोग हमारे दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन. ऊपर प्रोटोकॉल से प्रस्थान जहां लागू संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 2. Cytokine प्रेरित Vcam 1 अभिव्यक्ति और एक कतरनी तनाव ढाल में monocyte भर्ती के मॉडुलन. ए) HAEC monolayers TNF α (0.3 एनजी / एमएल) के साथ 4 घंटे के लिए फ़्लो के तहत प्रेरित थेएक VMMC Hele शॉ प्रवाह के सिद्धांत के आधार पर डिजाइन में w 15 चैनल के centerline के साथ एस एस परिमाण में रैखिक कमी चैम्बर के sidewalls डिजाइन करने के लिए एक दो आयामी ठहराव प्रवाह streamlines मेल और अंत को आकार देने के द्वारा प्राप्त किया गया था चैनल के आईएसओ संभावित लाइनों को मैच के लिए. दीवार कतरनी (w τ) (x) के प्रवेश द्वार से एक axial दूरी पर इस चैनल के centerline के साथ उत्पन्न तनाव के द्वारा दिया जाता है:
1 w, जहां μ मध्यम, क्यू बड़ा प्रवाह की दर का चिपचिपापन है, ज चैनल ऊंचाई चैनल प्रवेश द्वार चौड़ाई है, और एल कुल चैनल लंबाई है क्यू 16 से एस एस परिमाण में एक ढाल उत्पन्न करने के लिए चुना गया था. Dynes / प्रवेश पर 2 सेमी ठहराव बिंदु पर 0 से "एक" सिर्फ outle के लिए समीपस्थटी) सी बी) Vcam-1 अभिव्यक्ति में सीटू immunofluorescence क्वांटम डॉट्स संयुग्मित और प्रतिशत unstimulated स्थैतिक नियंत्रण की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के रूप में प्रस्तुत किया एंटीबॉडी का उपयोग माइक्रोस्कोपी से मापा गया था. एसएस Vcam-1 के बेसल स्तर है, जो unstimulated HAEC ग्रे (त्रिकोण) में कम है नहीं मिलाना था. हालांकि, Vcam-1 अभिव्यक्ति TNF-α सापेक्ष LSS magnitudes में वृद्धि हुई ~ 2 Dynes / 2 सेमी में peaking और आधारभूत TNF-α लौटने या कतरनी> 5 Dynes / 2 सेमी (काले चौकों). Magnitudes नीचे) monocytes (10 6 मिलीग्राम /) 2 Dynes / 2 सेमी में समानांतर प्रवाह चैनलों में 5 मिनट के लिए ए) में preconditioned monolayers पर perfused थे. Endothelium Monocyte भर्ती मात्रात्मक एक दिया कतरनी तनाव परिमाण में Vcam एक अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध. विशेष रूप से, ठीक स्थानिक संकल्प के साथ एक monolaye Vcam-1 अभिव्यक्ति और एककेंद्रकश्वेतकोशिका भर्ती की जांच करने की क्षमताआर एस एस परिमाण में एक संकीर्ण सीमा है कि अलग - अलग प्रयोगों में कतरनी के कुछ ही असतत मूल्यों को लागू करने के द्वारा नहीं की सराहना की होगी पर महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता चला. डेटा दोहराया उपायों एनोवा और न्यूमैन Keuls posttest द्वारा मूल्यांकन मतभेद से विश्लेषण किया गया, स्थिर शर्तों के तहत * TNF-α से पी <0.05. डेटा ± मतलब 3-6 स्वतंत्र प्रयोगों से SEM Tsou एट अल 2. से अनुमति के साथ अनुकूलित.
चित्रा 3. ट्राइग्लिसराइड अमीर लिपो प्रोटीन (TGRL) दाता सीरम ट्राइग्लिसराइड स्तर और अभिव्यक्ति Vcam-1 के अनुपात में cytokine प्रेरित सूजन मिलाना HAEC monolayers TNF α (0.3 एनजी / एमएल) के साथ TGRL (10 मिग्रा / डीएल के साथ 4 घंटे के लिए एक साथ प्रेरित थे. ApoB) स्थैतिक संस्कृति में एक उच्च वसा वाले भोजन के बाद मानव विषयों से अलग है.) Vcam 1 अभिव्यक्ति अलग निलंबित चुनाव आयोग में प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया थाऔर एककेंद्रकश्वेतकोशिका आसंजन VMMC का उपयोग कर के रूप में विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित मात्रा. डेटा TNF-α से% परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. Monocyte गिरफ्तारी endothelial Vcam एक अभिव्यक्ति है, जो सीधे दाता सीरम ट्राइग्लिसराइड के स्तर के साथ वृद्धि हुई है बी) समर्थक भड़काऊ दाताओं की एक सबसेट के लिए Monocyte गिरफ्तारी एक Vcam-1 अवरुद्ध एंटीबॉडी की उपस्थिति में निराकृत किया गया था. सीधे अनुपात में विविध. ± SEM 3-5 स्वतंत्र प्रयोगों से, महत्व बनती टी परीक्षण छात्र द्वारा निर्धारित किया गया था मतलब है वैंग एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित. 4
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Discussion
हम पर चिप endothelial भड़काऊ phenotype के मूल्यांकन के लिए सीएएम अभिव्यक्ति और एककेंद्रकश्वेतकोशिका आसंजन के वास्तविक समय इमेजिंग के माध्यम से microfluidic PDMS उपकरणों के उपयोग का वर्णन करता है. हमारे दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ आहार lipids और परिभाषित hydrodynamic शर्तों के तहत साइटोकिन्स कि मेदार्बुदजनक वाहिकाओं में कतरनी तनाव दर्पण के रूप में इस तरह के भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में कोशिकाओं में endothelial रोग के साथ जुड़े परिणामों यों की क्षमता में निहित है. VMMC अभिकर्मकों या सामग्री है कि सीमित आपूर्ति में हो सकता है की छोटी मात्रा के उपयोग की सुविधा और सस्ती, अनुकूलन और उच्च throughput उत्तरदायी होने का जोड़ा लाभ है.
microfluidic उपकरणों का उपयोग macroscale दृष्टिकोण है कि दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है सुसंस्कृत चुनाव आयोग की कतरनी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. ये प्लेट समानांतर प्रवाह कक्षों, बेलनाकार ट्यूब, और शंकु और प्लेट viscometers, जिनमें से प्रत्येक ca है शामिलस्थिर, लामिना Poiseuille प्रवाह की स्थिति (16 में की समीक्षा) लगाने की पाब्ले. इन उपकरणों के लिए संशोधन दीवार कतरनी तनाव में अस्थायी या स्थानिक बदलाव उत्पादन या भी धमनीय waveforms पुनरावृत्ति करना 6 हालांकि, सामान्य रूप में इन उपकरणों को मीडिया की एक बड़ी राशि की आवश्यकता होती है, के लिए निर्माण, कम अनुकूलनीय महंगे हैं, और comparably कम throughput से ग्रस्त हैं.
सीमाओं भी VMMCs के उपयोग के साथ मौजूद हैं. इन उपकरणों के समानांतर प्लेट प्रवाह सिद्धांत है, जो अनंत चौड़ाई मानता है के आधार पर डिजाइन किए हैं. यह macroscale उपकरणों जहां चौड़ाई ज्यादा ऊंचाई की तुलना में अधिक है के लिए एक उचित धारणा है. हालांकि, microfluidic चैनलों के परिमित चौड़ाई आवश्यक है कि पढ़ाई ओर दीवार के प्रभाव को समाप्त करने के लिए चैनल के अनुदैर्ध्य अक्ष के केंद्र के साथ आयोजित किया जाना चाहिए, क्योंकि वास्तविक τ w w चैनल पहलू अनुपात पर निर्भर करता है के साथ अलग अलग होंगे इसी तरह 7 1. माप करीब टी नहीं ले रहे हैंओ और चैनलों के प्रवेश और निकास के लिए प्रवेश द्वार के प्रभाव से बचने के लिए. हम किसी भी महत्वपूर्ण संकेत paracrine प्रभाव या सूजन की चोट या monolayer हमारे मनाया प्रतिक्रियाओं के लिए योगदान के रूप में डिवाइस सील की वजह से चुनाव आयोग को क्षति प्रेरित इनकार किया है. PDMS अणुओं hydrophobic के लिए एक उच्च आत्मीयता, जो secreted chemokines और leukocytes और VMMC के बीच गैर विशिष्ट बातचीत के अवशोषण के लिए नेतृत्व कर सकता है. हालांकि, हम यह एक समस्या हमारे अध्ययन की अवधि के लिए करने के लिए नहीं मिला है. 2
संवर्धित कोशिकाओं के साथ प्रवाह उपकरणों का उपयोग एक न्यूनकारी दृष्टिकोण है कि सम्मान के साथ कतरनी तनाव यंत्रवत अध्ययनों और कारण और प्रभाव के प्रदर्शन की सुविधा का गठन किया. हालांकि, इन विट्रो दृष्टिकोण में किसी की एक सीमा धारणा है कि यह पर्याप्त रूप से देशी धमनियों में वातावरण की जटिलता पुनरावृत्ति करना है vivo में, endothelial कोशिकाओं चिरकाल जटिल प्रवाह पैटर्न के लिए अनुकूलित कर रहे हैं और.अन्य कोशिकाओं, मैट्रिक्स, और humoral मध्यस्थों कि उनके व्यवहार को विनियमित के साथ बातचीत के अधीन हैं.
यह उल्लेखनीय है कि ऊपर प्रस्तुत परिणामों के सभी अल्पकालिक मॉडल में कर रहे हैं और इस तरह के रूप में समय अपरिवर्तनीय नहीं हो सकता. हालांकि, वे प्रयोगों जो हम आमतौर पर एक तीव्र सूजन चुनौती के तहत तंत्र जांच करने के प्रतिनिधि हैं. हमारे अध्ययन के लिए प्रासंगिक रणनीति कम खुराक TNF-α उत्तेजना, जिसके लिए 4 घंटा Vcam एक अभिव्यक्ति में अनुमानित शिखर का प्रतिनिधित्व करता है के एक सूजन आधारभूत से परिवर्तन की निगरानी है. हम कई अध्ययनों में प्रलेखित है कि Vcam-1 की सतह अभिव्यक्ति में परिवर्तन इन शर्तों के तहत बढ़ाया एककेंद्रकश्वेतकोशिका भर्ती के साथ सहसंबंधी 2-4, 17.
इसके अलावा, एस एस तरंग का चुनाव अंतर endothelial प्रतिक्रियाओं का आह्वान कर सकते हैं. हमारे प्रतिनिधि के प्रोटोकॉल में हम VMMC का उपयोग दस्तावेज़ monocyte आसंजन घटनाओं HAEC में एस के तहत वातानुकूलित योंरिश्तेदार (HSS) प्रतिरोध और एक स्वनिर्धारित सेल कर्तन डिवाइस में धमनियों में मेदार्बुदजनन करने के लिए संवेदनशीलता (ओएसएस) की साइटों के प्रतिनिधि होने के लिए चुना तनाव सुन. लगातार सुसंस्कृत चुनाव आयोग में पिछले निष्कर्ष, HSS तनु ओ.एस.एस. के सापेक्ष cytokine सक्रियण जवाब के साथ 12, 13 परिणाम एक बड़ा vivo में प्रवाह अशांति की साइटों पर चुनाव आयोग की सूजन सक्रियण रिआयत के साथ संगत कर रहे हैं. जबकि इन शर्तों सामान्यतः undisturbed और परेशान प्रवाह क्रमशः का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वे पूरी तरह से धमनियों में प्रवाह की जटिलता नहीं पुनरावृत्ति करना. हालांकि, साहित्य का एक धन सरल approximations है कि पर्याप्त रूप से आगे निकला हुआ हिस्सा प्रवाह सुविधाओं प्रतिलिपि के रूप में उनके उपयोग का समर्थन करता है 14.
विशेष रूप से, हमारे शंकु और प्लेट आधारित सीएसडी लंबी अवधि के रूप में पहले से सूचना दी के लिए और अधिक जटिल waveforms और कंडीशनिंग कोशिकाओं को पैदा करने के लिए सक्षम है 6 इस प्रकार, सीएसडी के साथ वर्णित जनसंपर्क में VMMC बाँधनाotocol लचीलेपन की एक अधिकतम डिग्री प्रदान करता है. सीएसडी में कतरनी कंडीशनिंग की दिशा के लिए सम्मान के साथ VMMC के अभिविन्यास में इस दृष्टिकोण का एक विचार है, जो में परिधीय दिशा में HAEC अनुभव प्रवाह. अभ्यास में, VMMC उन्मुख है इतना है कि चैनलों के प्रवाह क्षेत्र और इनलेट वातानुकूलित कोशिकाओं के ऊपर तो संभव के रूप में अब तक के साथ समानांतर हैं. चैनल काफी छोटा है कि यह एक उचित सन्निकटन का प्रतिनिधित्व करता हैं. हालांकि, हम भी पिछले एक अध्ययन में प्रदर्शन किया है कि बह समानांतर या सीधा VMMC में कतरनी कंडीशनिंग के दिशा monocytes चित्रा 2 में दिखाया परिणामों को प्रभावित नहीं किया 2.
अतिरिक्त इन विट्रो तकनीक में साथ जुड़े विचार प्ररूपी धारावाहिक चुनाव आयोग के संस्कृति और विजातिता में पृथक चुनाव आयोग या monocytes में passaging के साथ जुड़े बहाव द्वारा प्रेरित परिवर्तनशीलता शामिल हैं. HAEC आम तौर पर 6 मार्ग और प्रत्येक स्थल के द्वारा किया जाना चाहिएTNF-α एक सुसंगत भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए होती है. THP-1 के रूप में एक सेल लाइन का उपयोग monocytes, जो दाता द्वारा गतिविधि में भिन्न होते हैं और आसानी से अपने अलगाव द्वारा सक्रिय के उपयोग के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक कार्यात्मक readouts, सेल तैयार करने और हस्तांतरण के समय को कम से कम किया जाना चाहिए. नियंत्रण का चयन सावधानी से सार्थक परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक है. प्रयोग के आधार पर, इन अनुपचारित या स्थिर सुसंस्कृत कोशिकाओं, TNF-α उपचार, unactivated THP 1 कोशिकाओं, अवरुद्ध एंटीबॉडी, siRNAs या औषधीय inhibitors का उपयोग करते हैं, और दूसरों को शामिल हो सकता है.
दृष्टिकोण के बहुमुखी प्रतिभा के वसीयतनामा के रूप में, हम इन उपकरणों में HAEC cytokine, 2 लिपिड 3 4, और 5 गुस्से प्रेरित सूजन की जांच का आवेदन किया है. हमारे अध्ययन से मानव है सीरम व्युत्पन्न लिपिड कणों के भड़काऊ क्षमता को मापने शामिल हैendothelial कोशिकाओं तीन, चार और monocytes पर एक वैकल्पिक रणनीति में 17 ubjects., monocytes Vcam -1 के रूप में स्थिर अणु आसंजन तंत्र की जांच करने के साथ derivatized substrates के साथ प्रस्तुत किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले आसंजन अणु CD11c, जो 17 मनुष्यों और चूहों में dyslipidemia के दौरान बहुत देर (VLA) प्रतिजन Vcam-1 monocyte आसंजन में -4 के साथ सहयोग के लिए एक कार्यात्मक भूमिका का प्रदर्शन 18 से monocytes आसानी से सक्रिय किया जा सकता उनके अलगाव, हम भी हमारे उपकरण प्रयोगशाला चिप के साथ प्रयोग के लिए एक पूरे रक्त परख विकसित करने के लिए और अधिक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए 17.
अंत में, जल्दी भड़काऊ atherosclerosis अंतर्निहित घटनाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, हम कल्पना है कि इस प्रौद्योगिकी के विकास सूजन की मध्यस्थता हृदय रोग के एक व्यक्ति के जोखिम का आकलन करने के लिए वफादार पूर्व vivo दृष्टिकोण के लिए नेतृत्व करेंगे, w फ़र्शकि monocyte और चुनाव आयोग सक्रियण पर रिपोर्ट व्यक्तिगत निदान के विकास के लिए प्र.
| शंकु और प्लेट सेल कर्तन डिवाइस | ||
| शंकु त्रिज्या | ०.०६,९८५ | मीटर |
| कोन कोण | ०.००८७७ (0.5 °) | रेड (डिग्री) |
| गैप लंबाई | 20 ± 10 | सुक्ष्ममापी |
| अधिकतम कोणीय वेग (प्रयोगों के लिए यहाँ उल्लिखित) | 18.85 | / रेड |
| कीनेमेटीक्स चिपचिपापन | 0.००,०७७ | 2 m / s |
| अधिकतम आर संख्या (प्रयोगों के लिए यहाँ उल्लिखित) | 0.000758 | आयामरहित |
| VMMC निर्दिष्टीकरण | ||
| चैनल लंबाई | 8.0 | मिमी |
| चैनल लंबाई | 60 | सुक्ष्ममापी |
| चैनल चौड़ाई | 2 | मिमी |
| रेनॉल्ड्स संख्या | 1.67 | आयामरहित |
तालिका 1 सीएसडी और VMMC निर्दिष्टीकरण.
चित्रा 4. शंकु और प्लेट सेल कर्तन डिवाइस (सीएसडी) की क्रॉस अनुभागीय दृश्य सीएसडी. एक स्टेनलेस स्टील बेलनाकार शंकु कि एक स्थिर सेल संस्कृति सब्सट्रेट ऊपर rotates के होते हैं. कोन कोण और अंतर ऊंचाई महत्वपूर्ण मापदंडों कि कतरनी मध्यम संस्कृति की उपस्थिति में उत्पादन क्षेत्र की प्रकृति को परिभाषित कर रहे हैं. एक संशोधित रेनॉल्ड्स केन्द्रापसारक का चिपचिपा बलों के लिए संबंधों को दिखा संख्या के द्वारा दिया जाता है:
<br />
जहां r शंकु त्रिज्या है, ω कोणीय वेग है, α कोन कोण है, और ν तरल पदार्थ की कीनेमेटीक्स वेग है. जब आर << 1 केंद्रत्यागी बलों को कम कर रहे हैं, प्रवाह लामिना है और विशुद्ध रूप से azimuthal, और प्रेरित कतरनी तनाव monolayer पर स्थिर है 19 हमारे सीएसडी., संवर्धित कोशिकाओं सब्सट्रेट के साथ नीचे से कक्ष है कि घरों में भरी हुई है शंकु. मध्यम चैम्बर के लिए जोड़ा जाता है और कर्तन तरल पदार्थ के रूप में इस्तेमाल किया. शंकु पूर्व लोड सटीक बीयरिंगों और एक माइक्रो कदम मोटर के द्वारा संचालित रोटेशन के साथ मुहिम शुरू की है. एक सटीक leveling प्रणाली सेल सब्सट्रेट संरेखण सीधा रखता है. अंतराल के ऊंचाई (सेल सब्सट्रेट शंकु के शीर्ष से दूरी के अनुसार परिभाषित किया गया है) एक उच्च परिशुद्धता गेज गहराई के साथ सेट कर दिया जाता है. एक तेल पकड़ने और मीडिया मुहर जगह में हैं सुनिश्चित करें कि कक्ष आवास कोशिकाओं को स्वच्छ और तेल और मलबे से मुक्त रखा जाता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH / NHLBI अनुदान R01 HL082689 द्वारा स्कॉट मैं साइमन और एंथोनी जी Passerini समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
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References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
