Summary
פיגומים Electrospun יכול להיות מעובד הייצור עבור יישומים הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים שיטות ספינינג פיגומים מורכבים (על ידי ספינינג רצופים), להכנת פיגומים עבים יותר (על ידי שכבות רב באמצעות אדי חום או חישול), להשגת עקרות (ייצור מזוהם או פירסום הייצור עיקור) ו להשגת תכונות ביומכניים המתאימים.
Abstract
Electrospinning היא שיטה הנפוצה צדדי לייצר פיגומים מתכלה (לעיתים קרובות) על הנדסת רקמות 3D. 1, 2, 3 רקמות in vivo רבים עוברים distension biaxial כדי ובמידות שונות כגון, קומה העור, שלפוחית השתן באגן ואפילו החיך הקשה כילדים לגדול. בייצור פיגומים למטרות אלו יש צורך לפתח פיגומים של מאפיינים ביומכניים המתאימים (אם מושגת ללא או עם תאים) ואילו סטרילי לשימוש קליני. הפוקוס של מאמר זה היא לא איך להקים פרמטרים electrospinning בסיסיים (כמו שיש ספרות ענפה על electrospinning) אלא על אופן השינוי ייצור פיגומים סובב הודעה כדי להתאים אותם לצרכים הנדסת רקמות - כאן, עובי תכונות מכאניות עיקור (נדרש לשימוש קליני) נחשבים ויש לנו גם לתאר כיצד תאים יכול להיות מתורבת על פיגומים ו נתון זן biaxial למצב אותם עבור יישומים ספציפיים.
Electrospinning נוטה לייצר יריעות דקות, כמו אספן electrospinning הופך מצופה בידוד סיבים הוא הופך להיות המנצח עניים כך סיבים כבר לא פיקדון על זה. מכאן אנו מתארים גישות לייצר מבנים עבה על ידי חום או אדי חישול להגדיל את כוחו של פיגומים, אך לא בהכרח גמישות. ספינינג רציפה של פיגומים של פולימרים שונים כדי להשיג פיגומים מורכבים מתואר גם. שיטות העיקור יכולה להשפיע לרעה על חוזק ואלסטיות של פיגומים. נשווה שלוש שיטות השפעתם על תכונות ביומכניים על פיגומים electrospun של חומצה לקטית-Co-גליקולית פולי (PLGA).
הדמיה של תאים על פיגומים והערכת ייצור של תאיים מטריקס (ECM) חלבונים על ידי תאים על פיגומים מתואר. תאים culturing על פיגומים במבחנה יכול לשפר את הכוח פיגום ואלסטיות אך הנדסת רקמות literatuRe מראה כי תאים לעיתים קרובות אינם מצליחים לייצר ECM מתאים כאשר בתרבית בתנאים סטטיים. ישנן כמה מערכות מסחריות זמינות המאפשרות 1 לתאים תרבות על פיגומים תחת משטרים מיזוג דינמיים -. דוגמה אחת היא Electroforce בוס 3100 אשר ניתן להשתמש בהם כדי להפעיל את תוכנית מיזוג על תאים פיגומים שנערך באמצעות להתמודד מכניים בתוך המדיה חדר מלא 4 גישה אל התא bioreactor התרבות תקציב עיוות מבוקרת ב 2 מימדים מתואר. אנו מראים כי תאי יכול להיגרם לייצר האלסטין בתנאים אלה. לבסוף הערכה של תכונות ביומכניים של פיגומים מעובדים בתרבית עם או בלי תאים מתואר.
Protocol
1. Electrospinning של סיבים אקראיים ומיושרים
Electrospinning יוצר רשתות סיביים דקים באמצעות פוטנציאל חשמלי לצייר פתרון פולימר כלפי אספן עם הארקה. אספנים יכולים להיות בצורות רבות מאוד יכול להיות סטטי או, יותר נפוץ, מסתובב. מתאדה ממס לפני הפתרון מגיע אספן ו הסילון מתמצק לתוך סיבי.
פולימר זה מחייב משלה התנאים לייצר סוג מסוים של סיבים. הריכוז של הפולימר, ממס, המרחק בין פתרון שאוב ו אספן מוארק, ההבדל הפוטנציאל בין השניים, מהירות סיבוב של אספן, קצב הזרימה, טמפרטורה ולחות כולנו משפיעים electrospinning. ישנם מחקרים רבים המתארים את הבחירה של electrospinning פרמטרים וכיצד אלה משפיעים על פיגומים המיוצרים (קוטר הסיבים מורפולוגיה למשל, והכיוון). 5, 6, 7, 8בניסויים אלה היו פיגומים הסתובב על בסיס התנאים שנבחרו במחקרים קודמים שלנו. 2, 9
השיטות הבאות מתאימים לייצור electrospun פיגומים מ PLGA, חומצה לקטית poly (PLA), פולי ε-caprolactone (PCL) ו-פולי hydroxybutyrate שיתוף hydroxyvalerate (PHBV) באמצעות אספן מסתובבת כפי שמוצג באיור 1. במהלך dichloromethane ממס (DCM) משמש. השיטה כאן מייצר PLGA microfibrous, PLA ו-PCL ו nanofibrous PHBV פיגום עם מיקרו בגודל חרוזים (מורפולוגיה "שרשרת הפנינים").
- מעיל מסתובב אספן mandrel בנייר כסף, כאשר הצד המלוטש / מבריק פונה החוצה. Mandrel שלנו היה 20 ס"מ רוחב ו -10 ס"מ קוטר.
- הכן פולימר פתרונות, PLA, PCL ו PHBV מורכבים כפתרון% 10 WT ב DCM. PLGA מורכב כפתרון% 20 WT ב DCM.
- מקום 4 מזרקים של 5 מ"ל נפח על משאבת מזרק. מזרקים נטענים ל-Contain 5 מ"ל של פולימר זה, נותן 20 מ"ל בסך הכל.
- עבור PLA, PCL ו PHBV להשתמש ספיקה של 40 ל -1 μLmin המזרק.
- עבור PLGA להשתמש ספיקה של 30 ל -1 μLmin המזרק.
- עבור PLA, PCL ו PLGA להשתמש מרחק עבודה של 17 ס"מ מקצה המחט mandrel.
- עבור PHBV להשתמש מרחק עבודה של 10 ס"מ מכל קצה המחט mandrel.
- לחייב את המחטים המזרק 17,000 V (73030 P, Genvolt, בשרופשייר, אנגליה) ו electrospin ממרחק המתאים על mandrel רדיד אלומיניום מצופה.
- עבור סיבים אקראיים לסובב את mandrel בסל"ד 200.
- עבור סיבים בציר לסובב את mandrel בסל"ד 1000.
- פיגומים ניתן לאחסן על רדיד האלומיניום בתנאים יבשים. האחסון המומלץ הוא במיכל אטום על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות יבוש. מניסיוננו פיגומים להישאר יציב במשך לפחות 4 חודשים (אולי עוד הרבה זמן) בתנאים אלה (אנחנו לא מודעים לכל puמחקרים blished על תנאי אחסון ארוכות טווח עבור פיגומים).
2. ייצור פיגומים מורכבים על ידי ספינינג ברצף
ספינינג רציפים מספק שיטה של שילוב תכונות של חומרים שונים כדי ליצור חומר שיש לו את הטוב ביותר של תכונות שני. PHBV מייצרת שטוח, גיליון צפופה, בעוד PLA פריך או PCL ספינינג מייצרת יריעות גומי בצפיפות נמוכה. חומרים הן תמיכה מצורף התא. ברציפות ספינינג בחומרים אלה התוצאות קרום התא חדיר צפוף כי הוא אלסטי.
- הגדר את מעטה electrospinning כאמור בסעיף 1, עם תנאים PHBV ספינינג.
- Electrospin PHBV לעיל.
- מבלי לשנות את רדיד אלומיניום, electrospin פולימר 2 על העליונה באמצעות פרמטרים ותנאים רגילים לזה פולימר (למשל 17 ס"מ תוף כדי מחט, 17000 V, 200 סל"ד עבור PLA). תהליך זה כתוסף בונה שכבה כפולה של הפיגום לייצר bilayer.
3. ייצור פיגומים רב שכבתי על ידי חישול כמה שכבות יחד
- פיגומים ניתן רב שכבתי באמצעות חום חישול. לעשות את זה 4 גיליונות של PLGA המוצבים על גבי אחד את השני ולאחר מכן לחמם annealed ב 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- פיגומים יכול גם להיות מרותק על ידי אדי חישול. כאן 4 גיליונות של PLGA ממוקמים על גבי אחד את השני על תנאי 2 ס"מ מעל הבריכה של DCM (10 מ"ל) במשך שעה 1. זה מתבצע במיכל אטום בטמפרטורת החדר.
4. הפקה אספטי עיקור postproduction של Electrospun פיגומים
- אספטי ייצור הפיגום ניתן להשיג על ידי electrospinning בסביבה נקייה, של מכסה המנוע למינרית הזרימה בתוך סביבת חדר נקי. כדי לעשות זאת פולימרים סטריליים או של כיתה רפואי או פולימרים מעוקרות ידי הדגירה ב DCM ניתן להשתמש. מומס פעם, פולימרים electrospun על נייר סטרילי סביב כמוterilised mandrel. פיגומים מטופלות אז בסביבה נקייה מחיידקים. עקרות מאומת על ידי דוגרים דגימות של פיגום אנטיביוטיקה ללא מדיה הצמיחה לתקופה המתאימה.
- לחיטוי אתנול (זה של שימוש בניסוי אך אינו מתודולוגיה מוכרת של עיקור שיכול להילקח למרפאה) פיגומים ממוקמים לזמן קצר (15 דקות) בתמיסה V / v 70% אתנול במים מזוקקים. לצורך ניסויים מעשיים זה בדרך כלל מספיק כדי לחטא פיגומים, כך שהם יכולים להשתלב בהצלחה עם תאים בתרבית.
- על פיגומים עיקור peracetic חומצה שקועים חומצה peracetic (0.1% V / V שנאגרו מלוחים פוספט (PBS)) ו מודגרות במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר כמתואר סלים ואח'. 9
- עבור גמא פיגומים עיקור הם מוקרן עם מינון של 3 kGy באמצעות מקור צסיום כמתואר סלים ואח'. 9
5. בדיקה ביומכנית של פיגומים
- פיגומים נחתכים למלבנים 5 מ"מ x 20 מ"מ, עובי נמדד באמצעות מיקרומטר, והניח את מכשיר Electroforce 3100 בוס. מכונה זו חלה על כוח של 0-22 N עד עקירה של 6 מ"מ ו חלקות לטעון נגד העקירה כמו עקומת מתח / מתח. זה מאפשר מודולוס האלסטיות של יאנג כדי לחשב.
6. Visualising תאים על פיגומים ו הערכת הפקה ECM
תאים יכולים להיות מוכתם צבעי ניאון חיוניים המאפשרים לראות 1 תאים על פיגומים כפי שהם מייחסים, להעביר מתרבים. תרבות פוסט נוכחות של תאים על פיגומים ניתן לקבוע על ידי מכתימה את גרעיני תאים עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). הייצור של ECM על ידי תאים על הפיגום ניתן להעריך על ידי מכתים תאים עבור מגוון של חלבונים ECM כולל ואלסטין, כפי שמוצג בדוגמה זו. פיגומים כל שימוש נמדדו ישעובי של לפחות 0.2 מ"מ וחותכים לריבועים של 1.5 ס"מ X 1.5 ס"מ לפני זריעה.
במחקרים אלה fibroblasts עורי האדם משמשים ברחבי בגלל התפקיד שהם ממלאים מחדש רקמות רכות וזה עניין המחקר העיקרי של המעבדה שלנו.
תאים מתקבלים דגימות עור מחולים שעברו ניתוח אלקטיבי עבור הקטנת חזה או בטן (נתנו את הסכמתם רקמות שלהם כדי לשמש למטרות מחקר). רקמות נאספים באופן אנונימי בשימוש תחת רישיון רקמות למחקר בנק 12179. רקמות נשטפים עם סטרפטומיצין PBS המכיל (0.1 מ"ג / מ"ל) ו פניצילין (100 IU / ml) ו amphotericin B (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). דגימות רקמה מודגרת ב 0.1 W / V טריפסין% ו -0.1% גלוקוז ב PBS (12-18 שעות, 4 ° C). הדרמיס הוא קילף, טחון דק מודגרות עם 10 מ"ל של collagenase (0.5% w / v ב DMEM ו 10% FCS, 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות). צנטריפוגה של suspens התא וכתוצאה מכךיון (400 גר 'למשך 10 דקות), מייצרת גלולה של תאים יכול להיות מתורבת ו subcultured ב DMEM השלימו עם העובר עגל בסרום (FCS, 10% V / V), סטרפטומיצין (0.1 מ"ג / מ"ל), פניצילין (100 IU / מ"ל) ו amphotericin B (0.5 מיקרוגרם / מ"ל). Fibroblasts רק מעבר 4-9 משמשים בניסויים.
- Fibroblasts עורי אדם, confluent פעם T75 (EasyFlask, Nunc, ניו יורק, ארה"ב) הם שנזרעו על ידי הוספת טריפסין / EDTA (5 מ"ל, 5 מ"ג / מ"ל טריפסין, 2 מ"ג / מ"ל EDTA ב מלוחים), דוגרים במשך 5 דקות 37 ° C. ההשעיה היא centrifuged במשך 10 דקות (150 גרם). התאים resuspended ב 5 מ"ל של DMEM (השלימו עם FCS (10% V / V), סטרפטומיצין (0.1 מ"ג / מ"ל), פניצילין (100 IU / ml) ו amphotericin B (0.5 מיקרוגרם / מ"ל)) וספר באמצעות haemocytometer, ואת הריכוז, מתוקנן על זריעה. תאים זרע בדרך כלל ב -50,000 תאים בכל טוב.
- במידת הצורך, לפני זריעת התאים על פיגום, תאים יכולים להיות מראש שכותרתו באמצעות CellTracker אדום או ירוק. התאשל נשטפים עם 3 x 5 מ"ל PBS. הפתרון של CellTracker 10 מ"מ סרום בחינם, התא המתאים, בינוני (10 מ"ל) הוא הוסיף והתאים מודגרת במשך 45 דקות ב 37 ° C. לאחר הדגירה, התאים נשטפים 3 הבא x 5 מ"ל PBS שבו הם זרע על פיגומים. בעקבות כך את פני השטח של הפיגומים ניתן הדמיה במיקרוסקופ ImageExpress אקסון (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, ארה"ב) על 570 ננומטר λex - 620 ננומטר λem (CellTracker אדום) 480 ננומטר λex - 533 ננומטר λem (CellTracker ירוק). כדי לחקור את החדירה של תאים עמוק יותר לתוך פיגומים מיקרוסקופ confocal multiphoton ניתן להשתמש. זה יכול להשיג בסביבות 200 מיקרון חדירה לתוך רוב פיגומים עם או בלי תאים.
- פרסם דגימות תרבות קבועים בפורמלין מ"ל 1 3.7% ב PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף עם 3 x 1 מ"ל PBS.
- 200 μL של נוגדנים האלסטין ראשוניים נוספים מדגם זה (5% לעומת / V ב PBS, ארנב נגד אדם elas אלפאפח, AbDserotec, קידלינגטון, בריטניה) מודגרות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- דוגמאות נשטפים עם 3 x 1 מ"ל PBS ו מודגרות מכן בתמיסה של נוגדנים משני (0.5% V / V נגד ארנב עז IgG (FC): FITC) ב PBS המכיל DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 30 דקות.
- לאחר מכן הדגימות נשטפים עם 3 x 1 מ"ל PBS.
- DAPI דגימות נוגדנים משניים מוכתמים הם צילמו אז על מיקרוסקופ אקסון ImageExpress ניאון, ננומטר λex 365-460 λem ננומטר עבור DAPI ו 480 ננומטר λex - 533 ננומטר λem על נוגדנים משני. כתמים DAPI גרעינים ומאפשר 1 כדי לראות את חלוקת התאים בתוך הסיבים מאוד בקלות.
7. חשיפת תאים על פיגומים למיזוג דינמי biaxial
כדי לבחון את ההשפעה של מיזוג דינמי על ייצור ECM פיברובלסטים פיתחנו bioreactor פשוט הוכחה של קונספט לחקור את זה.
- להרכיב בלון וזרימהמנגנון ויסות ולהכין מערכת אז זה יכול להיות ממוקם בקלות לתוך כלי סטרילי מתאים תרבית תאים פעם אחת הוא מצופה.
- החיטוי המנגנון כולל בלון (122 ° C, 220 Mbar לשעה 1). אנחנו יכולים לאשר כי בלונים מעוקר לשרוד ללא פגיעה בתפקוד שלהם על ידי ניפוח ו ניכוי אותן שוב ושוב.
- בחדר נקי, לפרוק את המנגנון של מכסה המנוע במצב זרימה למינרית להיות electrospun על.
- לנפח את הבלון כדי שטח הפנים הנדרש (זוכרים בלון עדיין צריך להתאים את כלי התרבות) עם פוספט שנאגרו מלוחים ולהתחבר PBS לאדמה חשמל בנקודה במנגנון זה לא צריך להיות סטרילי (צינור הסניף על 3 כיווני ברז).
- Electrospin פולימר הנדרש על הבלון באמצעות התנאים ספינינג רגילים, באמצעות מרחק עבודה של 10 ס"מ. אפשר פיגום להתייבש במשך שעה 1. של רטוב של סיבים הם "דביק" מספיק כדי לדבוק גולשאייס של הבלון לאחר מכן ללא ניתוק.
- מניחים את הבלון לתוך כלי סטרילי ולהעביר אותה אל מכסה המנוע למינרית זרימת מתאים תרבית תאים.
- הסר את הבלון של כלי ומקום על משטח סטרילי (צלחת פטרי) שוב ושוב (כל 20 שניות) פיפטה ההשעיה התא (1 x 10 6 תאים 5 מ"ל של DMEM) על בלון מצופה במשך 20 דקות כדי לנסות ולהפיץ התאים באופן שווה על פני השטח.
- הניחו בלון לתוך כלי התרבות, ולהוסיף מראש חוממו התקשורת המתאימים לסוג התא.
- חבר את מנגנון האינפלציה משאבת מזרק (קנט מדעי, Genie בנוסף, קונטיקט, ארה"ב) ו לנפח / להוציא את האוויר בבלון לפי הצורך לתת distension biaxial. משאבת מזרק מבוקר מחשב שניתן להשתמש בהם כדי להשיג את המשטר distension מורכבת יותר.
8. נציג תוצאות
הנתונים הבאים מייצגים תוצאות שניתן לצפותאם השיטות הנ"ל בעקבותיה.
Electrospinning יכול להיות מנוצל ליצירת פיגומים עם ארכיטקטורות אקראיים מסודרת (איור 1), זה הדיר הסיבים הם אחידים. סוגים רבים של פולימרים ניתן electrospun עם תכונות אשר יכול להשתנות במידה ניכרת כפי שמוצג באיור 2 עבור PHBV, PLA או PCL. Electrospinning יכול לייצר פיגומים רכות אור או קרום התא צפופים חדירים (ראה איור 3). כל פיגומים המוצגים כאן הקל מצורף תאים ו ההפצה. מחקרים קודמים הראו כי תאים יכולים להעביר באמצעות פיגומים אלה עד לעומק של לפחות 500-600 מיקרומטר 9 עבור PLA קוטר הסיבים הממוצעת היא 3 מיקרומטר,. עבור PHBV זה 0.3μm עם פנינים, החל 5-20 מיקרומטר, עבור PCL הוא 3 מיקרומטר, ועל PLGA הוא 11 מיקרומטר. מחקרים אחרים באמצעות מערכות ממס אחרים מדווחים כי PHBV יכול להיות electrospun כמו סיבים בלי חרוזים או פנינים פולימרי. 10,11
<בכיתה P => "jove_content" אם פיגומים עבה נדרשים אדי החום חישול יכול להיות מועסק על מנת לחשל שכבות של פיגומים יחד (ראה איור 4). אלה שכבות הפיגום לא delaminate וזה יכול להיות מאוד קשה כדי למצוא את הצומת בין השכבות.אנו מראים כי הקרומים bilayer ניתן לבצע בו תאים A ו-B יכול כל אחד להיות מתורבת על קרום נפרד ללא מתערבים זה בזה, כפי שמוצג באיור 5. כאן אנו מדגימים זאת באמצעות fibroblasts עורי אדם צבעוניים עם שני צבעים שונים גשש ניאון סלולריים. כגון קרום bilayer יהיה שימושי כאשר תאים culturing כדי ליצור רקמה קשה כמו עצם או סחוס בצד אחד להפריד תאים שנועדו ליצור רכה (ובדרך כלל מהר יותר וגדלה) רקמה בצד השני, כמו תיקון חיך שסוע או שיחזור חניכיים ניתוח. 12, 13
לגבי ההשפעה של עיקור על electrospun ויוצר תשתית לנודווח בעבר כי השיטה של השפעות עיקור על תרבות פיגום ובעקבות התא. 9 זו באה לידי ביטוי באיור 6 אשר מראה את ההשפעה של חומצה peracetic, קרינת גמא אתנול על קוטר סיבי חוזק מתיחה האולטימטיבי מודול יאנג של פיגום PLGA .
קרינת גמא אין כל השפעה משמעותית על סיבים בקוטר בעוד חומצה אתנול peracetic ולהפחית סיבים בקוטר של 50% בקירוב. לגבי חוזק מתיחה האולטימטיבי כל אחת מהשיטות של עיקור שינה את חוזק מתיחה האולטימטיבי ואת הגמישות של הפיגומים. התרבות של תאים על פיגומים אלה נוספת להפחית את הלחץ מתיחה האולטימטיבי, אבל הגדילה את הגמישות.
לבסוף, שיטת בדיקת ההשפעה של distension biaxial דינמי על תאים בתרבית על electrospun פיגומים מוצג. גישה זו הוכחה של קונספט מראה כי התאים נשארים קיימא במהלך דינמיdistension אלא גם לייצר כמויות מוגברות של האלסטין בתנאים אלה. זאת בניגוד בולט היעדר ואלסטין, כאשר אותם תאים על הפיגום באותו נשמרים בתנאים סטטיים (ראה איור 7).
איור 1. מציג קריקטורה של המתקן electrospinning ושל ספינינג של סיבים ולאחר מכן שכבות אקראי מקבילות של סיבים המונחים זה על זה. סיבים בניצב ניתן ליצור על ידי electrospinning קבוצה של סיבי מיושרים על רדיד אלומיניום, לסובב את נייר הכסף על ידי 90 ° ומיד electrospinning סט שני של סיבים מיושרים על גבי אלה.
איור 2. מציג את המורפולוגיה של מחצלות electrospun אקראיות של (A) PLA (בר בקנה מידה הוא 100 מיקרומטר), (ב) PHBV (בר בקנה מידה הוא 100 מיקרומטר), (ג) PCL (בר הוא בקנה מידה 100 מיקרומטר) (ד) PLGA (פס בקנה מידה הוא 200 מיקרומטר). שים לב, PLA, PCL ו PLGA כל פיגומים אחידים microfibrous. PHBV הוא הסתובב כמו "שרשרת הפנינים" עם nanofibres חיבור 5-20 חרוזים בגודל מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
איור 3. הפקת פיגום רב שכבתי. פה פיגומים הם הסתובב בתחילה באמצעות PHBV ואז מזרקים מלאים PLA PCL או משמשים. אלה הסתובב על גבי פיגום PHBV. האיור מציג את המראה של אלה פיגומים שכבות, () שכבה אחת PHBV, (ב) חתך של bilayer PHBV-PLA, מראה nanofibrous צפופה, PHBV "שרשרת הפנינים" השכבה (משמאל) microfibrous PLA פתוחה יותר שכבת (מימין) ו (ג) שכבה אחת PLA.NK "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
באיור 4. פיגומים עבים יכול להיות מיוצר על ידי חום אדי חישול חישול. (א) ו - (ב) מראים קטע דרך annealed אדי PLA פיגום שבו פיגומים סיביים הראשונים של כ 150 מיקרומטר הם הונחו יחד dichloromethane אדי משמש לייצור פיגומים הרבה יותר עבה של עד 500 מיקרומטר. ב (ג) ו - (ד) ניתן לראות כי הפיגום מורכב משכבות של סיבי הרבה יותר עבה וביניהם שכבות של סיבים דקים שנוצרו על ידי חום חישול שכבות של סיבים דקים ועבים יחד. גישה זו יכולה לשמש לייצור פיגומים של תכונות מכניות מורכבות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Fi gure 5. מראה של תאים על פיגום bilayer. בכל המקרים התאים הנוכחי הם fibroblasts עורי אדם. (א) Fibroblasts על electrospun PLA שבו תאים הינם קבועים מוכתם DAPI. (ב) DAPI תאים מוכתמים על PHBV. ב (ג) fibroblasts הם מראש צבעונית עם צבע חיוני, ירוק CellTracker, ואתה יכול לראות את המראה של אותם בצד PLA של bilayer. (ד) בסעיף דרך bilayer עם fibroblasts מוכתמים אדומים על פני השטח PHBV נמוך fibroblasts מוכתמים ירוקים על פני השטח PLA העליון. (ה) Fibroblasts מראש צבעונית עם אדום CellTracker גדל על פני השטח PHBV. השימוש של צבעי ניאון חיוניים מספק מתודולוגיה נוח להסתכל חלוקת תאים על הפיגום תוך התאים עדיין גדלים. אפשר להשתמש באופן שגרתי אלה צבעים לפחות 7 ימים. עם זאת ריכוז של צבע הופך להיות מדולל כמו התאים להתחלק. ברים בקנה מידה שוות 0.1 מ"מ.g6.jpg "alt =" איור 6 "/>
איור 6. תכונות ביומכנית של electrospun פיגום מתקבלים באמצעות Electroforce בוס מכשיר tensiometer (א '). (ב) סטרס / מתח פיתולי PLGA פיגומים עיקור על ידי קרינה גמא, אלכוהול, חומצה peracetic, או מיוצר בסביבה נקייה מחיידקים. שלוש מדידות ניתן לקבל גרף כגון: מתח מתיחה האולטימטיבי (UTS) שאליו סיבים יכולה להיות נתונה לפני שהוא נשבר, מתח מתיחה האולטימטיבי מודולוס יאנג. זה האחרון נותן אינדיקציה האלסטיות של הפיגום. (ג) האפקט של כל שיטה עיקור על סיבים בקוטר PLGA ב מיקרומטר. כל מתודולוגיה עיקור ירד UTS. גם חומצה peracetic ו קרינה גמא להקטין מודולוס של צעירים לתת פיגום גמיש יותר אלכוהול עושה פיגום פריך במיוחד. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .איור 7. נתון זה מראה את השימוש בבלון פשוט לספק bioreactor biaxial שבו פיגומים (ותאים הגדלים בתוך הפיגומים) יכולה להיות נתונה distension biaxial לתקופות של זמן. (א) הבלון מרוקן שעליו electrospun סיבים, PHBV, הופקדו. בשלב זה הבלון מכוסה חלקית עם סיבים. (ב) בלון מצופה באופן מלא עם PHBV ו PLA סיבים. (C) מתלה התא pipetted שוב ושוב על הבלון. (ד) הבלון ממוקם בתוך בקבוק של התקשורת סטריליים שם את הבלון מחובר משאבת מזרק PBS (משמש אלקטרוליט מנהלים) משמש כדי לנפח בעדינות ולאפשר ניכוי בלון על לוח זמנים מתוכנן. (ה) תאים על פיגומים להיות שהוצאו בלון בסוף הניסוי וניתוח שנערך על כדאיות התא המוצג (ו) בתאים קיימא לפתח צבע כחול כהה באמצעות IND מטבוליתicator 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד. (G) מראה כי תאים (כחול) בתרבית על בלון זה ובכפוף distension biaxial לפתח סיבי האלסטין (ירוק, מוכתם באמצעות נוגדנים ספציפיים האלסטין), ואילו התאים אותם על פיגום זהה (H) בתרבית בתנאים סטטיים יש זניח ייצור האלסטין . ברים הם בקנה מידה שווה 0.025 מ"מ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning היא טכניקה פופולרית מאוד לייצור פיגומים להנדסת רקמות. 14, 15, 16 אמנם זה פשוט יחסית לייצר פיגומים electrospun בסיסיים לשימוש ניסיוני הטכניקה היא גם מורכבת ורבת פנים עם משתנים רבים. 6 ישנם מחקרים רבים המתארים כיצד electrospinning פרמטרים לקבוע פיגום המיוצר. במחקר זה הדגש הוא על ייצור עם אתגרים רבים שלאחר לעשות פיגומים של ארכיטקטורות מתאימים תכונות מכניות לעודד תאים בתוך להם לייצר חלבונים תאיים על מנת להשיג התאמה רקמות להשתלה באדם.
מטרתנו במאמר זה היא לתאר את שיטות לצייד את הקוראים לעצב ולאפיין פיגומים למגוון רחב של מטרות. במאמר זה נתאר את מתודולוגיות לעשות פיגומים מורכבים עבה לעקר פיגומים לשימוש ניסיוני הקליני. כמו כן, אנו מתארים הדמיה גאמות על פיגומים ו אינדוקציה של ייצור סיבי האלסטין על ידי חשיפת תאים distension biaxial.
רבות מהתכונות הרצויות של פיגומים ניתן להשיג פירסום הייצור (כגון חישול כמה שכבות) ו עיקור. אולם אלה בתורו ישפיע על תכונות מכניות של פיגומים. אנו מדווחים כי שיטות עיקור כל נוטים לשנות את חוזק מתיחה האולטימטיבי מודולוס יאנג ובמידות שונות. מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו לעומת קרינה גמא, חומצה peracetic ואתנול על ההשפעות שלהם כמו משטרים המעקרים פוטנציאליים PLGA פיגומים 9 ההשפעות השליליות של טכניקות עיקור יכול להימנע על ידי ייצור פיגומים בתנאים אספטיים -. האחרון מחייב שימוש cleanroom . משתמשים שונים יכולים לבחור מתודולוגיות שונות, אך כולם צריכים להיות מודעים לכך מתודולוגיות עיקור הנוכחי ישפיע באופן שלילי על המאפיינים של הפיגומים.
ג ulture של תאים על פיגומים משפיעה גם על תכונות מכניות של פיגומים. אינדוקציה של ייצור ECM על ידי חשיפת תאים על פיגומים ל distension biaxial ניתן להשתמש כדי להשפיע על תכונות מכניות.
המתודולוגיה של ספינינג 1 פיגום על פני אחרת לעשות קרום bilayer מובן בקלות אנו מתארים פיגומים bilayer המסוגלים לתמוך שתי אוכלוסיות שונות של תאים מאויר בעיתון זה על ידי תיוג מראש תאים עם שני צבעים גשש חיוניים סלולריים. אלה שימשו כדי להמחיש כי קרום bilayer מושגת המטרה המוצהרת שלה.
לבסוף distension biaxial התקציב המתקן שתואר במחקר זה יכול לשמש כדי לספק מגוון של משטרים. מחזורי, ליניארית, משטרים אקראיים ניתן לתכנת בקלות יישומי. גמישות זו תאפשר למערכת להיות מנוצל עבור רבות מן הבעיות העומדות בפני בהנדסת רקמות כגון חיך שסוע, רצפת האגן, שלפוחית השתן, העור.
"> בספרות הנדסת רקמות שימוש במערכות בדיקה uniaxial עבור תאים culturing על פיגומים דווחה. 4 עם זאת לא הצלחנו למצוא שום ספרות שפורסם להתמודד עם כמה רקמות רכות להגיב distension biaxial. זו גישה פשוטה מראה כי התאים מגיבים distension biaxial עם ייצור של אלסטין -. מרכיב מרכזי של מטריקס תאית אשר נותן הרקמות הרכות רתיעה אלסטית זה נותן אינדיקציה ברורה של כמה רקמות רכות מיזוג כאשר הם גדלים במעבדה מציעה מסלול לייצר רקמות מתאים להשתלה עבור תחומי הגוף שבו הרקמות מקומיים יש גמישות פנימית. זהו אזור שבו פיתוח נוסף יהיה ברור להיות ראוי על ידי הקהילה רקמות הנדסה יצרני bioreactor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים BBSRC למימון PhD עבור ביי פרייזר מר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
