Summary
Electrospun scaffolds के ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पोस्ट उत्पादन संसाधित किया जा सकता है. यहाँ हम जटिल scaffolds के लगातार कताई द्वारा मोटा scaffolds के बहु layering के गर्मी का उपयोग कर या वाष्प annealing के बाँझपन (सड़न रोकनेवाला उत्पादन या नसबंदी के बाद उत्पादन) को प्राप्त करने के लिए और उपयुक्त biomechanical गुणों को प्राप्त करने के लिए, बनाने के लिए, कताई के लिए तरीकों का वर्णन.
Protocol
1. रैंडम और निरपेक्ष रेशे की electrospinning
Electrospinning बिजली क्षमता का उपयोग करने के लिए एक भूसम्पर्कित कलेक्टर की ओर एक बहुलक समाधान आकर्षित द्वारा ठीक रेशेदार नेटवर्क बनाता है. कलेक्टरों बहुत कई आकार में हो और स्थिर या, और अधिक सामान्यतः घूर्णन, हो सकता है. समाधान से पहले विलायक evaporates कलेक्टर पर आता है और जेट एक फाइबर में solidifies में.
प्रत्येक बहुलक फाइबर का एक प्रकार का उत्पादन इसकी शर्तों का अपने स्वयं के सेट करने की आवश्यकता है. विलायक बहुलक, एकाग्रता, पंप समाधान और भूसम्पर्कित कलेक्टर, दोनों के बीच संभावित अंतर के बीच की दूरी, घूर्णन कलेक्टर, प्रवाह दर, तापमान और नमी के वेग सभी electrospinning को प्रभावित करेगा. वहाँ कई मापदंडों electrospinning की चयन का वर्णन अध्ययन और उत्पादन scaffolds के (जैसे फाइबर व्यास, आकृति विज्ञान, और अभिविन्यास) पर कैसे इन प्रभाव 5., 6, 7, 8इन प्रयोगों में scaffolds के हमारे पिछले अध्ययनों में चयनित शर्तों के आधार पर काता गया 9 2,.
निम्नलिखित तरीकों PLGA, पाली लैक्टिक एसिड (पीएलए), पाली (PCL) ε caprolactone और पाली hydroxybutyrate सह hydroxyvalerate (PHBV) से electrospun scaffolds के उत्पादन का उपयोग एक घूर्णन कलेक्टर के रूप में चित्र 1 में दिखाया के लिए उपयुक्त हैं. विलायक dichloromethane के दौरान प्रयोग किया जाता है (डीसीएम). यहाँ विधि सूक्ष्म आकार मोती (मोती का हार 'आकारिकी) के साथ microfibrous PLGA, पीएलए और PCL और nanofibrous PHBV पाड़ के उत्पादन करता है.
- कोट / पॉलिश चमकदार बाहर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ खराद का धुरा कलेक्टर, घूर्णन. हमारी खराद का धुरा 20 सेमी चौड़ा था, और व्यास में 10 सेमी.
- बहुलक समाधान तैयार पीएलए PCL, और PHBV एक डीसीएम 10 wt% समाधान के रूप में बना रहे हैं. PLGA एक डीसीएम 20 wt% समाधान के रूप में किया जाता है.
- एक सिरिंज पंप पर 5 मिलीलीटर मात्रा की जगह 4 सीरिंज. सीरिंज ग के लिए लोड कर रहे हैंबहुलक प्रत्येक के 5 मिलीलीटर ontain, कुल में 20 मिली दे रही है.
- पीएलए के लिए, PCL और PHBV 40 -1 μLmin की एक सिरिंज प्रति प्रवाह की दर का उपयोग करें.
- PLGA के लिए सिरिंज प्रति 30 μLmin -1 का एक प्रवाह की दर का उपयोग करें.
- पीएलए के लिए, PCL और PLGA सुई की नोक से खराद का धुरा के लिए 17 सेमी की दूरी एक काम का उपयोग करें.
- PHBV के लिए खराद का धुरा के लिए सुई टिप से 10 सेमी की दूरी एक काम का उपयोग करें.
- सत्रह हज़ार (पी ७३,०३०, Genvolt, Shropshire, ब्रिटेन) वी और electrospin के लिए एल्यूमीनियम पन्नी लेपित खराद का धुरा पर उचित दूरी से सिरिंज सुई चार्ज करते हैं.
- के लिए यादृच्छिक फाइबर 200 rpm पर खराद का धुरा बारी बारी से.
- गठबंधन फाइबर के लिए 1000 rpm पर खराद का धुरा घुमाएगी.
- Scaffolds सूखे की स्थिति के तहत एल्यूमीनियम पन्नी पर संग्रहीत किया जा सकता है. की सिफारिश की भंडारण अवशोषक की उपस्थिति में एक डिग्री सेल्सियस 4 में एक मोहरबंद कंटेनर में है. हमारे अनुभव में scaffolds के कम से कम 4 महीने (संभवतः बहुत लंबे समय तक) के लिए स्थिर (हम किसी भी पु के बारे में पता नहीं कर रहे हैं इन परिस्थितियों में रहनाscaffolds के लिए लंबी अवधि के भंडारण की स्थिति) पर एस्टा अध्ययन.
2. परिसर scaffolds के अनुक्रमिक स्पिनिंग द्वारा उत्पादन
अनुक्रमिक कताई विभिन्न सामग्रियों के गुणों के संयोजन के लिए एक सामग्री है कि दोनों का सबसे अच्छा गुण है बनाने का एक तरीका प्रदान करता है. PHBV एक फ्लैट, घने, भंगुर चादर उत्पादन जबकि पीएलए या PCL कताई कम घनत्व लोचदार चादरें. दोनों सामग्री सेल लगाव का समर्थन करते हैं. लगातार एक घने सेल अभेद्य कि लोचदार है झिल्ली में इन सामग्री के परिणाम कताई.
- धारा 1 के अनुसार electrospinning रिग सेट PHBV कताई शर्तों के साथ.
- Electrospin PHBV ऊपर के रूप में.
- एल्यूमीनियम पन्नी बदल electrospin कि बहुलक (जैसे 17 सेमी सुई के लिए ड्रम, 17,000 वी, पीएलए के लिए 200 rpm) के लिए एक दूसरे पर टॉप बहुलक मापदंडों और सामान्य परिस्थितियों का उपयोग कर के बिना. इस additive प्रक्रिया पाड़ के एक डबल परत एक bilayer उत्पादन बनाता है.
3. Multilayered scaffolds की कई परतें एक साथ एनीलिंग द्वारा उत्पादन
- Scaffolds annealing के गर्मी के उपयोग के माध्यम से multilayered जा सकता है. के PLGA की इस 4 चादरें एक दूसरे के शीर्ष पर रखा और फिर गर्मी के 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर annealed.
- Scaffolds भी वाष्प annealing के द्वारा annealed किया जा सकता है. PLGA के यहाँ 4 चादरें एक दूसरे के शीर्ष पर रखा जाता है और 1 घंटे के लिए डीसीएम की एक पूल के ऊपर 2 सेमी (10 मिलीलीटर) को निलंबित कर दिया. यह कमरे के तापमान पर एक मोहरबंद कंटेनर में किया जाता है.
4. सड़न रोकनेवाला और electrospun scaffolds के postproduction बंध्याकरण उत्पादन
- सड़न रोकनेवाला पाड़ उत्पादन एक साफ कमरे के वातावरण के अंदर एक लामिना का प्रवाह हुड के एक सड़न रोकनेवाला पर्यावरण में electrospinning द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. चिकित्सा ग्रेड या डीसीएम में ऊष्मायन द्वारा निष्फल पॉलिमर की यह या तो बाँझ पॉलिमर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बार भंग, पॉलिमर बाँझ के रूप में चारों ओर लिपटे पन्नी पर electrospunखराद का धुरा terilised. Scaffolds तो aseptically नियंत्रित किया जाता है. यह बाँझपन एंटीबायोटिक मुक्त विकास मीडिया में उचित अवधि के लिए पाड़ के नमूने incubating के द्वारा सत्यापित है.
- में इथेनॉल कीटाणुशोधन के लिए (इस प्रयोग के प्रयोगात्मक है, लेकिन नसबंदी की किसी मान्यता प्राप्त पद्धति है जो क्लिनिक के लिए ले जाया जा सकता है नहीं है) scaffolds के संक्षिप्त आसुत जल में एक 70% v / v इथेनॉल के समाधान में रखा जाता है (15 मिनट). व्यावहारिक प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए यह आम तौर पर इतना है कि वे तो संवर्धित कोशिकाओं के साथ सफलतापूर्वक कर सकते हैं जोड़ा जा करने के लिए scaffolds के कीटाणुरहित करने के लिए पर्याप्त है.
- Peracetic एसिड नसबंदी scaffolds के लिए peracetic एसिड में डूब रहे हैं (0.1% v / v फॉस्फेट में खारा बफर (पीबीएस)) और कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए incubated रहे Selim एट अल में वर्णित के रूप में 9.
- गामा नसबंदी scaffolds के लिए 3 kGy की एक खुराक के साथ विकिरणित एक सीज़ियम स्रोत का उपयोग कर रहे हैं सलीम एट अल में वर्णित के रूप में 9.
5. Scaffolds की biomechanical परीक्षण
- Scaffolds आयत में कटौती कर रहे हैं 5 मिमी x 20 मिमी, मोटाई, के लिए एक micrometer का उपयोग मापा और एक बोस Electroforce 3100 साधन में रखा. इस मशीन 0-22 एन के बल 6mm और लोड / तनाव तनाव वक्र बनाम के रूप में विस्थापन भूखंडों की एक विस्थापन के लिए लागू होता है. यह यंग है मापांक और लोच की गणना करने की अनुमति देता है.
6. Scaffolds पर कक्ष Visualising और ईसीएम उत्पादन के मूल्यांकन
कोशिकाओं महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक जो एक scaffolds पर कक्षों को देखने के लिए के रूप में वे देते हैं, विस्थापित और पैदा की अनुमति के साथ कलंकित किया जा सकता है. Post संस्कृति scaffolds पर कोशिकाओं की उपस्थिति 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) के साथ सेल नाभिक के लिए धुंधला हो जाना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. पाड़ पर कोशिकाओं द्वारा ECM उत्पादन elastin के सहित के रूप में इस उदाहरण में दिखाया गया ECM प्रोटीन का एक श्रृंखला के लिए कोशिकाओं को धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. सभी इस्तेमाल किया scaffolds के लिए एक मापा गया0.2 मिमी और कम से कम कटौती के वर्गों में 1.5 सेमी x 1.5 सेमी मोटाई का बोने से पहले.
इन अध्ययनों में मानव त्वचीय fibroblasts भर भूमिका वे नरम ऊतक पुनर्निर्माण में खेलने जो हमारी प्रयोगशाला प्राथमिक अनुसंधान ब्याज की वजह से किया जाता है.
कोशिकाओं स्तन कमी या abdominoplasty (सहमति उनके ऊतक के लिए दिया गया था करने के लिए अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा) के लिए वैकल्पिक सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से त्वचा के नमूनों से प्राप्त कर रहे हैं. ऊतकों और एकत्र कर रहे हैं अनुसंधान ऊतक बैंक 12,179 लाइसेंस के तहत गुमनाम इस्तेमाल किया. ऊतकों पीबीएस युक्त स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल) और (100 एमएल / आइयू) पेनिसिलिन और amphotericin के बी (0.5 μg / एमएल) के साथ धोया जाता है. ऊतकों के नमूनों 0.1% w / वी trypsin और 0.1% पीबीएस में ग्लूकोज (12-18 घंटे, 4 डिग्री सेल्सियस) में incubated हैं. त्वचा से खुली, सूक्ष्मता कीमा बनाया हुआ और Collagenase के 10 मिलीलीटर (0.5% w / में ध् DMEM और 10%, एफसीएस 37 ° C 18 घंटे के लिए) के साथ incubated. परिणामस्वरूप सेल suspens की centrifugationआयन (10 मिनट के लिए 400 ग्राम), कोशिकाओं है कि और संवर्धित किया जा सकता है DMEM में subcultured भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस, 10% v / v), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल), पेनिसिलिन (100 IU / के साथ पूरक की एक गोली का उत्पादन ) मिलीलीटर और amphotericin के बी (0.5 μg / एमएल). केवल 4-9 पारित होने की fibroblasts प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है.
- मानव त्वचीय fibroblasts, T75 एक में एक बार मिला हुआ (EasyFlask, Nunc, न्यूयॉर्क, अमेरिका) से trypsin / EDTA (5 मिलीलीटर, 5 मिलीग्राम / एमएल trypsin, 2 मिलीग्राम / मिलीग्राम EDTA में खारा) जोड़कर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, पर 5 मिनट के लिए incubating के 37 ° सी. निलंबन 10 मिनट (150 ग्राम) के लिए Centrifuged है. कोशिकाओं DMEM (एफसीएस (10% v / v), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल), पेनिसिलिन (100 आइयू / एमएल) और amphotericin बी (0.5 μg / एमएल) के साथ पूरक) के 5 मिलीलीटर में में resuspended कर रहे हैं और एक का उपयोग कर की गिनती रुधिरकोशिकामापी, और एकाग्रता बोने के लिए निकाला जाता है. कोशिकाओं को सामान्य रूप से अच्छी तरह से प्रति 50,000 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
- यदि आवश्यक हो, पाड़ पर कोशिकाओं बोने से पहले, कोशिकाओं पूर्व लेबल लाल या हरी CellTracker का उपयोग कर सकते हैं. सेलएस 3 एक्स 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोया जाता है. 10 सीरम मुक्त, सेल उपयुक्त, मध्यम (10 मिलीलीटर) जोड़ी गई है और 37 में कक्षों को 45 मिनट के लिए incubated रहे हैं सी. ° में मिमी CellTracker के की एक समाधान ऊष्मायन के बाद, 3 एक्स 5 मिलीलीटर पीबीएस जिसके बाद वे scaffolds पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कोशिकाओं में धो रहे हैं. Scaffolds की सतह 570 एनएम λex पर एक Axon ImageExpress (आण्विक उपकरण, Sunnyvale, अमेरिकी) खुर्दबीन में imaged किया जा सकता है - 620 एनएम λem (CellTracker लाल) और 480 एनएम λex, 533 एनएम λem (CellTracker हरा). कोशिकाओं की पैठ गहरी scaffolds में एक multiphoton confocal सूक्ष्मदर्शी इस्तेमाल किया जा सकता है जांच. यह चारों ओर के साथ या कोशिकाओं के बिना सबसे scaffolds में 200 माइक्रोन प्रवेश प्राप्त कर सकते हैं.
- पोस्ट संस्कृति नमूने 1 मिलीग्राम पीबीएस में 3.7% formaldehyde में 37 ° C पर तय कर रहे हैं और 20 मिनट के लिए तो x 3 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोया.
- Elastin के प्राथमिक एंटीबॉडी का 200 μL प्रत्येक नमूना के लिए जोड़ रहे हैं (5% v / पीबीएस में ध्, खरगोश विरोधी मानव अल्फा Elasटिन, AbDserotec, Kidlington, ब्रिटेन) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए incubated रहे.
- नमूने x 3 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोया जाता है और फिर माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान (0.5% v / v बकरी विरोधी खरगोश (एफसी) आईजीजी: FITC) में incubated पीबीएस युक्त DAPI (1 μg / एमएल) में 30 मिनट के लिए.
- इस के बाद नमूने x 3 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो रहे हैं.
- DAPI और 480 एनएम λex के लिए 460 एनएम λem - माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 533 एनएम λem DAPI और माध्यमिक एंटीबॉडी दाग नमूने तो एक Axon ImageExpress फ्लोरोसेंट खुर्दबीन, 365 एनएम λex पर है imaged कर रहे हैं. DAPI नाभिक दाग और एक फाइबर कोशिकाओं के भीतर के वितरण को देखने के लिए बहुत आसानी से की अनुमति देता है.
7. द्विअक्षीय गतिशील कंडीशनिंग को subjecting scaffolds पर कक्ष
तंतुप्रसू ईसीएम उत्पादन पर गतिशील कंडीशनिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए हम एक सरल सबूत की अवधारणा को इस का पता लगाने के bioreactor विकसित की है.
- गुब्बारा और प्रवाह इकट्ठेविनियमन उपकरण और प्रणाली तैयार तो यह आसानी से एक बाँझ सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त पोत में रखा जा सकता है एक बार यह लेपित है.
- आटोक्लेव उपकरण गुब्बारा (122 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए, 220 mbar) सहित. हम पुष्टि कर सकते हैं कि गुब्बारे inflating की और उन्हें बार - बार deflating के द्वारा उनके कार्य को प्रभावित किए बिना प्रतिकूल वाष्पदावी विसंक्रण जीवित.
- एक साफ कमरे में स्थिति में एक लामिना का प्रवाह हुड में तंत्र खोल पर electrospun हो.
- आवश्यक सतह क्षेत्र (याद गुब्बारा अभी भी संस्कृति पोत में फिट करने की जरूरत है) के साथ खारा फॉस्फेट बफर गुब्बारा फुलाना और पीबीएस तंत्र में एक बिंदु के लिए बाँझ होने की जरूरत नहीं पर एक बिजली पृथ्वी पर शाखा (पाइप कनेक्ट नल 3 तरह).
- Electrospin सामान्य कताई शर्तों का उपयोग कर गुब्बारा पर आवश्यक बहुलक, 10 सेमी की दूरी काम का उपयोग कर. पाड़ 1 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं. 'गीला फाइबर' पर्याप्त 'चिपचिपा' सर्फ का पालन कर रहे हैंइक्का के बाद से detaching के बिना गुब्बारा.
- एक बाँझ पोत में गुब्बारा प्लेस और यह एक लामिना का प्रवाह हुड सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त करने के लिए परिवहन.
- पोत और किसी बाँझ सतह पर जगह (पेट्री डिश) से गुब्बारा निकालें और बार - बार (हर 20 सेकंड) लेपित गुब्बारा पर 20 मिनट के लिए एक सेल निलंबन (1 एक्स 10 DMEM के 5 मिलीलीटर में 6 कोशिकाओं) वितरित करने के लिए करने का प्रयास करने के विंदुक सतह पर समान रूप से कोशिकाओं.
- संस्कृति पोत में गुब्बारा प्लेस, और पूर्व गर्म सेल प्रकार के लिए उपयुक्त मीडिया जोड़ें.
- एक सिरिंज पंप (केंट वैज्ञानिक, जिनी प्लस, कनेक्टिकट, अमेरिका) के लिए मुद्रास्फीति उपकरण कनेक्ट और बढ़ / खंडन करना गुब्बारे के रूप में द्विअक्षीय बढ़ाव देने के लिए आवश्यक है. एक कंप्यूटर नियंत्रित सिरिंज पंप के लिए एक अधिक जटिल बढ़ाव शासन को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
निम्न आंकड़े प्रतिनिधि परिणाम है कि उम्मीद की जा सकती हैअगर ऊपर तरीकों का पालन कर रहे हैं.
Electrospinning यादृच्छिक और आदेश दिया आर्किटेक्चर (चित्रा 1) के साथ scaffolds बनाने के लिए उपयोग किया जा सकता है, यह repeatable है और फाइबर समान हैं. पॉलिमर के कई प्रकार के विशेषताओं के साथ electrospun जो भिन्न हो सकते हैं काफी के रूप में PHBV पीएलए, या PCL के लिए चित्रा 2 में दिखाया जा सकता है. Electrospinning प्रकाश शराबी scaffolds या घने कोशिका झिल्ली के अभेद्य (देखें चित्र 3) का उत्पादन कर सकते हैं. यहाँ दिखाया scaffolds के सभी सेल लगाव और प्रसार में मदद की. पिछले काम दिखाया गया कि कोशिकाओं के माध्यम से कम से कम 500-600 माइक्रोन की गहराई को इन scaffolds विस्थापित कर सकते हैं पीएलए के लिए 9 औसत फाइबर व्यास 3 माइक्रोन है, PHBV के लिए यह 5-20 माइक्रोन से लेकर मोती के साथ 0.3μm है; यह PCL 3 माइक्रोन है, और यह PLGA के लिए 11 माइक्रोन है. अन्य विलायक प्रणाली का उपयोग करते हुए अध्ययन की रिपोर्ट है कि PHBV electrospun फाइबर के रूप में मोती या मोती बहुलक के बिना हो सकता है 10,11.
<पी वर्ग = "jove_content"> अगर मोटा scaffolds के वाष्प की आवश्यकता है और गर्मी annealing के साथ scaffolds की परतों पानी रखना नियोजित किया जा सकता है (चित्रा 4 देखें). इन पाड़ परतों delaminate और यह बहुत मुश्किल हो सकता है परतों के बीच जंक्शन पा सकते हैं.हम बताते हैं कि bilayer झिल्ली जहां कोशिकाओं को एक और बी एक खुलेपन के रूप में चित्रा 5 में दिखाया के बिना कर सकते हैं एक अलग झिल्ली पर संवर्धित किया जा बनाया जा सकता है. यहाँ हम मानव त्वचीय fibroblasts दो अलग फ्लोरोसेंट सेल पर नजर रखने के रंग के साथ रंग का उपयोग करके यह प्रदर्शित. इस तरह के एक bilayer झिल्ली उपयोगी हो सकता है जब संवर्धन कोशिकाओं फांक तालु की मरम्मत या पुनर्निर्माण periodontal के रूप में दूसरे पक्ष पर एक नरम फार्म डिजाइन कोशिकाओं से अलग पक्ष पर एक हड्डी या कार्टिलेज के रूप में कठोर ऊतक (और तेजी से बढ़ रही है आमतौर पर) ऊतक फार्म करने के लिए सर्जरी के 12, 13
Electrospun पर नसबंदी के प्रभाव के लिए सम्मान के साथ scaffolds हमपहले की रिपोर्ट है कि पाड़ और बाद में सेल संस्कृति पर नसबंदी के प्रभावों की विधि 9. यह चित्रा 6 में सचित्र है जो फाइबर व्यास और अंतिम तन्य शक्ति और PLGA पाड़ की यंग मापांक पर peracetic एसिड, गामा विकिरण और इथेनॉल के प्रभाव दिखाता है .
गामा विकिरण फाइबर व्यास पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है जबकि peracetic एसिड और इथेनॉल लगभग 50% से फाइबर व्यास को कम. परम तन्य शक्ति के सम्मान के साथ नसबंदी के तरीकों में से प्रत्येक के अंतिम तन्य शक्ति और scaffolds के लोच बदल. इन scaffolds पर कोशिकाओं की संस्कृति आगे परम तन्यता तनाव कम है, लेकिन लोच में वृद्धि हुई.
अंत में, गतिशील द्विअक्षीय बढ़ाव की electrospun scaffolds पर संवर्धित कोशिकाओं पर प्रभाव का परीक्षण करने की एक विधि प्रस्तुत है. यह सबूत की अवधारणा दृष्टिकोण से पता चलता है कि कोशिकाओं को गतिशील दौरान व्यवहार्य रहनाबढ़ाव लेकिन यह भी इन परिस्थितियों में elastin की वृद्धि हुई मात्रा में उत्पादन. यह elastin की कमी है जब एक ही पाड़ पर एक ही कक्ष स्थिर शर्तों के तहत रखा जाता है (देखें चित्र 7) करने के लिए स्पष्ट रूप से विरोधाभासों है.
चित्रा 1 electrospinning रिग और यादृच्छिक और समानांतर और फिर एक दूसरे पर रखा फाइबर के फाइबर परतों की कताई कार्टून दिखाता है. सीधा फाइबर एल्यूमीनियम पन्नी पर गठबंधन फाइबर का एक सेट electrospinning, 90 पन्नी के द्वारा घूर्णन ° और फिर तुरंत इन के शीर्ष पर गठबंधन फाइबर की एक दूसरे सेट electrospinning द्वारा बनाया जा सकता है.
चित्रा 2 (ए) पीएलए (पैमाने पट्टी 100 माइक्रोन है), (बी) PHBV (पैमाने पट्टी 100 माइक्रोन है), (सी) PCL (पैमाने पर पट्टी यादृच्छिक electrospun मैट की आकारिकी दिखाता है 100) माइक्रोन और (डी) PLGA (पैमाने पर पट्टी 200 माइक्रोन है). ध्यान दें कि पीएलए, PCL, और PLGA सभी microfibrous वर्दी scaffolds के हैं. PHBV nanofibres 5-20 माइक्रोन आकार के मनकों को जोड़ने के साथ एक मोती का हार 'के रूप में घूमती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 3 एक multilayered पाड़ के उत्पादन. यहाँ scaffolds के शुरू में PHBV और तो पीएलए या PCL साथ में भरा सीरिंज का उपयोग किया जाता है का उपयोग कर घूमती हैं. ये PHBV पाड़ के शीर्ष पर घूमती हैं. आंकड़ा इन multilayered scaffolds के रूप में, (ए) एक एकल PHBV परत, (बी) एक PHBV पीएलए bilayer के एक क्रॉस सेक्शन, घने nanofibrous दिखा दिखाता है, मोती का हार 'PHBV परत (बाएं) और अधिक खुला microfibrous पीएलए परत (दाएं) और (सी) एक एकल पीएलए परत.नायक "> यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने.
चित्रा 4 मोटा scaffolds गर्मी annealing और वाष्प annealing के द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. (ए) और (ख) वाष्प annealed पीएलए पाड़ के माध्यम से एक अनुभाग जहां लगभग 150 माइक्रोन की प्रारंभिक रेशेदार scaffolds के साथ किया गया है रखा जाता है और dichloromethane वाष्प 500 माइक्रोन तक की बहुत मोटा scaffolds बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है दिखा. (सी) और (डी) एक देख सकते हैं कि पाड़ बहुत मोटा फाइबर की परतों पतली पतली और मोटी फाइबर की परतों को एक साथ annealing के गर्मी के द्वारा बनाई गई फाइबर की परतों के साथ interspersed के होते हैं. इस दृष्टिकोण के लिए जटिल यांत्रिक गुणों के scaffolds उत्पादन किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
फाई gure 5 कोशिकाओं पर एक bilayer पाड़ के रूप. सभी मामलों में मौजूद कोशिकाओं मानव त्वचीय fibroblasts हैं. (ए) electrospun पीएलए पर Fibroblasts जहां कोशिकाओं को तय कर रहे हैं DAPI साथ दाग. (बी) PHBV पर DAPI दाग कोशिकाओं. (सी) fibroblasts एक महत्वपूर्ण डाई, CellTracker हरे रंग के साथ पूर्व दाग रहे हैं, और आप bilayer की पीएलए ओर उन की उपस्थिति देख सकते हैं. (डी) कम PHBV और पीएलए ऊपरी सतह पर सतह हरी दाग fibroblasts पर लाल दाग fibroblasts साथ bilayer के माध्यम से एक अनुभाग है. (ई) CellTracker लाल के साथ पूर्व से सना हुआ Fibroblasts PHBV सतह पर हो. महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक के उपयोग पाड़ पर कोशिकाओं के वितरण में देख रहे हैं, जबकि कोशिकाओं को अभी भी बढ़ रहे हैं के लिए एक सुविधाजनक कार्यप्रणाली प्रदान करता है. एक नियमित रूप से कम से कम 7 दिनों के लिए इन रंगों का उपयोग कर सकते हैं. हालांकि डाई की एकाग्रता के रूप में कोशिकाओं के विभाजन पतला हो जाता है. स्केल सलाखों 0.1 मिमी के बराबर हैं."alt =" g6.jpg चित्रा 6 "/>
चित्रा 6 electrospun पाड़ Biomechanical गुण बोस Electroforce tensiometer डिवाइस (ए) का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं है. (बी) के PLGA की / तनाव तनाव घटता गामा विकिरण, शराब, peracetic एसिड, या aseptically उत्पादित द्वारा निष्फल scaffolds. परम तन्यता तनाव (यूटीएस) जो फाइबर अधीन किया जा सकता है इससे पहले कि यह टूट जाता है, परम तन्यता तनाव और यंग है मापांक: तीन माप इस ग्राफ से प्राप्त किया जा सकता है. बाद पाड़ की लोच का एक संकेत देता है. (सी) माइक्रोन में PLGA फाइबर व्यास पर प्रत्येक नसबंदी विधि का प्रभाव है. प्रत्येक नसबंदी कार्यप्रणाली में यूटीएस की कमी हुई. दोनों peracetic एसिड और गामा विकिरण अधिक लोचदार पाड़ दे यंग मापांक कमी, शराब पाड़ विशेष रूप से भंगुर बनाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
Electrospinning ऊतक इंजीनियरिंग के लिए scaffolds के उत्पादन के लिए एक बहुत लोकप्रिय तकनीक है 14, 16, 15. हालांकि यह अपेक्षाकृत सरल है प्रयोगात्मक उपयोग के लिए बुनियादी electrospun scaffolds के उत्पादन तकनीक भी कई चर के साथ जटिल और बहुमुखी. 6 वहाँ कई का वर्णन कैसे अध्ययन कर रहे हैं Electrospinning मानकों का निर्धारण पाड़ का उत्पादन किया. इस अध्ययन में काफी चुनौतियों के बाद उत्पादन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयुक्त आर्किटेक्चर और यांत्रिक गुणों की scaffolds बनाने के लिए और उनके भीतर कोशिकाओं कोशिकी प्रोटीन बनाने के लिए आदमी में आरोपण के लिए ऊतक फिट प्राप्त करने के प्रोत्साहित करते हैं.
इस लेख में हमारा उद्देश्य विधियों का वर्णन करने के लिए पाठकों से लैस करने के लिए डिजाइन और उद्देश्यों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए scaffolds विशेषताएँ है. इस अनुच्छेद में हम तरीके का वर्णन करने के लिए जटिल और मोटा scaffolds के बनाने और प्रायोगिक और नैदानिक इस्तेमाल के लिए scaffolds बाँझ. हम भी इमेजिंग सी का वर्णनscaffolds और elastin फाइबर उत्पादन द्विअक्षीय बढ़ाव कोशिकाओं subjecting द्वारा की प्रेरण पर ells.
Scaffolds के वांछित सुविधाओं के कई पोस्ट (जैसे annealing के कई परतों के रूप में) उत्पादन और नसबंदी प्राप्त किया जा सकता है. लेकिन इन में बारी scaffolds के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करेगा. हम रिपोर्ट है कि नसबंदी के तरीके अलग विस्तार करने के लिए परम तन्य शक्ति और यंग है मापांक बदल जाते हैं. हमारे समूह से हाल ही में एक अध्ययन PLGA scaffolds के लिए संभावित स्टरलाइज़ शासनों के रूप में अपने प्रभाव के लिए गामा विकिरण, peracetic एसिड और इथेनॉल 9 नसबंदी तकनीक के प्रतिकूल प्रभाव की तुलना में सड़न रोकनेवाला की शर्तों के तहत scaffolds के उत्पादन से बचा जा सकता है. बाद एक cleanroom के उपयोग की आवश्यकता है . विभिन्न उपयोगकर्ताओं को अलग तरीके का चयन करें, लेकिन सभी जानते हैं कि वर्तमान नसबंदी के तरीके scaffolds के गुणों पर नकारात्मक प्रभाव होगा होना चाहिए सकता है.
सी scaffolds पर कोशिकाओं के ulture भी 'scaffolds के यांत्रिक गुणों को प्रभावित करता है. Scaffolds पर द्विअक्षीय बढ़ाव कोशिकाओं को subjecting द्वारा ECM उत्पादन का प्रेरण के लिए यांत्रिक गुणों को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
दूसरे पर एक पाड़ कताई एक bilayer झिल्ली बनाने की पद्धति और आसानी से समझ में आ रहा है हम bilayer scaffolds के दो महत्वपूर्ण सेल पर नजर रखने के रंग के साथ पूर्व लेबलिंग कोशिकाओं द्वारा इस पत्र में सचित्र कोशिकाओं के दो विविध आबादी का समर्थन करने में सक्षम का वर्णन. इन करने के लिए उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि bilayer झिल्ली अपने घोषित उद्देश्य हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
अंत में बजट द्विअक्षीय बढ़ाव रिग इस अध्ययन में वर्णित शासनों की एक श्रृंखला देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चक्रीय, रैखिक, और यादृच्छिक शासनों आसानी से किया जा सकता है क्रमादेशित लागू. इस बहुमुखी प्रतिभा प्रणाली जैसे, फांक तालु, पैल्विक मंजिल, मूत्राशय, और त्वचा के ऊतक इंजीनियरिंग में पेश आ रही समस्याओं के कई के लिए उपयोग करने के लिए अनुमति देगा.
Scaffolds पर संवर्धन की कोशिकाओं के लिए ऊतक इंजीनियरिंग साहित्य में एक अक्षीय परीक्षण प्रणाली का उपयोग किया गया है. की सूचना दी है 4 लेकिन हम कैसे कोमल ऊतकों द्विअक्षीय बढ़ाव का जवाब के साथ किसी भी प्रकाशित निपटने साहित्य खोजने में असमर्थ थे. इस सरल दृष्टिकोण को दर्शाता है कि कोशिकाओं का जवाब elastin के उत्पादन के साथ द्विअक्षीय बढ़ाव - बाह्य मैट्रिक्स है जो नरम ऊतकों लोचदार हटना देता है की एक प्रमुख घटक कैसे कंडीशनिंग कोमल ऊतकों के रूप में वे प्रयोगशाला में बढ़ने का एक स्पष्ट संकेत देता है एक मार्ग प्रदान करता है ऊतकों के क्षेत्रों के लिए आरोपण के लिए उपयुक्त उत्पादन शरीर जहां देशी ऊतकों आंतरिक लोच है. यह एक ऐसा क्षेत्र है जहां आगे विकास स्पष्ट रूप से ऊतक इंजीनियरिंग समुदाय और bioreactor निर्माताओं द्वारा merited के जाएगा.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम श्री फ्रेज़र अलविदा के लिए एक पीएचडी वित्त पोषण के लिए बीबीएसआरसी धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
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