Summary
Elektrospinning iskelelerinin doku mühendisliği uygulamaları için post prodüksiyon işlenebilir. Burada kısırlık (aseptik üretim veya sterilizasyon post prodüksiyon) ulaşmak için ve uygun biyomekanik özellikleri elde etmek için, daha kalın iskeleleri (çoklu katman ısı kullanarak veya buhar tavlama ile) yapmak için, karmaşık iskeleleri (ardışık eğirme) eğirme yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Elektroeğirme 3D doku mühendisliği iskeleleri (genellikle biyolojik) üretmek için yaygın olarak kullanılan ve çok yönlü bir yöntemdir. 1, 2, in vivo 3 Birçok doku, cilt, mesane, pelvik taban ve hatta çocuklar gibi sert damak gibi uzantılar değişen eksenli distansiyon tabi büyür. Bu amaçlar için iskelesi üretiminde uygun biyomekanik özelliklerinin geliştirilmesi iskelesi (hücreleri olmadan veya ile elde edilen) ve klinik kullanım için steril olan için bir ihtiyaç vardır. Burada kalınlığı, mekanik özellikleri ve sterilizasyon (gerekli - Bu çalışmanın odak noktası, temel elektrospinning parametreleri (elektrospinning üzerine geniş bir literatür var gibi) kurmak ama onları doku mühendisliği amaçları için uygun hale getirmek için ip iskeleleri post prodüksiyon değiştirme konusunda nasıl değildir klinik kullanımı) olarak kabul edilir ve biz de hücrelerin, iskelet kültüre ve özel uygulamalar için durum onlara eksenli zorlamalara maruz nasıl tarif edilir.
Elektroeğirme ince levha üretmek eğilimindedir; elektrospinning kollektör lifleri yalıtım ile kaplanmış olur böyle kötü bir iletken hale gelir üzerinde lifleri artık mevduat söyledi. Dolayısıyla biz ısı ya da buhar ille elastikiyeti iskelelerinin gücü artan tavlama ama tarafından kalın yapılar üretmek için yaklaşımlar açıklanmaktadır. Kompleks iskelesi elde etmek için farklı bir polimer iskelelerinin sıralı iplik de tarif edilmektedir. Sterilizasyon yöntemleri olumsuz gücü ve iskelelerinin elastikiyeti etkileyebilir. Biz poli laktik-ko-glikolik asit (PLGA) ve elektrospinning İskeleler üzerinde biyomekanik özellikleri üzerine etkileri için üç yöntem karşılaştırın.
Iskeleleri ve iskelelerde hücreleri tarafından hücre dışı matriks (ECM) proteinlerinin üretim değerlendirmesine hücrelerinin Görüntüleme açıklanmıştır. In vitro iskelelerde hücreleri kültür iskele kuvvet ve esneklik ancak doku mühendisliği literatu artırabiliryeniden hücrelerinin çoğu zaman durağan koşullarında yetiştirilen olduğunda uygun bir ECM üretir başarısız olduğu gösterilmiştir. Birkaç ticari sistemler dinamik klima rejimler altında İskeleler üzerinde kültür hücreleri için bir olanak olduğunu kullanılabilir vardır -. Bir örnek bir medya içinde dolu haznesi mekanik kollar kullanılarak yapılan iskeleler hücreleri üzerinde bir kondisyon programı uygulamak için kullanılabilir Bose Electroforce 3100 ise 4 2 boyutta kontrollü bozulma için bir bütçe hücre kültürü biyoreaktör bir yaklaşım açıklanmıştır. Biz hücreleri bu koşullar altında elastin üretimine bağlı olduğunu göstermektedir. Son olarak hücreleri olan veya olmayan kültüre işlenmiş iskelelerinin biyomekanik özelliklerinin değerlendirilmesinde tarif edilmektedir.
Protocol
1. Rastgele ve Bağlantısızlar Liflerin elektrospinning
Elektroeğirme topraklı bir koleksiyoncu doğru bir polimer çözeltisine çekmek için elektrik potansiyeli kullanarak ince fiber ağları oluşturur. Toplayıcıları çok çeşitli şekillerde olabilir ve statik bir ya da daha genel olarak, dönen olabilir. Çözüm önce solvent buharlaşarak kollektör ve geldiğinde jet bir lif haline katılaşır.
Her bir polimer lif verilen bir türü üretmek için koşullar kendi ayarlamak gerekir. Polimer, konsantrasyonunu solvent, pompalanan çözeltisi ve topraklı toplayıcısı, ikisi arasındaki potansiyel farkı arasındaki mesafe, döner toplayıcısı, akış hızı, sıcaklık ve nem hızının her elektro etkileyecektir. Birçok parametre elektrospinning seçimi açıklayan çalışmaları ve nasıl üretilir iskeleleri (örneğin elyaf çapı, morfolojisi ve yönlendirme) bu etki. 5, 6, 7, 8 vardırBu deneylerde iskelesi önceki çalışmalarda seçilen koşullara göre bükülmüş edildi. 2, 9
Aşağıdaki yöntem Şekil 1 'de gösterildiği gibi, döner bir toplayıcı kullanılarak PLGA, poli laktik asit (PLA), poli-ε kaprolakton (PCL) ve poli-ko-hidroksibutirat hydroxyvalerate (PHBV) den elektrospinning iskelelerinin üretimi için uygundur. Çözücü madde diklorometan içinde (DCM) kullanılır. Burada yöntem mikro ölçekli boncuklar ('inci kolye' morfoloji) ile microfibrous PLGA, PLA ve PCL ve nanofibröz PHBV iskele üretir.
- Coat dışa bakacak şekilde parlak / cilalı yüzü alüminyum folyo ile malafa kollektör döner. Bizim mili 20 cm genişliğinde idi ve çapı 10 cm.
- Polimer çözeltilerinin hazırlamak; PLA, PCL ve PHBV DCM içinde ağırlıkça% 10 çözelti olarak meydana gelir. PLGA DCM içinde ağırlıkça% 20 çözelti olarak oluşur.
- Bir şırınga pompası 5 ml hacmi Place 4 şırınga. Şırınga c yüklenmektedirtoplam 20 ml veren polimerin her biri 5 ml ontain.
- PLA için, PCL ve PHBV şırınga başına 40 μLmin -1 akış hızı kullanın.
- PLGA, şırınga başına 30 μLmin -1 akış hızı kullanın.
- PLA için, PCL ve PLGA iğne ucu şafta 17 cm çalışma mesafesi kullanın.
- PHBV için şafta iğne ucu 10 cm çalışma mesafesi kullanın.
- Alüminyum folyo kaplı mili üzerine uygun mesafeden 17.000 V (73.030 P, Genvolt, Shropshire, Birleşik Krallık) ve electrospin için şırınga iğneleri şarj edin.
- Rastgele lifler 200 rpm mili döndürmek için.
- Hizalanmış lifler için 1000 devirde mandreli döndürün.
- Iskelelerinin kuru koşullar altında alüminyum folyo üzerinde saklanır. Tavsiye edilen depolama kurutucu madde varlığında, 4 ° C'de ağzı kapalı bir kap içinde olduğunu. Deneyimlerimize iskeleleri (biz herhangi bir pu farkında değildir bu şartlar altında en az 4 ay (muhtemelen çok uzun) için stabilKalıplar için uzun süreli saklama koşulları) üzerinde blished çalışmalar.
2. Sıralı İplik tarafından Kompleksi iskelelerinin üretimi
Ardışık dönen iki özellikleri iyi olan bir madde oluşturmak için farklı bir malzemenin özelliklerinin birleştirilmesi için bir yöntem sağlar. PLA veya PCL iplik düşük yoğunluklu elastik yaprak üretir, oysa PHBV düz, yoğun, kırılgan sac üretmektedir. Her iki madde de hücre ek destekler. Ardışık elastiktir yoğun bir hücre geçirmez membran bu materyallerin sonuçları dönüyor.
- PHBV iplik koşulları, Bölüm 1 'e göre elektrospinning teçhizat ayarlayın.
- Yukarıdaki gibi Electrospin PHBV.
- Bu polimer (örneğin 17 cm iğne için davul, 17000 V, PLA için 200 rpm) için parametreleri ve normal şartlarda kullanarak electrospin, ikinci bir polimer üstü alüminyum folyo değiştirmeden. Bu katkı süreci bir çift-katlı üreten iskele bir çift katman oluşturur.
3. Birlikte birçok Katmanlar Tav tarafından katmanlı iskelelerinin üretimi
- Iskelelerinin tavlama ısı kullanılarak çok katmanlı edilebilir. PLGA bu 4 yaprak üst üste yerleştirilir yapmak için ve daha sonra 3 saat 60 ° C'de tavlanır ısıya.
- Iskelelerinin de buhar tavlama tarafından tavlanır edilebilir. PLGA burada 4 adet üst üste yerleştirilmiş ve 1 saat için DCM bir havuz yukarıda 2 cm (10 mi) süspansiyon haline getirilmiştir. Bu, oda sıcaklığında, ağzı kapalı bir kap içinde gerçekleştirilir.
4. Elektrospinning iskelelerinin Aseptik Üretim ve Postprodüksiyon Sterilizasyon
- Aseptik iskele üretim temiz oda ortamı içinde bir laminer akış kaput bir aseptik ortamda elektrospinning elde edilebilir. Tıbbi cinste ya DCM inkübasyon ile sterilize polimerlerin bu da steril bir polimer de kullanılabilir yapmak. Bir kez çözülmüş, polimerler gibi sarılı steril bir folyo üzerine elektrospinning edilirmandrel terilised. İskelelerin sonra aseptik işlenir. Sterilite uygun bir süre için antibiyotik içermeyen büyüme ortamında iskele örnekleri kuluçkaya tarafından doğrulanır.
- Etanol dezenfeksiyon için (bu deneysel olarak kullanım olup, ancak kliniğe alınabilir sterilizasyon bilinen bir yöntem değildir) iskelesi distile su içinde etanol% 70 v / v çözelti içinde (15 dakika) kısa bir süre için yerleştirilmektedir. Pratik amaçlara yönelik bu deney, genellikle daha sonra kültürlenmiş hücrelerde ile başarılı bir şekilde kombine edilebilir ve böylece iskelesi dezenfekte etmek için yeterli olur.
- Selim ark açıklandığı gibi perasetik asit sterilizasyon Kalıplar için perasetik asit batırılır (% 0.1 v / v fosfat (PBS) tamponlu tuz) ve oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edildi. 9
- Gamma için sterilizasyon iskelesi Selim ark açıklandığı gibi, bir sezyum kaynağı kullanılarak 3 kGy bir doz ışınlandı edilir. 9
5.. Iskelelerinin Biyomekanik Test
- İskelelerin dikdörtgenler halinde kesilir 5 mm bir mikrometre kullanarak kalınlığı ölçülerek ve Bose Electroforce 3100 alet içine yerleştirilmiştir x 20 mm. Bu makine, 6mm ve araziler bir stres / zorlanma eğrisi olarak yük vs yerinden bir deplasman için 0-22 N'luk bir kuvvet kadar geçerlidir. Bu en Young modulus ve elastiklik sağlayan hesaplanabilir.
6. İskelelerin Hücreler Visualising ve ECM Üretim Değerlendirilmesi
Hücreler tek onlar takmak gibi, iskelelerde hücreleri görmek göç ve çoğalmalarına izin hayati floresan boya ile boyanmış olabilir. Mesaj kültürü iskelelerde hücreleri varlığında 4 ',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) ile hücre çekirdeklerinin boyama ile tespit edilebilir. İskele üzerindeki hücreler tarafından ECM üretimi, bu örnekte görüldüğü gibi elastin gibi ESM proteinleri bir dizi için hücreler boyanarak değerlendirilebilir. Kullanılan tüm iskelesi a sahip ölçüldü1,5 cm x 1,5 cm önce ekim için meydanlara en az 0.2 mm kesme kalınlığı.
Bu çalışmalarda insan dermal fibroblastlar çünkü bizim laboratuvarın esas ilgi alanı olan yumuşak doku rekonstrüksiyonu oynadığı rolü boyunca kullanılır.
Hücreler meme küçültme veya abdominoplasti (rıza araştırma amaçlı kullanılmak üzere kendi dokusu için verildi) için elektif cerrahi uygulanan hastalardan alınan deri örnekleri elde edilmektedir. Dokular toplanan ve Araştırma Doku Bankası Lisansı 12.179 altında anonim olarak kullanılmaktadır. Dokular PBS içeren streptomisin (0.1 mg / ml) ve penisilin (100 IU / ml) ve amfoterisin B (0.5 ug / ml) ile yıkanır. Doku örnekleri% 0.1 w / v tripsin ve PBS içinde% 0.1 glikoz (12-18 saat, 4 ° C) inkübe edilir. Dermis, soyulmuş ince kıyılmış ve kolajenaz 10 ml (% 0.5 w / v DMEM içinde ve% 10 FCS, 37 ° C'de 18 saat boyunca) ile inkübe edilir. Ortaya çıkan süspansiyon hücre santrifüjiyonu (10 dakika için 400 g), fetüs buzağı serumu (FCS,% 10 v / v), streptomisin (0.1 mg / ml), penisilin (100 IU / ile desteklenmiş DMEM içinde kültürlendi ve pasajlandı edilebilir bir hücre peleti üretir ml) ve amfoterisin B (0.5 ug / ml). Pasaj 4-9 sadece fibroblastlar deneylerde kullanılır.
- (EasyFlask, Nunc, New York, ABD) bir T75 kez konfluent insan dermal fibroblastlar, 5 dakika inkübe, tripsin / EDTA (5 ml, 5 mg / ml tripsin, 2 mg / ml tuzlu su içinde EDTA) ekleyerek tohumlanmıştır 37 ° C. Süspansiyon 10 dakika (150 g) santrifüje tabi tutulur. Hücreler, DMEM 5 ml (FCS (% 10 v / v), streptomisin (0.1 mg / ml), penisilin (100 IU / ml) ve amfoterisin B (0.5 ug / ml) ile desteklenmiş) içinde tekrar süspanse edilir ve bir kullanılarak hesaplanır haemocytometer ve konsantrasyonu ekimi için ayarlanır. Hücreler normalde iyi başına 50.000 hücrelerinde tohumlanmıştır.
- Gerekirse önce iskele üzerinde hücre tohumlama için, hücreleri kırmızı veya yeşil CellTracker kullanarak önceden etiketlenmiş olabilir. Hücres 3 x 5 ml PBS ile yıkanır. Serum içermeyen, 37 (10 ml), orta-hücresi uygun ilave edilir ve hücreleri 45 dakika süreyle inkübe edilir ° C'de 10 mM CellTracker içindeki bir çözeltisi, İnkübasyondan sonra, hücreler, iskelet yapılar üzerinde tohumlanmıştır 3 x 5 ml PBS içinde aşağıdaki yıkanır. 620 nm λem (CellTracker kırmızı) ve 480 nm λex - - 533 nm λem (CellTracker yeşil) Bu iskelelerinin yüzeyi 570 nm λex bir Axon ImageExpress mikroskobu (Molecular Devices, Sunnyvale, ABD) bir yansıma olabilir ardından. Derin iskelesi içine bir multiphoton konfokal mikroskop kullanılabilir hücrelerinin penetrasyon incelemek. Bu hücreler olan veya olmayan en iskeleleri içine 200 mikron penetrasyon etrafında elde edebilirsiniz.
- Mesaj kültürü örnekleri 20 dakika boyunca 37 ° C'de 1 ml PBS içinde% 3.7 formalin içinde sabitlenmiştir ve daha sonra 3 x 1 ml PBS ile yıkanır.
- Elastin Primer antikor 200 uL her bir örnek için eklendi (% 5 v / v PBS içinde, tavşan anti-insan alfa Elas edilirkalay, AbDserotec, Kidlington, Birleşik Krallık) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edildi.
- Örnekleri 3 x 1 ml PBS ile yıkandı ve sonra sekonder antikor çözeltisi (% 0.5 v / v keçi anti-tavşan IgG (FS): FITC) içinde kuluçkalanır 30 dakika süreyle PBS içeren DAPI (1 ug / ml) içinde.
- Bunu müteakiben numunelerin 3 x 1 ml PBS ile yıkanır.
- DAPI ve 480 nm λex için 460 nm λem - - sekonder antikor için 533 nm λem DAPI ve sekonder antikor vitray örnekleri daha sonra bir Axon ImageExpress floresan mikroskop, 365 nm λex üzerinde görüntülenmesi işlemidir. DAPI lekeler çekirdek ve bir çok kolaylıkla liflerin içinde hücrelerinin dağılımını görmesine olanak tanır.
7. İki eksenli Dinamik Klima için İskelesi üzerinde tabi Hücreleri
Fibroblast ECM üretim dinamik klima etkisini incelemek için bu keşfetmek için basit bir proof-of-concept biyoreaktör geliştirdi.
- Balon ve akış birleştirinbu kaplı bir kez düzenlenmesi cihazları ve sistemi hazırlamak öyle kolay hücre kültürü için uygun steril bir kap içine yerleştirilir.
- Balon (1 saat boyunca 122 ° C'de, 220 mbar) dahil olmak üzere aparat otoklava. Biz balonlar olumsuz şişirilmesi ve defalarca deflate kendi fonksiyonunu etkilemeden otoklav yaşamlarını sürdürdüklerini doğrulayabilirim.
- Temiz bir odada, üzerine elektrospinning olmak pozisyonda bir laminer akış kaputu cihazı açmaktır.
- Fosfat tamponlu tuz ile gerekli yüzey alanı (balon hala kültür kabına sığdırmak için ihtiyacı hatırlamak) için balonu şişirmek ve steril olması gerekmez aygıtı içinde bir noktada bir elektrik toprağa PBS bağlamak (şube boru üzerinde musluk 3-yollu).
- Normal iplik koşulları kullanılarak balon üzerine Electrospin istenilen polimerin, 10 cm'lik bir mesafe ile çalışan. İskele 1 saat kurumasını bekleyin. 'Islak' lifleri sörf yapışmak için yeterince 'yapışkan' vardırsonradan sökmeden balon As.
- Steril bir damara balon yerleştirin ve hücre kültürüne uygun bir laminer akış kaput nakleder.
- Steril bir yüzeye gemi ve yeri (Petri) gelen balon çıkarın ve tekrar tekrar (her 20 saniye) dağıtmak girişimi için 20 dakika kaplı balon üzerine bir hücre süspansiyonu (DMEM 5 ml 1 x 10 6 hücre) Pipeti yüzeyi üzerinde eşit biçimde hücreler.
- Kültür kabına balon yerleştirin ve önceden ısıtılmış medya hücre tipine uygun ekleyin.
- Bir şırınga pompası (Kent Bilimsel, Genie Plus, Connecticut, ABD) enflasyon aparat takın ve çift eksenli distansiyonu vermek gerektiği gibi balon deflate / şişirmek. Bir bilgisayar kontrollü bir şırınga pompası, daha karmaşık bir şişkinlik rejimi elde etmek için kullanılabilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
Aşağıdaki şekillerde beklenebilir temsil sonuçlarıYukarıdaki yöntem takip eğer.
Elektrospinning rastgele ve sıralı mimariler (Şekil 1) ile iskelesi oluşturmak için kullanılabilir, bu tekrarlanabilir ve liflerin aynıdır. Polimerler birçok çeşit ölçüde olarak PHBV, PLA veya PCL için Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı olabilir özelliklere sahip elektrospinning edilebilir. Elektroeğirme hafif kabarık iskeleleri veya yoğun hücre zarları aşılmaz (bkz. Şekil 3) üretebilir. Burada gösterilen bütün iskeleleri hücre eki ve çoğalmasını kolaylaştırdı. Önceki iş hücreleri kadar en az 500-600 mikron derinliğe kadar bu iskeleleri doğru göç edebildiğini göstermiştir PLA için 9 ortalama elyaf çapı 3 mikron olan;. PHBV için 5-20 mikron arasında değişen inci 0.3μm olduğunu; için PCL bu 3 mikron olması ve PLGA için 11 mikron olduğunu. Diğer çözücü sistemleri kullanan diğer çalışmalar PHBV boncuk veya polimer inci olmadan lifler gibi elektrospinning olabileceğini bildirmektedir. 10,11
<p class = "jove_content"> kalın iskeleleri buharı gereklidir ve tav ısı (bkz. Şekil 4) birlikte iskelelerinin katmanları tavlama için istihdam edilebiliyorsa. Bu iskele katmanları tabakalara ayırmak yoktur ve bu katmanların birleşme noktaları bulmak çok zor olabilir.Bu hücreler A ve B'nin her biri Şekil 5 'de gösterildiği gibi karıştırmayı olmadan, ayrı bir zar üzerinde kültive edilebilir burada iki tabakalı membran yapılabilir olduğunu göstermektedir. Burada iki farklı floresan hücre izci boyalarla renklendirilen insan dermal fibroblastlar kullanarak bunu göstermektedir. Bu tür hücre kültürü damak onarım veya periodontal rekonstrüktif gibi diğer tarafında bir yumuşak oluşturmak üzere tasarlanan hücrelerinden ayrılan bir tarafında örneğin kemik ya da kıkırdak olarak sert bir doku (ve genellikle daha hızlı büyüyen) doku oluşturmak üzere, bu tür bir çift-katlı membran yararlı olacaktır cerrahi. 12, 13
Elektrospinning üzerinde sterilizasyon etkisi ile ilgili olarak biz var iskeleleriDaha önce iskelesi ve müteakip hücre kültürü üzerinde sterilizasyon etkilerin yöntemi. 9 Bu elyaf çapı ve nihai gerilme mukavemeti ve bir PLGA iskele Young modulus üzerine perasetik asit, gama irradyasyonu ve etanol etkiler gösteren Şekil 6 'da gösterildiği olduğu bildirilmiştir .
Perasetik asit ve yaklaşık% 50 etanol ile elyaf çapını azaltmak ise gamma ışını elyaf çapı üzerinde anlamlı bir etkisi vardır. Nihai çekme mukavemeti ile ilgili olarak sterilizasyon yöntemlerin her nihai çekme kuvveti ve iskelelerinin elastikiyeti değiştirildi. Bu iskelelerde hücrelerin Kültür fazla kopma stresi azalttığını, ancak elastikiyet arttı.
Son olarak, elektrospinning iskelesi üzerinde kültive hücreleri üzerindeki şişkinlik dinamik bir çift eksenli etkisini test etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu proof-of-concept yaklaşım hücreleri dinamik boyunca canlı kaldığını göstermektedirşişkinlik değil, aynı zamanda, bu şartlar altında elastin artan miktarlarda üretirler. Bu, aynı içerine aynı hücreleri (bakınız Şekil 7) statik koşullar altında muhafaza edilir elastin eksikliği belirgin çelişmektedir.
Şekil 1. Bir elektro kulesi ve birbirinin üzerine yerleştirilir liflerin rastgele ve paralel lif ve daha sonra tabakalar dönen bir çizgi gösterir. Dikey lifler, alüminyum folyo üzerinde hizalanmış fiberler, bir dizi elektro 90 tarafından döner folyo ° ve hemen ardından bu üst üste hizalanmış liflerinin bir ikinci dizi elektro tarafından oluşturulabilir.
Şekil 2. (A) PLA (ölçek çubuğu 100 mm olan), (B) PHBV (ölçek çubuğu 100 mm olan), (C) PCL (ölçek çubuğu rastgele elektrospinning paspaslar morfolojisi gösterir 100 mikron) ve (D) PLGA (scale bar) 200 mikron olduğunu. PLA, PCL ve PLGA tüm microfibrous tekdüze iskelesi olduğunu unutmayın. PHBV 5-20 mikron boyutlu boncuk bağlayan nanofiberleri bir 'inci kolye' olarak döndürülür. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. Çok katmanlı iskele üretimi. Burada iskeleler başlangıçta PHBV ve sonra PLA veya PCL dolu şırınga kullanılarak döndü edilir. Bu PHBV iskele üstünde döndü edilir. Şekil yoğun nanofibröz gösteren bu çok katmanlı iskelelerinin görünüm, (A) Tek PHBV katman, bir PHBV-PLA iki katmanlı (B) bir kesit gösterir, 'inci kolye' PHBV tabakası (solda) ve daha açık microfibrous PLA katman (sağda) ve (C) tek bir PLA tabaka.nk "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Kalın iskelesi ısı tavlama ve buhar tavlama ile elde edilebilir. (A) ve (B) Yaklaşık 150 mikron arasında ilk lifli iskelesi araya yerleştirilmiş ve diklorometan buharı 500 um kadar daha kalın iskelesi yapmak için kullanılan bir buhar tavlanmış PLA iskelesi yoluyla bir kesitini göstermektedir. In (C) ve (D), bir iskelet araya ince liflerin ve kalın tabakalar tavlama ısı tarafından oluşturulan ince liflerin tabakalar interspersed daha kalın liflerin katmandan oluşur görebiliriz. Bu yaklaşım, karmaşık mekanik özellikleri iskeleleri üretmek için kullanılabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Fi figure 5. bir çift-katlı iskele üzerinde hücre görünmesi. Her durumda, insan hücreleri mevcut dermal fibroblastlar vardır. (A) hücreleri DAPI ile tespit edilmiş ve lekeli elektrospinning PLA üzerine fibroblastlar. PHBV (B) DAPI boyanan hücreler. (C) fibroblastlar hayati bir boya, CellTracker yeşil öncesi lekeli vardır ve iki tabakalı bir PLA tarafında bunların görünümünü görebilirsiniz. (D) bir üst PLA yüzeyinde düşük PHBV yüzeyi ve yeşil lekeli fibroblastlan üzerinde kırmızısı ile boyanmış fibroblastlar ile iki tabaka boyunca alınan bir kesittir. (E) ön lekeli CellTracker kırmızı Fibroblastlar PHBV yüzey üzerinde büyüdü. Hayati floresan boyaların kullanımı hücreleri hala büyümekte olduğu iskele üzerindeki hücrelerin dağılımına bakıldığında için uygun bir metodoloji sağlamaktadır. Bir rutin olarak, en az 7 gün süre ile bu boyaların kullanabilir. Hücreleri bölme Ancak boya seyrelmiş olur. Ölçek çubukları 0,1 mm eşittir.g6.jpg "alt =" Şekil 6 "/>
Şekil 6. Elektrospinning iskele biyomekanik özellikleri bir Bose Electroforce tansiyometre cihazı (A) elde edilir. PLGA (B) Stres / gerilme eğrisi gamma radyasyonu, alkol, perasetik asit, ya da aseptik olarak üretilen ile sterilize iskeleleri. Nihai gerilme yükü (UTS) o, nihai çekme ve gerilme en Young modulus kırılır önce fiber tabi edilebilir: üç ölçümler gibi bir grafiktir elde edilebilir. Ikinci iskele elastikiyetinin bir göstergesidir. (C) içerisinde mikron PLGA elyaf çapı her bir sterilizasyon yöntemi etkisi. Her sterilizasyon yöntemi UTS azalmıştır. Perasetik asit ve gama radyasyon Her ikisi de daha elastik iskele veren en Young modülü azaltmak, alkol iskele özellikle kırılgan yapar. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .Şekil 7. Bu şekil iskelesi (ve iskelesi içinde büyüyen hücreler) zaman süreleri için çift eksenli şişkinlik tabi tutulabilir olduğu bir çift eksenli biyoreaktör sağlamak için basit bir balon kullanımını gösterir. (A) sönük balon elektrospinning lifler, PHBV, tevdi edildiği üzerine. Bu aşamada, balon kısmen lifleri ile kaplıdır. (B) bir balon tam PHBV ve PLA lifler ile kaplı. (C) hücre süspansiyonu sürekli balon üzerine pipet. (D) balon bir şırınga pompası ve PBS (iletken bir elektrolit olarak kullanılmıştır) bağlı olan steril ortam, bir şişe içinde yerleştirilen bir balon yavaşça şişirilmesi ve programlanmış bir zamanlama karşı balon söndürme izin vermek için kullanılır. (E) 'de gösterildiği hücre canlılığı için üstlenilen deney ve analiz sonunda balon kaldırılıyor iskelelerde Hücreleri (F) canlı hücreler koyu mavi renk geliştirmek nerede metabolik ind kullanarakicator 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromür. (G) statik şartlarında kültüre özdeş bir iskele (H) Aynı hücreler önemsiz elastin üretimini sahipken hücreler (mavi), bu balon ve çift eksenli distansiyonu tabi elastin lifleri (yeşil, elastin spesifik antikorlar kullanılarak boyanmış) geliştirmek kültüre olduğunu gösterir . Ölçek barlar 0.025 mm eşittir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroeğirme doku mühendisliği iskeleleri üretimi için çok popüler bir tekniktir. 14, 15, 16 bu tekniği de karmaşık ve çok değişkenli çok yönlü olduğunu deneysel kullanımı için temel elektrospinning iskeleleri üretmek için nispeten basit olsa. 6 nasıl açıklayan birçok çalışma vardır parametreleri belirlemek elektrospinning iskele üretti. Bu çalışmada odak uygun mimari ve mekanik özellikleri iskele yapmak ve bunların içindeki hücreler adam implantasyon için doku uyum sağlamak için hücre dışı proteinler yapmaya teşvik etmek için önemli zorluklar post prodüksiyon üzerinde.
Bu makalede amacımız amaçlı geniş bir yelpazesi için iskeleler tasarlamak ve karakterize etmek okuyucuları donatmak yöntemleri tanımlamaktır. Bu yazıda, karmaşık ve kalın iskele yapmak ve deneysel ve klinik kullanım için iskeleler sterilize etme yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca görüntüleme c tarifİskeleler ve çift eksenli distansiyonu hücreleri tabi tutarak elastin lif üretim indüksiyon arşın.
Iskelelerinin istenen özellikleri birçok sonrası üretimi (örneğin birkaç tabakadan tavlama gibi) ve sterilizasyon elde edilebilir. Ancak bu sırayla iskelelerinin mekanik özelliklerini etkiler. Biz, sterilizasyon yöntemleri, tüm değişen derecelerde nihai çekme mukavemeti ve Young modülü değiştirme eğiliminde olduğunu bildirmiştir. Grubumuzun yeni bir çalışma PLGA iskeleleri için potansiyel Sterilizasyon rejimler olarak etkilerinin gama radyasyon, perasetik asit ve etanol göre sterilizasyon teknikleri 9 yan etkileri aseptik koşullarda iskelelerinin üretimi önlenebilir -. Ikinci bir temiz oda kullanımını gerektirir . Farklı kullanıcılar farklı yöntemler seçebilirsiniz ancak mevcut tüm sterilizasyon yöntemleri iskelelerinin özellikleri üzerinde olumsuz etkileyeceğini bilmelisiniz.
C İskeleler üzerinde hücrelerin ulture de iskeleleri 'mekanik özellikleri etkiler. Çift eksenli şişkinlik üzere iskelelerde hücreleri tabi tutarak ECM üretimi indüksiyonu mekanik özelliklerini etkiler için kullanılabilir.
Bir iki tabakalı membran yapmak için başka bir yere bir iskele iplik metodolojisi kolay anlaşılır ve biz iki hayati hücre izci boyalarla ön-etiketleme hücreleri tarafından bu yazıda gösterilen hücreler iki farklı kesimlerinden destekleyen iki tabakalı iskeleleri tarif edilir. Bu iki tabakalı membran belirtilen amacına elde olduğu göstermek için kullanılmıştır.
Son olarak bu çalışmada açıklanan bütçe eksenli distansiyon teçhizat rejimlerin bir dizi sunmak için kullanılabilir. Halkalı, lineer ve rastgele rejimleri kolaylıkla programlanabilir ve uygulanabilir. Bu çok yönlülük sistem, yarık damak, pelvik taban, mesane ve deri, doku mühendisliğinde karşılaşılan sorunların birçoğu için kullanılmak üzere izin verir.
"> Doku mühendisliği literatüründe iskelelerde hücreleri kültür için tek eksenli test sistemlerinin kullanımı bildirilmiştir. 4. Ancak biz yumuşak doku şişliği eksenli nasıl tepki ile ilgili herhangi bir yayınlanan edebiyat bulamadık. Bu basit yaklaşım hücreleri yanıt olduğunu gösteriyor elastin üretimi ile çift eksenli gerginlik -. yumuşak dokuların elastik recoil verir hücre dışı matriks önemli bir bileşeni Bu alanlar için implantasyonu için uygun dokular üretmek için bir yol sunar bunlar laboratuvarda büyüdükçe nasıl klima yumuşak dokuların net bilgi verir doğal dokular içsel esneklik var. vücut bu daha da geliştirilmesi açıkça doku mühendisliği toplum ve biyoreaktör üreticileri tarafından merited edilecek bir alandır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Sayın Frazer Bye için bir doktora için fon BBSRC teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
