Summary
Микрофлюидных камеры поток травлению с помощью фотолитографии и изготовлены из PDMS применяется для исследования функциональных исходов, связанных с ЕС дисфункцию и воспаление. В эксперименте представителя, возможность дифференциального напряжения сдвига для модуляции клеточной адгезии моноцитов к цитокина активированных ЕС монослоев показано.
Abstract
Атерогенез потенцируется метаболических нарушений, которые способствуют повышенному состояние системного воспаления в результате эндотелиальной дисфункции. Однако в начале функциональные изменения эндотелия, которые показывают уровень человека риск напрямую не оценивали клинически, чтобы руководство терапевтической стратегии. Кроме того, регулирование воспаление местных гемодинамики способствует неслучайных пространственного распределения атеросклероза, но механизмы их трудно разграничить в естественных условиях. Мы описываем лаборатории-на-чипе подход к количественной анализа метаболических возмущение воспалительных явлений в человеческих эндотелиальных клеток (ЭК) и моноцитов под конкретные условия потока. Стандартные методы мягкой литографии используется для microfabricate сосудистой миметического микрофлюидных камеры (VMMC), которые связаны непосредственно с культурным монослоев ЕС. 1 Эти устройства имеют преимущества использования малых объемов реагентов в то время каксоздание платформы для визуализации непосредственно воспалительных явлений в мембране ЕС подвергается четкой сдвига поля. Мы успешно применять эти устройства для исследования цитокинов, 2 липидов 3, 4 и RAGE-индуцированного воспаления в 5 аорты человека ЕС (HAEC). Здесь мы документировать использование VMMC для анализа моноцитарно клетки (THP-1), проката и ареста HAEC монослоев, которые обусловлены по характеристикам дифференциального сдвига и активировать цитокина TNF-α. Исследования, подобные этим, обеспечение механистического понимания atherosusceptibility при метаболических факторов риска.
Protocol
1. Культуры клеток и Подготовка основания
- Вырезать 3-дюймовый круговой подложки от 100 х 20 мм, культуры тканей блюдо (BD Сокол) с помощью токарного станка. Стерилизовать субстратов погружения в 70% этаноле. Место в чашку Петри и пальто с 4 мл типа я коллагена (100 мкг / мл) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промыть 4 мл 1 х PBS.
- Приостановить человека аорты эндотелиальных клеток (HAEC, прохождение 4-6) в 6.5x10 5 клеток / мл и семян путем применения 1 мл непосредственно на подложке. Место в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора и позволяет клеткам присоединиться к подложке в течение 1 часа.
- Добавить 9 мл среднего роста эндотелия-2 (ВОС-2) с добавлением антибиотиков 1x противогрибковым решение клеток. Изменение среды каждые 2 дня до клеток до 90% слияния.
- Поддерживать ТНР-1 клеток в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1 противогрибковый антибиотик решение. Прохождение клеток, когда они достигнут плотности 10 6 клеток / мл.
2. Протокол сотового ножницы
Клетки обусловлено в пользовательском конусом и пластиной Сотовые ножницы устройства (CSD). Устройство деталей и технических спецификаций, описаны в таблице 1 и на Рисунке 4.
- Подготовка по устойчивому развитию. Стерилизовать камеру корпус с этанолом и промыть стерильной PBS. Нагрейте жилья до 37 ° C и уровня для того, чтобы конуса перпендикулярна клеточный монослой. Соберите субстрата с клетками из нижней части корпуса и установка конуса на нужную высоту.
- Используйте Лейбовиц-15 (L-15) среде с эндотелиальной BulletKit как стрижка средней для поддержания нормальной рН в отсутствие CO 2. Чтобы стимулировать воспаление, добавить фактор некроза опухоли-α (ФНО-α, 0,5 нг / мл), стрижка средней и вводить 6 мл в устройстве с помощью шприца, соединенного с входным отверстием, заботясь, чтобы не ввести воздухпузырьков в камере.
- Сдвиг клеток с высокой величиной устойчивый напряжения сдвига (HSS, 15 дин / см 2) или колебательного напряжения сдвига (OSS, 0 ± 5 дин / см 2, 1 Гц) в течение 4 часов. Желаемый SS достигается путем вращения конуса над клетками, которые точно контролируется с микро-шаговый двигатель, как описано выше 6 стене СС на поверхности (τ т) приближается.:
где μ-вязкость среды, ω-угловая скорость конуса, и α есть угол конуса (0,5 °). Конус выравнивания с подложкой регулируется с точностью до 0.05 ° по точности выравнивания и зазора высоты установлен на уровне 20 ± 10 мкм использованием глубины, чтобы минимизировать кольцевых и радиальных изменения τ ш. Прибор был проверен обеспечить характеристики ламинарного потока. Удалить слоктя от устройства и подготовить для анализа моноцитов адгезии.
3. Изготовление PDMS микрофлюидных палаты
- Получить мастер формы для желаемого микрофлюидных номер канала и его высота в зависимости от приложения. Характеристики конкретной конструкции, используемые в настоящем протоколе подробно описаны в таблице 1. Метод создания этих уже хорошо описаны в литературе 1. Короче говоря, сеть каналов разработан с использованием САПР (Autodesk Inventor) и напечатаны в 5000 точек на дюйм на прозрачность. Отрицательные фоторезиста (SU8) вращается на кремниевой пластины толщиной до 100 мкм. Прозрачность накладывается и воздействию ультрафиолетового излучения. Номера для полимеризации фоторезиста удаляют, чтобы создать положительный мастер реплики.
- Для того, чтобы решение PDMS смесь силиконовой базе силикона отвердителя 10:01 по массе в вес лодки и перемешать с 5 мл серологические пипетки. Будьте осторожны, чтобы не царапать стенына вес лодки, чтобы избежать добавления пластиковые хлопья к решению.
- Установите мастер пластин в 100x15 мм чашку Петри и залить раствор в PDMS блюдо.
- Накройте блюдо и поместить его в вакуумный контейнер на 15 минут, чтобы удалить пузырьки. Через 15 минут взять чашку Петри, и удалите остатки пузырьков, мягко поток воздуха над поверхностью.
- Поместите чашку Петри в духовке в течение 1 часа при температуре 70 ° C. Снимите посуду и вырезать микрофлюидных камеры с помощью острого ножа.
4. Собрание устройств на микроскоп
- Включите источник света для инвертированного микроскопа и установить нагреватель до 37 ° C. Прикрепите трубку к 10 мл шприц и заполнить дистиллированной водой так, что нет пузырей. Поместите шприц в насос шприца и установленный расход, чтобы побудить стены SS 1 дин / см 2. Напряжение трения на стенке (τ ш), порожденная по средней линии канала приближается использованием стандартныхуравнения для плоского потока камеры:
где μ-вязкость среды, Q-объемный расход, ч является каналом высоту и ш ширины канала. Примечание: так как каналы конечной ширины фактического τ ш будет меняться с т в зависимости от канала пропорции, и измерения избегать 25% ближайших боковых стен. 1,7 - Поместите PDMS камеру в воду и используют 100 мкл микропипетки для удаления воздуха из отдельных каналов. Присоединить вакуумный адаптер для камеры убедитесь, что клапан выключен.
- Поместите чашку Петри с HAEC монослоя на цель. Установите камеру PDMS на чашку Петри и осторожно поставил ее на HAEC монослоя, обеспечивая при этом, что никакие воздушные пузырьки образуют между устройством и монослоя. Поверните клапан, чтобы вакуум в камере и прочно закреплен. Вырезать 19 игл калибровочных притупить, что есть только 5 мм металла слева. Наполните пластиковую емкость с буфером и введены в PDMS вход камеры. Повторите эти действия для соответствующего количества каналов, которые будут использоваться. Прикрепите трубку от шприцевые насосы для PDMS канал выхода.
5. Моноцитарный Анализ адгезии при сдвиге стресс
- Приостановить THP-1 клетках 2х10 6 кл / мл в HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + + 0.1% HSA. Активировать ТНР-1 клеток путем инкубации с стромальных полученные фактор-1 (SDF-1, 50 мкг / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Включите шприцевой насос для создания потока, а затем добавить 50 мкл клеточной суспензии в резервуар, не вводя пузырьков воздуха. Как только поток полностью разработана, начинается сбор данных.
- Выполнить в течение 5 мин на соответствующих расхода, добавив буфера в резервуар если решение становится низкой. Продолжать текущий буфер в каналы, чтобы смыть любые свободные клетки в потоке.
6. Сбор и анализ данных
- Получить цифровых последовательностей изображений со скоростью 3 кадра / с в течение 2 минут после полностью развитого течения вдоль продольной оси канала на 3 места в канале, заботясь, чтобы не записывать сразу после входа или перед выходом в порты или 25% ближайших стороны стены.
- Подсчитайте число арестованных клеток на поле определения их фазы, яркая внешность в той же фокальной плоскости, как монослой.
- Арест фирма клетки определяется движение <½ клетки диаметром в 10 сек. Средние данные за 3 случайных полей / канал и количественного использования ImageJ программного обеспечения.
7. Представитель Результаты
Несмотря на эндотелий сосудов равномерно подвергаются агонисты, которые способствуют системное воспаление, атеросклероз является координационным болезнь, которая развивается преимущественно в местах нарушения потока в артериях, вовлекая пространственной неоднородности функции эндотелия 8. 9, 10 TNF-α индуцирует хорошо характеризуется отклик в ЕС, что включает в себя до регулирования молекул клеточной адгезии (CAM , например VCAM-1, ICAM-1, E-селектина) и хемокинов, которые вербуют моноцитов из кровотока, отличительной чертой раннего поражения атеросклеротическим 11 гемодинамики является важным регулятором эндотелиальных воспалительный фенотип 12 Высокие напряжения сдвига величины (HSS.. например, 15 дин / см 2) или пульсирующего напряжения сдвига (PSS, например, 15 ± 5 дин / см 2), связанный с сайтов сопротивления атеросклероза в артериях вниз регулировать TNF-α-индуцированных реакций. И наоборот, низкие величины напряжения сдвига (LSS, например, 2 дин / см 2) или колебательного сдвига (OSS, например, 0 ± 5 дин / см 2), характерный восприимчивых сайтов в естественных условиях, усугубляют cytokiпе-индуцированного воспаления. 13, 14 Наша микрожидкостных устройств PDMS обеспечить платформу для проведения исследований механистический для проверки гипотез, связанных с наложением метаболического стресса с гидродинамических факторов в регуляции функции эндотелия и патологии. Полезность и универсальность подхода широко иллюстрируется следующими результатами представителя.
Рисунок 1. Касательное напряжение дифференциально модулирует THP-1 межклеточной адгезии к ФНО-α воспаленной эндотелиальных монослоев. Эти данные были получены с помощью подробных протоколов, описанных выше и задокументированы на видео. HAEC монослоев были подвержены воздействию одновременно низкие дозы цитокина TNF-α (0,5 нг / мл, ~ EC 50 VCAM-1 до-регулирование) и либо HSS (15 дин / см 2) или OSS (0 ± 5 дин / см 2, 1 Гц) в пользовательской КУР в течение 4 часов, как ОПИСАНИЕкровать в подробный протокол. THP-1 клеточного была количественно при сдвиге потоков в камере поток PDMS. Эта клеточная линия, которая имитирует фенотип человеческих моноцитов была выбрана для его воспроизводимости и простоте использования. HSS ослабление воспалительной реакции по сравнению с OSS, что приводит к снижению THP-1, клетки сердца. Данные были проанализированы с помощью Стьюдента проверки и представлены как среднее ± SEM 3 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения DeVerse и др. 5.
Следующие данные показывают, универсальность нашего подхода с использованием примеров из опубликованных работ. Отклонения от указанных протоколе указано, где это применимо.
Рисунок 2. Модуляция цитокин-индуцированного VCAM-1 выражение и моноцитов в наборе сдвиг градиент стресса. А) HAEC монослоев стимулировали TNF-α (0,3 нг / мл) в течение 4 часов при флош в VMMC разработан на основе Хил-Шоу течения теории 15. линейное уменьшение величины SS вдоль осевой линии канала была достигнута путем разработки боковых стенках камеры совпадают с линиями тока в двумерном торможения потока и формирование в конце канала в соответствии с ISO-потенциал линии. Напряжение трения на стенке (τ ш), порожденная по осевой линии данного канала на осевом расстоянии от входа (х) определяется по формуле:
где μ-вязкость среды, Q-объемный расход, ч является каналом высоту, до 1 ширина входного канала и L является общей длины канала. Вопрос был выбран для создания градиента по величине из 16 SS дин / см 2 на входе 0 в критической точке "а" просто проксимальнее outleт. B)-C) VCAM-1 выражение было измерено на месте с помощью иммунофлуоресценции микроскопии с использованием антител, конъюгированных с квантовыми точками и представлены в процентах средней интенсивности флуоресценции (МФО) в нестимулированных статического контроля. СС не модулировать базального уровня VCAM-1, что является низким в нестимулированных HAEC (серый треугольник). Тем не менее, VCAM-1 выражение увеличился по отношению к ФНО-α в величинах LSS, достигая максимума в ~ 2 дин / см 2 и возвращение к ФНО-α базового или ниже величины сдвига при> 5 дин / см 2 (черные квадраты). D) Моноциты (10 6 / мл) перфузии в 2 дин / см 2 в течение 5 мин в параллельных каналов обтекании монослоев обусловлена, как и в). Моноцитарный набор на эндотелий количественно связана с VCAM-1 выражение в данной величины напряжения сдвига. Примечательно, что возможность проверки VCAM-1 выражение и моноцитов набор с мелкими пространственное разрешение в monolayeГ показало существенные изменения в узком диапазоне по величине СС, которые не будут оценены, применяя лишь несколько дискретных значений сдвига в отдельных экспериментах. Данные были проанализированы с помощью повторных измерений ANOVA и различия оценку Ньюмена-Keuls итогового * P <0,05 с ФНО-α в статических условиях. Данные среднее ± SEM из 3-6 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения Цзоу и др. 2.
Рисунок 3. Триглицеридов богатых липопротеинов (TGRL) модулировать цитокин-индуцированного воспаления в пропорции к донорам сыворотке крови триглицеридов и VCAM-1 выражение. HAEC монослоев стимулировали TNF-α (0,3 нг / мл) в течение 4 часов одновременно с TGRL (10 мг / дл ApoB), выделенных из человеческих субъектов после еды с высоким содержанием жира в статическом культуры.) VCAM-1 выражение измеряли отдельно в ЕС приостановлен с помощью проточной цитометриии моноцитов адгезии количественно, используя VMMC, как описано в подробный протокол. Данные представлены в виде% по сравнению с ФНО-α. Моноцитарный арест изменяться в прямой зависимости от эндотелия VCAM-1 выражение, которое увеличилось непосредственно с уровнем триглицеридов сыворотки доноров. B) Моноцитарный арест на множество провоспалительных доноров была отменена в присутствии VCAM-1 блокирования антител. Значение определяется парными Стьюдента-тест, значит, ± SEM от 3-5 независимых экспериментов. Адаптировано с разрешения Wang и др. 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем использование микрожидкостных устройств для PDMS на чипе оценки эндотелиальной воспалительной фенотип через реальном времени изображений CAM выражения и моноцитов адгезии. Главное преимущество нашего подхода заключается в способности к количественному результаты, связанные с эндотелиальной дисфункции в клетках, подвергнутых воспалительных медиаторов, таких как пищевые липиды и цитокинов при определенных условиях, которые отражают гидродинамические напряжения сдвига в атерогенных суда. VMMC облегчить использование небольших количеств реагентов и материалов, которые могут быть в ограниченном количестве и имеют дополнительное преимущество быть недорогим, настраиваемым и поддается высокую пропускную способность.
Использование микрожидкостных устройств представляет собой альтернативу макромасштабе подходы, которые были использованы на десятилетия исследовать реакцию ЕС на культурный сдвиг. К ним относятся плоского потока камер, цилиндрических труб, и конус и пластины вискозиметров, каждый из которых составляет околоpable введения устойчивой, ламинарного течения Пуазейля условиях (см. обзор 16). Изменения в этих устройствах может привести к временной или пространственные изменения напряжения сдвига стены или даже повторять артериальной сигналов 6. Однако в целом эти устройства требуют большого количества средств массовой информации, являются дорогими в изготовлении, менее гибкой, и страдают от сравнительно низкой пропускной способностью.
Ограничения существуют также с использованием VMMCs. Эти устройства разработаны на основе плоского потока теория, которая предполагает бесконечную ширину. Это разумное предположение макромасштабе устройств, где ширина гораздо больше, чем высота. Тем не менее, конечная ширина микрофлюидных каналов требует, что исследования проводятся по центру продольной оси канала для устранения побочных эффектов, стены, так как фактические τ ш будет меняться с т в зависимости от соотношения сторон канала. 1, 7 Аналогично измерения не принимаются близко тО въезде и выезде из каналов, чтобы избежать входа эффектов. Мы исключили любые значительные паракринной сигнализации эффектов или воспаление индуцированного повреждения или порчи ЕС вызвано герметизации устройства однослойных как вклад в наше наблюдали ответов. PDMS имеет высокое сродство к гидрофобных молекул, что может привести к поглощению выделяется хемокинов и неспецифических взаимодействий между лейкоцитами и VMMC. Тем не менее, мы не нашли, что это проблема на протяжении всего нашего исследования 2.
Использование потока устройства с культивируемых клеток является редукционистской подход, который способствует механистического исследования и демонстрации причинно-следственной связи по отношению к напряжению сдвига. Тем не менее, ограничения в любой подход пробирке является предположение, что это будет достаточно повторять сложности окружающей среды в родной артерий. В естественных условиях, эндотелиальные клетки хронически адаптированы к сложной модели потока иподлежат взаимодействия с другими клетками, матрицы и гуморальных медиаторов, которые регулируют их поведение.
Стоит отметить, что все приведенные выше результаты в краткосрочной модели и как таковая не может быть время, инвариантной. Тем не менее, они представляют эксперименты, которые мы обычно выполняют исследовать механизм под острым воспалительным проблемой. Соответствующие стратегии для нашего исследования является мониторинг изменений воспалительного базовой низкие дозы ФНО-α стимуляция, для которых представляет 4 часа пик приблизительно VCAM-1 выражение. Мы зафиксировали в нескольких исследованиях, что изменения в поверхности выражение VCAM-1 коррелирует с повышенной моноцитов набора в этих условиях. 2-4, 17
Кроме того, выбор SS сигнала может вызвать дифференциальная эндотелиальных реакций. В наш представитель протокол мы документировать использование VMMC количественно моноцитов события адгезии HAEC обусловлено в суслышать напряжения выбран представитель сайтов относительного сопротивления (HSS) и восприимчивости (OSS) для атеросклероза в артериях в настроенное устройство сдвига клетки. В соответствии с предыдущими данными в культуре ЕС, HSS ослабление ответ на активацию цитокинов по сравнению с OSS. 12, 13 результаты согласуются с большей вседозволенности к воспалительным активизации ЕС в местах поток нарушений в естественных условиях. Хотя эти условия, как правило, используются для представления спокойно и возмущенного течения, соответственно, они не полностью повторять сложности потока в артериях. Тем не менее, богатство литературы поддерживает их использование в качестве простого приближения, адекватно воспроизводит основные черты поток 14.
Примечательно, что наш конус и плиты на основе CSD способен генерировать более сложные сигналы и кондиционирования клеток на более длительные сроки, как сообщалось ранее. 6 Таким образом, сопряжение с VMMC Комиссии по устойчивому развитию в описанном пр.otocol придает максимальную степень гибкости. Рассмотрение этого подхода заключается в ориентации VMMC по отношению к направлению сдвига кондиционирования в КУР, в котором HAEC опыт потока в окружном направлении. На практике, VMMC ориентирован так, что каналы параллельны поле течения и вход перед условным клетки, насколько это возможно. Каналы достаточно малы, что это представляет собой разумное приближение. Однако мы также продемонстрировали в предыдущем исследовании, которое течет моноцитов параллельно или перпендикулярно к направлению сдвига кондиционирования в VMMC не влияют на результаты, показанные на рисунке 2, 2.
Дополнительные соображения, связанные с в пробирке методы включают изменчивость индуцированных фенотипических дрейф связан с последовательным пассажи ЕС в области культуры и неоднородность в ЕС или изолированных моноцитов. HAEC как правило, должны быть использованы при прохождении 6 и каждая партияхарактерны для последовательного воспалительный ответ на ФНО-α. Использование клеточной линии, такие как THP-1 может уменьшить изменчивость, связанные с использованием моноцитов, которые изменяются в деятельности доноров и легко активировать их изоляции. В целях обеспечения воспроизводимые и точные функциональные показания, сотовые подготовка и передача должна быть минимизирована. Тщательный отбор контроля необходимо осмысленно интерпретировать результаты. В зависимости от опыта, они могут включать неочищенных или статической культуре клеток, TNF-α лечения, неактивированных ТНР-1 клеток, применение блокирующих антител, siRNAs или фармакологические ингибиторы, и другие.
Как свидетельствует о гибкости подхода, мы применили эти устройства для исследования цитокинов, 2 липидов 3, 4 и RAGE-индуцированного воспаления в 5 HAEC. Наши исследования включали измерения воспалительный потенциал сыворотки производных частиц липидной от человека сubjects на эндотелиальных клетках, 3, 4 и моноцитов. 17 В альтернативной стратегии, моноциты могут быть представлены с субстратами производные с иммобилизованными молекул, таких как VCAM-1 для изучения механизмов сцепления. Используя этот подход, мы уже продемонстрировали функциональную роль в адгезии CD11c, которая сотрудничает с большим опозданием антигена (VLA) -4 в моноцитов адгезией к VCAM-1 при дислипидемии у человека 17 и мышей 18. С моноцитов может быть легко активирован их изоляции, мы также разработали целый анализ крови для использования в нашей лаборатории встроенным устройством для обеспечения более чувствительным и воспроизводимым обнаружения 17.
В конце концов, в дополнение к обеспечению понимания ранних воспалительных реакций, лежащих в основе атеросклероза, мы видим, что развитие технологий приведет к верных подходов естественных бывший оценки риска человека воспаление опосредованного сердечно-сосудистыми заболеваниями, что открывает Wай развития персонализированной диагностики, которые сообщают о моноцитов и ЕС активации.
| Конус-и-плиты Сотовые ножницы устройств | ||
| Конус Радиус | 0,06985 | метр |
| Угол сходимости | 0,00877 (0,5 °) | рад (градусы) |
| Gap Height | 20 ± 10 | мкм |
| Максимальная угловая скорость (для эксперимента изложены здесь) | 18,85 | рад / с |
| Кинематическая вязкость | 0,00077 | м 2 / с |
| Максимальное число R (для эксперимента изложены здесь) | 0.000758 | безразмерный |
| VMMC характеристики | ||
| Длина канала | 8,0 | мм |
| Высота канала | 60 | мкм |
| Ширина канала | 2 | мм |
| Число рейнольдса | 1,67 | безразмерный |
Таблица 1. CSD и VMMC характеристики.
Рисунок 4. Поперечное сечение конуса и пластины ячейки сдвига устройства (CSD). CSD состоит из нержавеющей стали цилиндрической конус, который вращается над стационарной подложке культуре клеток. Угол конуса и высота зазора являются критическими параметрами, которые определяют характер сдвига поля, создаваемого при наличии питательной среды. Число Рейнольдса показывает изменение отношения к центробежным силам вязкости определяется по формуле:
<бр />
где г-радиус конуса, ω угловая скорость, α есть угол конуса, а ν есть кинематическая скорость жидкости. Если R << 1 центробежные силы невелики, поток ламинарный и чисто азимутальным и индуцированного напряжения сдвига является постоянным монослоя. 19 В нашем CSD, подложки с культивируемых клеток загружается снизу в камеру, где находится конуса. Средний добавлен в камеру и использовать в качестве сдвига жидкости. Конус установлен с предварительно загруженным прецизионных подшипников и вращения управляется микро-шаговый двигатель. Система точного выравнивания поддерживает выравнивание перпендикулярно к клеточной поверхности. Разница высоты (определяется расстояние от вершины конуса к клетке субстрата) установлена с высокой точностью глубины. Смазка поймать и СМИ уплотнение в месте для того, чтобы камера жилья клеток чистыми и свободными от нефти и мусора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH / NHLBI грант R01 HL082689 Скотт И. Саймон и Энтони Дж. Пассерини.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
