Abstract
Aterogenes potentieras av metabola störningar som bidrar till en ökad tillstånd av systemisk inflammation resulterar i endotel dysfunktion. Dock tidiga funktionella förändringar i endotelet som betyder en individs risknivå inte direkt bedömas kliniskt för att vägleda terapeutisk strategi. Dessutom bidrar regleringen av inflammation av lokala hemodynamiken till den icke-slumpmässiga geografiska fördelningen av åderförkalkning, men mekanismerna är svåra att avgränsa in vivo. Vi beskriver ett lab-on-a-chip metod för att kvantitativt analys metabolisk störning av inflammatoriska händelser i humana endotelceller (EG) och monocyter enligt exakta flöde. Standardmetoder för mjuk litografi används för att microfabricate vaskulära mimetiska mikrofluidiska kammare (VMMC), som är bundna direkt till odlade EC monoskikt. 1 Dessa anordningar har fördelen med att använda små volymer av reagens medantillhandahålla en plattform för direkt avbildning av inflammatoriska händelser på membranet i EG utsätts för en väldefinierad skjuvning området. Vi har framgångsrikt tillämpat dessa enheter för att undersöka cytokin-, 2 lipid-3, 4 och RAGE-inducerad 5 inflammation i mänsklig aorta EG (HAEC). Här har vi dokumentera användningen av VMMC att analysera monocytisk cell (THP-1) valsning och gripande om HAEC monolager som konditioneras under egenskaper differentiella skjuv-och aktiveras av inflammatoriska cytokin TNF-α. Studier som dessa tillhandahåller mekanistiska inblick i atherosusceptibility i metabola riskfaktorer.
Protocol
1. Cellodling och Förbehandling
- Skära 3-tums cirkulära substrat från en 100 x 20 mm vävnadsodlingsskål (BD Falcon) med användning av en svarv. Sterilisera substrat genom nedsänkning i 70% etanol. Rum i en Petri-skål och belägga med 4 ml typ-I-kollagen (100 | ig / ml) under 1 h vid rumstemperatur och sköljs sedan med 4 ml 1 x PBS.
- Suspendera humana aortaendotelceller (HAEC, passagen 4-6) vid 6.5x10 5 celler per ml och frö genom applicering 1 ml direkt på substratet. Rum i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator och tillåta cellerna att vidhäfta till substratet under 1 timme.
- Tillsätt 9 ml Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) kompletterat med 1 x antibiotika-antimykotika-lösning till cellerna. Ändra mediet var 2 dagar tills cellerna når 90% konfluens.
- Bibehålla THP-1-celler i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS och 1 x antibiotika-antimykotika-lösning. Passage-celler när de når en densitet av 10 6 celler / ml.
2. Cell Klippning protokoll
Celler konditioneras i en anpassad kon-och platta Cell Klippning Device (CSD). Device detaljer och specifikationer konstruktion dokumenteras i tabell 1 och figur 4.
- Förbered CSD. Sterilisera kammarkåpan med etanol och sköljdes med steril PBS. Värm höljet till 37 ° C och nivå för att säkerställa att den koniska är vinkelrät mot cellmonoskiktet. Montera substratet med cellerna från botten av huset och in i könen till önskad höjd.
- Använda Leibovitz-15 (L-15) medium utökat med Endothelial BulletKit som skjuvningen medium för att bibehålla korrekt pH i frånvaro av CO 2. Att stimulera inflammation, tillsätt tumörnekrosfaktor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) till mediet skjuvning och injicera 6 ml i anordningen via en spruta ansluten till en inloppsport, se till att inte införa luftbubblor i kammaren.
- Skjuv-celler vid en hög magnitud stadig skjuvspänning (HSS, 15 dyn / cm 2) eller en oscillerande skjuvspänning (OSS, 0 ± 5 dyn / cm 2, 1 Hz) under 4 timmar. Den önskade SS uppnås genom att vrida konan ovanför cellerna, som just styrs med en mikro-stegmotor som tidigare beskrivits Väggen SS på ytan (τ W) approximeras med 6.:
där μ är viskositeten hos mediet, är ω vinkelhastigheten hos könen, och α är konvinkeln (0,5 °). Konen anpassning till underlaget justeras till inom 0,05 ° genom precision utjämning och klyftan höjd inställd på 20 ± 10 nm med hjälp av en djupmätare för att minimera omgivande och radiell variation i τ w. Enheten har validerats för att säkerställa egenskaper laminärt flöde. Avlägsna calnar från enheten och förbereda för analys av monocyter vidhäftning.
3. Tillverkning av PDMS mikroflödessystem avdelningen
- Skaffa herre form för önskat mikroflödessystem kanalnummer och kanal höjd beroende på applikation. Egenskaperna hos den specifika design som används i detta protokoll redovisas i tabell 1. Metod för att skapa dessa är redan väl dokumenterad i litteraturen., Är nätverket av kanaler konstruerats med hjälp av CAD-program (Autodesk Inventor) 1 kort och skriva vid 5000 dpi på en transparens. Negativ fotoresist (SU8) spinns på en kiselskiva till en tjocklek av 100 pm. Transparensen överlagras och exponerades för UV-ljus. Icke-polymeriserade fotoresist tas bort för att skapa positiva repliken master.
- För att göra PDMS lösning grundblandningen silikon med silikon härdare 10:01 i vikt en väger båt och rör om med en 5 ml serologisk pipett. Var noga med att inte skrapa väggarnaav vågskålen för att undvika att lägga till plast flingor till lösningen.
- Placera befälhavaren skivan i en 100x15mm Petri-skål och häll PDMS lösningen i skålen.
- Täck plattan och placera den i en vakuumbehållare 15 minuter för att avlägsna bubblor. Efter 15 minuter ta petriskålen ut och avlägsna eventuellt överskott av bubblor genom att försiktigt blåsa luft över ytan.
- Placera petriskål i en ugn under 1 timme vid 70 ° C. Ta bort skålen och klipp ut mikroflödessystem kamrarna med en skarp kniv.
4. Montering av enhet på mikroskop
- Aktivera ljuskällan till inverterat mikroskop och inställd värmaren till 37 ° C. Fästa slangen till en 10 ml spruta och fylls med destillerat vatten så att det inte finns några bubblor. Placera sprutan på en sprutpump och inställda flödet för att inducera en vägg SS av 1 dyn / cm 2. Väggen skjuvspänning (τ vikt) genereras utmed centrumlinjen av kanalen approximeras med användning av standardenEkvationen för en parallell-lamell-flödeskammaren:
där μ är viskositeten hos mediet, Q är den volymetriska flödeshastigheten, h är höjden kanal, och w är kanalbredden Anm. eftersom kanalerna är av begränsad bredd själva τ w varierar med vikt beroende på den kanal bildformat, och mätningar undvikas vid 25% närmast sidoväggarna. 1,7 - Placera PDMS kammare i vatten och använd en 100 ^ mikropipett för att avlägsna luft ur de enskilda kanalerna. Fäst vakuum adaptern till kammaren att se till att ventilen är avstängd.
- Placera Petri skål med HAEC enkelskikt över målet. Placera PDMS kammaren över Petri-skål och försiktigt den på HAEC monoskiktet samtidigt som det garanteras att inga luftbubblor bildas mellan enheten och monoskiktet. Vrid ventilen så att vakuumet är på och kammaren sitter fast ordentligt. Skär 19 nålar trubbigt så att det är endast 5 mm av metall vänster. Fyll i plast behållaren med buffert och tas i PDMS kammaren entré. Upprepa för lämpligt antal kanaler som skall användas. Fäst slangen från sprutan pumpar till PDMS kanal utgångar.
5. Monocyt vidhäftningsanalys Enligt skjuvspänningen
- Suspendera THP-1-celler vid 2x10 6 celler / ml i HBSS + Ca 2 + / Mg2 + + 0,1% HSA. Aktivera THP-1-celler genom inkubering med stromala härledd faktor-1 (SDF-1, 50 | ig / ml) under 15 min vid rumstemperatur.
- Aktivera sprutpump för att upprätta flöde, tillsätt sedan 50 pl av cellsuspensionen till behållaren utan att införa luftbubblor. När flödet är fullt utvecklad, börja datainsamling.
- Kör i 5 minuter vid lämpligt flöde, lägga buffert till reservoaren om lösningen blir låg. Fortsätta att strömma buffert in i kanalerna för att tvätta ut eventuella obundna celler i flödesströmmen.
6. Datainsamling och analys
- Skaffa digitala bildsekvenser på 3 bilder / s för 2 minuter efter fullt utvecklad strömning längs den längsgående axeln på kanalen på 3 platser i kanalen, noga med att inte spela in direkt efter ingången eller före utloppsportar eller i 25% närmast sidan väggar.
- Räkna antalet arresterade celler per fält genom att identifiera deras fas-ljusa utseende i samma fokalplanet som monoskiktet.
- Fast cell gripande definieras av rörelse <½ cell diameter i 10 sekunder. Medelvärden över 3 slumpmässiga fält / kanal och kvantifiera med ImageJ programvara.
7. Representativa resultat
Även det vaskulära endotelet är jämnt utsätts för agonister som bidrar till systemisk inflammation, är ateroskleros en samlingspunkt sjukdom som utvecklas företrädesvis på platser av flödet störningar i artärerna, blandar rumsliga heterogenitet i endotelfunktion. 8 9, 10 TNF-α inducerar en väldefinierad svar i EG som innefattar uppreglering av celladhesionsmolekyler (CAM , t.ex. VCAM-1, ICAM-1, E-selektin) och kemokiner som rekryterar monocyter från cirkulationen, ett kännetecken för den tidiga aterosklerotiska lesionen 11 hemodynamiken är en viktig regulator av endotel inflammatorisk fenotyp 12 Hög omfattning skjuvspänningen (HSS.. t.ex. 15 dyn / cm 2) eller pulserande skjuvpåkänning (PSS, t.ex. 15 ± 5 dyn / cm 2) som är associerad med områden av resistens mot ateroskleros i artärer nedreglera TNF-α-inducerade svar. Omvänt, låg omfattning skjuvspänningen (LSS, t.ex. 2 dyn / cm 2) eller oscillerande skjuvning (OSS, t.ex. 0 ± 5 dyn / cm 2), karakteristiska av mottagliga ställen in vivo, förvärrar cytokine-inducerad inflammation. 13, 14 Våra mikroflödessystem PDMS enheter erbjuder en plattform för att bedriva mekanistiska studier för att pröva hypoteser relaterade till överlagring av metabolisk stress med hydrodynamiska faktorer i regleringen av endotelfunktion och patologi. Nyttan och mångsidighet förhållningssätt i stort sett illustreras genom följande representativa resultat.
Figur 1. Skjuvspänningen modulerar differentiellt THP-1 celladhesion till TNF-a inflammation endotel monolager. Dessa data har förvärvats med hjälp av detaljerade protokoll som beskrivs ovan och dokumenteras i videon. HAEC monoskikt samtidigt utsätts för en låg dos av det inflammatoriska cytokin TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EG 50 för VCAM-1 uppreglering) och antingen HSS (15 dyn / cm 2) eller OSS (0 ± 5 dyn / cm 2, 1 Hz) i en anpassad CSD under 4 timmar enligt beskrivningsäng i den detaljerade protokollet. THP-1 cells gripande kvantifierades enligt skjuvflöde i en PDMS flödeskammare. Denna cellinje som efterliknar fenotypen av humana monocyter valdes för dess reproducerbarhet och enkel användning. HSS dämpas den inflammatoriska responsen jämfört med OSS, vilket resulterar i minskad THP-1 cell gripande. Data analyserades med Students t-test och representeras som medelvärde ± SEM för 3 oberoende experiment. Anpassad med tillstånd från DeVerse et al. 5
Följande data visar mångsidigheten hos vår strategi med hjälp av exempel från vår publicerade arbeten. Avvikelser från ovanstående protokoll anges i tillämpliga fall.
Figur 2. Modulering av cytokin-inducerad VCAM-1-expression och monocytrecruitment i en skjuvspänning gradient. A) HAEC monoskikt stimulerades med TNF-α (0,3 ng / ml) under 4 h under flow i en VMMC utformas baserat på Hele-Shaw flöde teori. 15 En linjär minskning i storleken SS utmed centrumlinjen av kanalen uppnåddes genom att konstruera sidoväggarna hos kammaren för att sammanfalla med den förenklar av en tvådimensionell stagnation flöde och formning av änden av kanalen för att matcha de iso-potential linjer. Väggen skjuvspänning (τ vikt) genereras utmed centrumlinjen av denna kanal på ett axiellt avstånd från ingången (x) ges av:
där μ är viskositeten hos mediet, Q är den volymetriska flödeshastigheten, h är höjden kanal, w 1 kanalens ingång bredd, och L är den totala kanallängden. Q valdes för att alstra en gradient i SS storlek från 16 dyn/cm2 vid inloppet till 0 vid stillastående punkten "a" alldeles proximalt till outlet. b)-C) VCAM-1 expressionen mättes in situ genom immunofluorescens-mikroskopi med användning av antikroppar konjugerade till kvantprickar och presenteras som procentuell median fluorescensintensitet (MFI) av ostimulerade statisk kontroll. SS inte modulerar den basala nivån av VCAM-1, som är låg i ostimulerade HAEC (grå trianglar). Ökade dock VCAM-1-uttryck i förhållande till TNF-α vid LSS storheter, med en topp på ~ 2 dyn / cm 2 och återvänder till TNF-α baslinjen eller lägre vid skjuvning storheter> 5 dyn / cm 2 (svarta rutor). D) monocyter (10 6 / ml) perfunderades vid 2 dyn/cm2 under 5 min i parallella flödeskanaler över monoskikt förkonditionerats som i A). Monocytrecruitment till endotel korrelerade kvantitativt med VCAM-1 expression vid en given skjuvspänning magnitud. Synnerhet förmågan att sondera VCAM-1-expression och monocytrecruitment med fin rymdupplösning i en monolayer avslöjade signifikanta förändringar över ett smalt område i SS storlek som inte skulle uppskattas genom att endast ett fåtal diskreta värden på skjuvning i separata experiment. Data analyserades genom upprepade mätningar ANOVA och skillnader som bedöms av Newman-Keuls-posttest, * P <0,05 från TNF-α under statiska betingelser. Data är medelvärde ± SEM från 3-6 oberoende experiment. Anpassad med tillstånd från Tsou et al. 2
Figur 3. Triglyceridrika lipoproteiner (TGRL) modulera cytokin-inducerad inflammation i förhållande till givaren serumtriglyceridnivåer och VCAM-1 expression. HAEC monoskikt stimulerades med TNF-α (0,3 ng / ml) under 4 h samtidigt med TGRL (10 mg / dl ApoB) isolerade från människa efter en fettrik måltid i statisk kultur. A) VCAM-1-uttryck mättes separat i upphängd EG genom flödescytometrioch monocyt vidhäftning kvantifierades med användning av en VMMC såsom beskrivits i den detaljerade protokollet. Data presenteras som% förändring från TNF-α. Monocyt gripande varieras i direkt proportion till endotel VCAM-1 expression, som ökade direkt med graden av donator serumtriglycerid. B) Monocyt gripas och en delmängd av pro-inflammatoriska donatorer upphävdes i närvaro av en VCAM-1-blockerande antikropp. Signifikans bestämdes genom parat Students t-test, medelvärden ± SEM från 3-5 oberoende experiment. Anpassad med tillstånd från Wang et al. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
