Summary
Electrospun steigers kunnen worden verwerkt post-productie voor tissue engineering toepassingen. Hier beschrijven we methoden voor het spinnen complexe steigers (door opeenvolgende spinnen), voor het maken van dikkere steigers (door meerdere lagen met behulp van warmte of damp gloeien), voor het bereiken van steriliteit (aseptische productie of sterilisatie post-productie) en zorgt voor een juiste biomechanische eigenschappen.
Abstract
Electrospinning is een veel gebruikte en veelzijdige methode om steigers (vaak biologisch afbreekbaar) te produceren voor 3D-tissue engineering. 1, 2, 3 Veel weefsels in vivo biaxiale buik ondergaan in verschillende mate zoals huid-, blaas-, bekkenbodem en zelfs het harde gehemelte als kinderen groeien. Bij de productie steigers voor deze doeleinden is het noodzakelijk steigers geschikte biomechanische eigenschappen ontwikkelen (of verkregen zonder of met cellen) en die steriel voor klinisch gebruik. De focus van dit artikel is niet hoe de fundamentele electrospinning parameters (want er is een uitgebreide literatuur over electrospinning) het opstellen, maar over de manier waarop gesponnen steigers postproductie te passen zodat ze geschikt zijn voor tissue engineering doeleinden - hier dikte, mechanische eigenschappen en sterilisatie (nodig voor klinisch gebruik) worden beschouwd en we hebben ook beschrijven hoe cellen kunnen worden gekweekt op steigers en onderworpen aan biaxiale stam te conditioneren ze voor specifieke toepassingen.
Electrospinning geeft meestal dunne vellen, de electrospinning collector wordt bedekt met isolerende vezels wordt slecht geleidt zodat vezels niet meer borg op. Daarom wordt beschreven benaderingen dikkere structuren produceren door warmte of stoom gloeien verhoging van de sterkte van steigers, maar niet noodzakelijkerwijs de elasticiteit. Sequentiële spinnen van steigers verschillende polymeren complex steigers bereiken is ook beschreven. Sterilisatie methoden kunnen schaden sterkte en elasticiteit van steigers. We vergelijken drie methoden voor de effecten daarvan op de biomechanische eigenschappen van electrospun steigers van poly-melkzuur co-glycolzuur (PLGA).
Imaging cellen op steigers en beoordeling van de productie van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten van cellen op steigers beschreven. Het kweken van cellen op steigers in vitro kan verbeteren steiger de sterkte en elasticiteit, maar de tissue engineering literatuopnieuw blijkt dat cellen vaak niet de juiste ECM produceren wanneer gekweekt onder statische omstandigheden. Er zijn weinig commerciële systemen beschikbaar om te streven cultuur cellen steigers onder dynamische conditioning regimes -. Een voorbeeld is het Bose ElectroForce 3100 kan worden gebruikt om een conditioneringsprogramma op cellen in steigers gehouden mechanisch grijpt in een medium gevulde kamer uitoefenen 4 Een benadering van een begroting celkweek bioreactor voor gecontroleerde vervorming in 2 dimensies wordt beschreven. We tonen aan dat cellen worden geïnduceerd om elastine onder deze omstandigheden. Tenslotte beoordeling van de biomechanische eigenschappen verwerkte steigers gekweekt met of zonder cellen beschreven.
Protocol
1. Electrospinning van Random en uitgelijnd Vezels
Electrospinning zorgt voor fijne vezelachtige netwerken met behulp van elektrische potentieel om een polymeeroplossing de richting van een geaarde collector te trekken. Collectoren kunnen zeer vele vormen en kan statisch zijn of meer gebruikelijk draaien. Het oplosmiddel verdampt voordat de oplossing komt in de collector en de straal stolt tot een vezel.
Elk polymeer vereist zijn eigen set van voorwaarden voor de productie van een bepaald type vezel. De concentratie van het polymeer, het oplosmiddel, de afstand tussen de gepompt oplossing en de geaarde collector, het potentiaalverschil tussen de twee zal de snelheid van de roterende collector, het debiet, de temperatuur en vochtigheid alle invloed electospinning. Er zijn vele studies beschrijven de selectie van electrospinning parameters en hoe deze invloed van de geproduceerde steigers (bijvoorbeeld vezeldiameter, morfologie en oriëntatie). 5, 6, 7, 8In deze experimenten werden gesponnen steigers op omstandigheden geselecteerd in onze eerdere studies. 2, 9
De volgende methoden geschikt voor de productie van electrospun steigers uit PLGA, polymelkzuur (PLA), poly ε-caprolacton (PCL) en poly hydroxybutyraat-hydroxyvaleraat co-(PHBV) met een roterende collector zoals in figuur 1. In het oplosmiddel dichloormethaan (DCM) gebruikt. De methode die hier produceert microfibrous PLGA, PLA en PCL en nanofibrous PHBV steiger met micro-en kleinbedrijf kralen ('parelketting' morfologie).
- Smeer de draaiende doorn collector met aluminiumfolie, met de gepolijste / glanzende kant naar buiten gericht. Onze doorn was 20 cm breed en 10 cm in diameter.
- Bereid polymeeroplossingen, PLA, PCL PHBV zijn als een 10 gewichts% oplossing in DCM. PLGA is als een 20 gewichts% oplossing in DCM.
- Plaats 4 spuiten van 5 ml volume op een injectiepomp. Spuiten worden geladen tot en met contain 5 ml van het polymeer elke, waarbij 20 ml in totaal.
- Voor PLA, PCL-en PHBV gebruik maken van een debiet van 40 μLmin -1 per spuit.
- Voor PLGA gebruik maken van een debiet van 30 μLmin -1 per spuit.
- Voor PLA, PCL-en PLGA gebruik maken van een werkafstand van 17 cm van top van de naald naar doorn.
- Voor PHBV gebruik maken van een werkafstand van 10 cm van top van de naald naar doorn.
- Laad de spuit naalden om +17000 V (73030 P, Genvolt, Shropshire, Verenigd Koninkrijk) en electrospin van de juiste afstand op de aluminium folie beklede doorn.
- Voor willekeurige vezels draaien de doorn 200 rpm.
- Voor lijn vezels draaien de doorn bij 1000 toeren per minuut.
- Stellingen kunnen worden opgeslagen op de aluminium folie onder droge omstandigheden. Aanbevolen opslag in een afgesloten houder bij 4 ° C in aanwezigheid van droogmiddel. In onze ervaring steigers blijven stabiel gedurende tenminste 4 maanden (mogelijk veel langer) onder deze omstandigheden (we zijn niet op de hoogte van pudumping is vastgesteld studies op lange termijn opslag voorwaarden voor steigers).
2. Productie van complexe steigers door Sequential Spinning
Sequentiële spinnen een werkwijze voor het combineren van de eigenschappen van verschillende materialen een materiaal dat de beste eigenschappen van beide te creëren. PHBV produceert een vlakke, dichte, breekbare plaat terwijl PLA-of PCL-spinning produceert een lage dichtheid elastische vellen. Beide materialen ondersteunen celhechting. Achtereenvolgens spinnen deze materialen leidt tot een dichte cellen impermeabel dat elastisch.
- Stel de electrospinning inrichting zoals per afdeling 1, met PHBV draaien voorwaarden.
- Electrospin PHBV hierboven.
- Zonder de aluminiumfolie, electrospin een tweede polymeer on-top met behulp van de parameters en normale omstandigheden voor dat polymeer (bv. 17 cm trommel om de naald, 17000 V, 200 rpm voor PLA). Dit additief proces bouwt een dubbele laag van de steiger het produceren van een dubbellaag.
3. De productie van Meerlaagse Stellingen door thermische behandeling meerdere lagen samen
- Steigers kan uit meerdere lagen met behulp van warmte gloeien. Om dit 4 vellen PLGA worden op elkaar te doen en vervolgens verhit gegloeid bij 60 ° C gedurende 3 uur.
- Steigers kan worden gegloeid damp gloeien. Hier 4 vellen PLGA worden op elkaar en gesuspendeerd 2 cm boven een pool van DCM (10 ml) gedurende 1 uur. Dit wordt uitgevoerd in een afgesloten container bij kamertemperatuur.
4. Aseptische productie en postproductie Sterilisatie van electrospun Stellingen
- Aseptisch steiger worden bewerkstelligd door electrospinning in een aseptische omgeving van een laminaire stroming kap in een clean room. Hiervoor een steriele polymeren van medische kwaliteit of polymeren gesteriliseerd door incubatie in DCM worden gebruikt. Eenmaal opgelost, worden polymeren electrospun op steriele folie gewikkeld om alsterilised doorn. Steigers vervolgens aseptisch behandeld. Steriliteit wordt gecontroleerd door het incuberen van monsters van de steiger in de antibiotica-vrije groeimedia voor de betreffende periode.
- Voor ethanol desinfectie (dit is het gebruik experimenteel maar geen erkende methode sterilisatie die kunnen worden genomen om de kliniek) steigers gekaderd (15 min.) in een 70% v / v oplossing van ethanol in gedestilleerd water. Voor praktische doeleinden experimentele is meestal voldoende om steigers desinfecteren zodat ze vervolgens goed te combineren met gekweekte cellen.
- Voor perazijnzuur sterilisatie steigers ondergedompeld in perazijnzuur (0,1% v / v in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)) en gedurende 3 uur bij kamertemperatuur als beschreven in Selim et al.. 9
- Voor gammasterilisatieproces steigers bestraald met een dosis van 3 kGy met een cesiumbron zoals beschreven in Selim et al.. 9
5. Biomechanische testen van steigers
- Steigers tot rechthoeken zijn versneden 5 mm x 20 mm, gemeten voor de dikte met behulp van een micrometer, en geplaatst in een Bose ElectroForce 3100 instrument. Deze machine past een kracht van 0-22 N tot een verplaatsing van 6 mm en drukt de lading tegen verplaatsing in een spanning / rekcurve. Hierdoor kan de Young's modulus en elasticiteit worden berekend.
6. Visualiseren Cellen op steigers en het inschatten van ECM Production
Cellen kunnen worden gekleurd met vitale fluorescente kleurstoffen die het mogelijk maken een tot cellen op de steigers te zien zoals ze hechten, migreren en zich vermenigvuldigen. Plaats cultuur aanwezigheid van cellen steigers kan worden bepaald door kleuring voor celkernen met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI). De productie van ECM door cellen van de steiger te beoordelen door gekleurde cellen voor een reeks van ECM eiwitten zoals elastine zoals in dit voorbeeld. Alle gebruikte steigers werden gemeten op een hebbendikte van ten minste 0,2 mm en snijd deze in vierkanten van 1,5 cm x 1,5 cm vóór het zaaien.
In deze studies menselijke dermale fibroblasten worden gebruikt in vanwege de rol die zij spelen in reconstructie van weke delen, die ons laboratorium van primair onderzoek belang.
De cellen worden verkregen van de huid monsters van patiënten die een electieve chirurgie voor borstverkleining of buikwandcorrectie (toestemming werd gegeven voor hun weefsel om te worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden). Weefsels worden verzameld en gebruikt anoniem onder Onderzoek Tissue Bank Licence 12179. Weefsels werden gewassen met PBS die streptomycine (0,1 mg / ml) en penicilline (100 IU / ml) en amfotericine B (0,5 pg / ml). Weefselmonsters werden geïncubeerd in 0,1% w / v trypsine en 0,1% glucose in PBS (12-18 uur, 4 ° C). De dermis is afgepeld, gehakt fijn en geïncubeerd met 10 ml collagenase (0,5% w / v in DMEM en 10% FCS, 37 ° C gedurende 18 uur). Centrifugeren van de resulterende cel wieldraagarmenion (400 g 10 minuten), produceert een pellet van cellen die kunnen worden gekweekt en gekweekt in DMEM aangevuld met foetaal kalfserum (FCS, 10% v / v), streptomycine (0,1 mg / ml), penicilline (100 IU / ml) en amfotericine B (0,5 pg / ml). Alleen fibroblasten van de passage 4-9 worden gebruikt in experimenten.
- Human huidfibroblasten eenmaal confluente in een T75 (EasyFlask, Nunc, New York, US) worden geënt door toevoegen van trypsine / EDTA (5 ml 5 mg / ml trypsine, 2 mg / ml EDTA in zoutoplossing), incuberen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De suspensie wordt gecentrifugeerd gedurende 10 minuten (150 g). De cellen worden geresuspendeerd in 5 ml DMEM (aangevuld met FCS (10% v / v), streptomycine (0,1 mg / ml), penicilline (100 IU / ml) en amfotericine B (0,5 pg / ml)) en geteld met behulp van een hemocytometer, en de concentratie wordt aangepast voor het zaaien. Cellen worden uitgezaaid gewoonlijk bij 50.000 cellen per putje.
- Indien gewenst vóór het zaaien cellen op de scaffold kunnen cellen worden gelabelde met CellTracker rood en groen. De cels gewassen met 3 x 5 ml PBS. Een oplossing van 10 mM CellTracker in serumvrij, cel geval medium (10 ml) toegevoegd en de cellen worden geïncubeerd gedurende 45 minuten bij 37 ° C. Na incubatie werden de cellen gewassen in 3 x 5 ml PBS waarna zij worden gezaaid op steigers. Na deze het oppervlak van de stellingen kunnen worden afgebeeld op een Axon ImageExpress microscoop (Molecular Devices, Sunnyvale, VS) 570 nm λex - Xem 620 nm (CellTracker rood) en 480 nm λex - 533 nm Xem (CellTracker groen). Om de penetratie van cellen te onderzoeken dieper stellingen een multiphoton confocale microscoop kunnen worden gebruikt. Dit kan bereikt ongeveer 200 micron penetratie in de meeste steigers met of zonder cellen.
- Plaats kweken worden gefixeerd in 1 ml 3,7% formaldehyde in PBS bij 37 ° C gedurende 20 minuten en vervolgens met 3 x 1 ml PBS.
- 200 pi van elastine primaire antilichamen worden toegevoegd aan elk monster (5% v / v in PBS, konijn anti-humaan alfa elastin, AbDserotec, Kidlington, VK) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Monsters werden gewassen met 3 x 1 ml PBS en vervolgens geïncubeerd in een oplossing van secundair antilichaam (0,5% v / v geit anti-konijn IgG (Fc): FITC) in PBS bevattende DAPI (1 pg / ml) gedurende 30 minuten.
- Vervolgens worden de monsters gewassen met 3 x 1 ml PBS.
- DAPI en secundair antilichaam gekleurde monsters worden vervolgens afgebeeld op een Axon ImageExpress fluorescentiemicroscoop, 365 nm λex - 460 nm Xem voor DAPI en 480 nm λex - 533 nm Xem voor de secundaire antilichaam. DAPI vlekken de kern en maakt het mogelijk om de verdeling van cellen in de vezels zeer goed te zien.
7. Het onderwerpen van Cellen op het schavot aan biaxiale Dynamic Conditioning
Om het effect van dynamische conditioning op fibroblast ECM productie te onderzoeken hebben we een eenvoudige proof-of-concept bioreactor om dit te verkennen.
- Monteer ballon en stroomregulering inrichting en bereiden systeem, zodat het gemakkelijk kan worden geplaatst in een steriele vat voor celkweek eenmaal is bekleed.
- Autoclave de inrichting inclusief de ballon (122 ° C, 220 mbar 1 uur). We kunnen bevestigen dat de ballonnen overleven autoclaveren zonder negatieve gevolgen voor hun functie door het opblazen en laten leeglopen ze herhaaldelijk.
- In een schone kamer, pak het apparaat in een laminaire stroming kap in de positie om electrospun zijn op.
- Blaas de ballon op de gewenste oppervlakte (denk aan de ballon nog moet passen in de cultuur schip) met fosfaat gebufferde zoutoplossing en sluit de PBS op een elektrische aarde op een punt in het apparaat die niet hoeft te zijn steriel (tak pijp op 3-weg kraan).
- Electrospin de gewenste polymeer op de ballon via het normale spinomstandigheden met een werkafstand van 10 cm. Laat de steiger drogen gedurende 1 uur. De 'natte' vezels zijn 'sticky' genoeg om zich te houden aan de brandingace van de ballon, zonder vervolgens los.
- Plaats de ballon in een steriele vat en transporteren naar een laminaire stroming kap voor celkweek.
- Verwijder de ballon vanaf het vaartuig en plaats op een steriele oppervlak (petrischaal) en drukken (20 seconden) Pipetteer celsuspensie (1 x 10 6 cellen in 5 ml DMEM) op de beklede ballon 20 minuten trachten te verdelen cellen gelijkmatig over het oppervlak.
- Plaats ballon in de cultuur vat, en voeg voorverwarmde media afgestemd op het celtype.
- Sluit de inflatie apparaat om een injectiepomp (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, VS) en opblazen / leeglopen van de ballon als nodig is om biaxiale uitzetting te geven. Een computer gestuurde injectiepomp kan worden gebruikt om een meer complexe distensie regeling bereikt.
8. Representatieve resultaten
De volgende cijfers zijn representatief voor de resultaten die kunnen worden verwachtindien bovengenoemde methoden worden gevolgd.
Electrospinning kan worden gebruikt om steigers met willekeurige en geordende architecturen (figuur 1) te creëren, dit is herhaalbare en de vezels zijn uniform. Veel soorten polymeren worden electrospun met kenmerken die kunnen aanzienlijk variëren zoals in figuur 2 PHBV, PLA of PCL. Electrospinning kunnen produceren licht pluizige steigers of dichte cel ondoordringbare membranen (zie figuur 3). Alle steigers hier vergemakkelijkt celhechting en proliferatie. Vroeger werk heeft aangetoond dat cellen door deze steigers migreren tot een diepte van ten minste 5-600 um 9 Voor PLA de gemiddelde vezeldiameter is 3 micrometer;. Voor PHBV is 0.3μm parels variërend 5-20 micrometer; voor PCL is 3 pm, en PLGA is het 11 pm. Andere studies met andere oplosmiddelsystemen melden dat PHBV kan electrospun als vezels zonder kralen of polymeer parels. 10,11
<p class = "jove_content"> Als dikker steigers zijn verplicht damp en warmte gloeien kan gebruikt om lagen van steigers samen te gloeien worden (zie figuur 4). Deze steiger lagen niet delamineren en het kan erg moeilijk zijn om de verbinding tussen de lagen te vinden.We tonen aan dat dubbellaag membranen kunnen worden toegepast wanneer cellen A en B zijn elk gekweekt op een afzonderlijke membraan zonder vermenging zoals weergegeven in figuur 5. Hier laten we zien dit met behulp van menselijke dermale fibroblasten gekleurd met twee verschillende fluorescerende cel tracker kleurstoffen. Een dergelijke dubbellaag membraan nuttig wanneer het kweken van cellen op een harde weefsels zoals bot of kraakbeen aan een zijde gescheiden cellen die een zachte vorm (meestal snelgroeiende) weefsel vormen anderzijds zoals gehemelte reparatie of reconstructieve periodontale chirurgie. 12, 13
Met betrekking tot de gevolgen van de sterilisatie op electrospun steigers hebben weeerder gemeld dat de sterilisatiemethode effecten op de steiger en daaropvolgende celkweek. 9 Dit wordt geïllustreerd in figuur 6 waarin toont de effecten van perazijnzuur, gammabestraling en ethanol de vezeldiameter en treksterkte en elasticiteitsmodulus van PLGA steiger .
Gamma straling heeft geen significant effect op vezeldiameter terwijl perazijnzuur en ethanol vezeldiameter verminderen met ongeveer 50%. Met betrekking tot treksterkte elke sterilisatiemethoden veranderd treksterkte en de elasticiteit van de dragers. Cultuur van de cellen op deze steigers verder verlaagd de ultieme trekspanning, maar verhoogde de elasticiteit.
Tenslotte wordt een methode voor het testen van de werking van dynamische biaxiaal distensie van cellen gekweekt op electrospun steigers gepresenteerd. Deze proof-of-concept benadering laat zien dat cellen levensvatbaar blijven tijdens het dynamischopgezette buik, maar produceren ook verhoogde hoeveelheden van elastine onder deze omstandigheden. Dit in tegenstelling tot de sterk tekort aan elastine wanneer dezelfde cellen op hetzelfde steiger gehandhaafd onder statische condities (zie Figuur 7).
Figuur 1. Toont een cartoon van een electrospinning tuigage en van de spinnen van willekeurige en parallelle vezels en vervolgens lagen van vezels geplaatst over elkaar. Loodrecht vezels kunnen worden gemaakt door electrospinning een reeks opgelijnde vezels op aluminiumfolie draaien, de folie 90 ° en vervolgens onmiddellijk electrospinning een tweede set opgelijnde vezels bovenop deze.
Figuur 2. Toont de morfologie van willekeurige electrospun matten van (A) PLA (schaal bar is 100 micrometer), (B) PHBV (schaal bar is 100 micrometer), (C) PCL (schaal bar is 100 pm) en (D) PLGA (schaalstaaf is 200 pm). Merk op dat PLA, PCL-en PLGA zijn allemaal microfibrous uniform steigers. PHBV wordt gesponnen als een 'parelsnoer' met nanovezels het aansluiten van 5-20 micrometer grote kralen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. De productie van een meerlaagse schavot. Hier worden de steigers worden in eerste instantie gesponnen met behulp van PHBV en dan spuiten gevuld met PLA-of PCL worden gebruikt. Deze worden gesponnen bovenop de PHBV scaffold. De figuur toont de verschijning van deze veelgelaagde steigers, (A) Een enkele PHBV laag, (B) Een dwarsdoorsnede van een PHBV-PLA bilaag, met de dichte nanofibrous, 'parelsnoer' PHBV laag (links) en meer open microfibrous PLA laag (rechts) en (C) Een enkele PLA laag.nk "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.
Figuur 4. Dikkere steigers kan worden door warmte gloeien en damp gloeien. (A) en (B) een doorsnede door een damp gegloeid PLA scaffold waar initiële stapel steigers van ongeveer 150 urn worden geplaatst elkaar en dichloormethaan damp wordt veel dikkere steigers van tot 500 micrometer. In (C) en (D) is te zien dat de steiger bestaat uit lagen veel dikkere vezels afgewisseld met lagen van dunnere vezels die door warmte gloeien lagen dunne en dikke vezels. Deze benadering kan worden gebruikt om steigers van complexe mechanische eigenschappen te produceren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Fi guur 5. Uiterlijk van cellen op een dubbellaag schavot. In alle gevallen de cellen aanwezig zijn menselijke huidfibroblasten. (A) Fibroblasten op electrospun PLA waar de cellen gefixeerd en gekleurd met DAPI. (B) DAPI gekleurde cellen op PHBV. In (C) van de fibroblasten zijn pre-gekleurd met een vitale kleurstof, CellTracker groen, en je kunt het uiterlijk van ze te zien op de PLA kant van de bilaag. (D) A doorsnede door de bilaag rode lood fibroblasten het onderste PHBV oppervlak groene glas fibroblasten de bovenste PLA oppervlak. (E) Fibroblasten vooraf gekleurd met CellTracker rode gegroeid op de PHBV oppervlak. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen vitale een handige werkwijze voor het kijken naar de verdeling van cellen op de steiger terwijl de cellen nog steeds toe. Men kan routinematig gebruik maken van deze kleurstoffen voor minimaal 7 dagen. Maar de concentratie van kleurstof raakt verdund de cellen. Schaalbalken gelijk aan 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Afbeelding 6 "/>
Figuur 6. Biomechanische eigenschappen van electrospun steiger worden verkregen met behulp van een Bose ElectroForce tensiometer apparaat (A). (B) Stress / rek krommen van PLGA steigers gesteriliseerd door gammastraling, alcohol, perazijnzuur of aseptisch geproduceerd. Drie metingen kunnen worden verkregen uit deze grafiek: de uiteindelijke trekspanning (UTS) waarop de vezel kan worden onderworpen voor het breken van de treksterkte rek en de Young's modulus. Dit laatste geeft een indicatie van de elasticiteit van de steiger. (C) het effect van elke sterilisatie methode op PLGA vezeldiameter in um. Elke sterilisatie methode afgenomen UTS. Zowel perazijnzuur en gamma-straling verminderen van de Young's modulus het geven van een meer elastische steiger, alcohol maakt het schavot in het bijzonder broos. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .Figuur 7. Deze figuur toont de toepassing van een eenvoudige ballon een biaxiale bioreactor waarin steigers (en cellen groeien in de steigers) kan aan biaxiale distensie worden onderworpen voor tijdsperioden. (A) leeggelopen ballon waarop electrospun vezels PHBV, zijn gedeponeerd. In dit stadium de ballon gedeeltelijk bedekt met vezels. (B) Een ballon volledig bedekt met PHBV en PLA vezels. (C) een celsuspensie wordt herhaaldelijk gepipetteerd op de ballon. (D) een ballon geplaatst in een fles steriele media waarin de ballon is aangesloten op een injectiespuit pomp PBS (als een geleidende elektrolyt) wordt gebruikt om zacht oppompen en leeglopen van de ballon tegen de geprogrammeerde schema mogelijk. (E) Cellen stellingen worden verwijderd uit de ballon het einde van het experiment en analyse uitgevoerd voor levensvatbaarheid van de cellen getoond in (F) waarin levensvatbare cellen donkerblauw ontwikkelen met metabole indicator 3 - (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide. (G) laat zien dat cellen (blauw) gekweekt op deze ballon en onder voorbehoud van biaxiale uitzetting te ontwikkelen elastine vezels (groen, glas in lood met behulp van elastine specifieke antilichamen), terwijl dezelfde cellen op een identieke steiger (H) gekweekt onder statische omstandigheden te verwaarlozen elastineproductie . Schaalbalken gelijk aan 0,025 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning is een zeer populaire techniek voor het produceren van steigers voor tissue engineering. 14, 15, 16 Ook al is het relatief eenvoudig is om elementaire electrospun steigers te produceren voor experimenteel gebruik van de techniek is ook complex en veelzijdig met veel variabelen. 6 Er zijn veel studies wordt beschreven hoe de electrospinning parameters bepalen het schavot geproduceerd. In deze studie ligt de nadruk op de grote uitdagingen na de productie naar steigers van passende architecturen en mechanische eigenschappen te maken en te stimuleren cellen in hen om extracellulaire eiwitten te maken om weefsel geschikt voor implantatie in de mens te bereiken.
Ons doel in dit artikel is om methoden te beschrijven voor de lezers uit te rusten voor het ontwerpen en steigers karakteriseren voor een breed scala van doeleinden. In dit artikel beschrijven we methoden om complexe en dikker steigers te maken en steigers voor experimentele en klinische gebruik te steriliseren. We beschrijven ook imaging cel op de steigers en de inductie van elastine vezels de productie door het onderwerpen van cellen om biaxiale uitzetting.
Veel van de gewenste eigenschappen van dragers kan worden bereikt na productie (zoals gloeien meerdere lagen) en sterilisatie. Echter deze op zijn beurt invloed op de mechanische eigenschappen van steigers. Wij rapporteren dat de sterilisatie methodes allemaal de neiging om treksterkte en de Young's modulus te veranderen in verschillende mate. Een recente studie van onze vergeleken gammastraling, perazijnzuur en ethanol hun effecten mogelijk steriliserende regimes PLGA steigers 9 nadelige gevolgen van sterilisatie technieken worden vermeden door het produceren van steigers onder aseptische omstandigheden -. Deze vereist het gebruik van een cleanroom . Verschillende gebruikers kunnen kiezen uit verschillende methodes, maar allemaal moeten zich ervan bewust dat de huidige sterilisatie methodologieën negatieve invloed zal hebben op de eigenschappen van de steigers.
C CULTUUR van cellen in de steigers heeft ook invloed op de steigers 'mechanische eigenschappen. Inductie van ECM productie door onderwerpen cellen steigers aan biaxiale uitzetting kan worden gebruikt om de mechanische eigenschappen.
De methodologie van het spinnen een steiger boven het andere om een dubbellaag membraan te maken is gemakkelijk te begrijpen en beschrijven we dubbellaag steigers staat is ondersteuning van twee verschillende populaties van cellen geïllustreerd in dit artikel door pre-labelling cellen met twee vitale cel tracker kleurstoffen. Deze werden gebruikt om te illustreren dat de bilaag membraan het gestelde doel bereikt.
Tot slot de begroting biaxiale uitzetting opstelling beschreven in deze studie kan worden gebruikt om een scala aan regimes te leveren. Cyclische, lineair, en willekeurige regimes kunnen gemakkelijk worden geprogrammeerd en toegepast. Deze veelzijdigheid kan het systeem worden gebruikt voor veel van de problemen bij tissue engineering, zoals gespleten verhemelte, bekkenbodem, blaas en huid.
"> In de tissue engineering literatuur van het gebruik van eenassige het testen van systemen voor het kweken van cellen op steigers is gemeld. 4 Maar we konden geen gepubliceerde literatuur te maken met hoe de zachte weefsels reageren op biaxiale uitzetting te vinden. Deze simpele aanpak laat zien dat cellen reageren op biaxiaal opgezette buik met de productie van elastine -. een belangrijke component van de extracellulaire matrix waardoor zachte weefsels elastische terugslag Dit geeft een duidelijke indicatie van hoe conditioning zachte weefsels als ze groeien in het laboratorium biedt een route voor de productie van weefsels geschikt voor implantatie voor gebieden van het lichaam waar de inheemse weefsels hebben een intrinsieke elasticiteit. Dit is een gebied waar de verdere ontwikkeling zal duidelijk worden verdiend door de tissue engineering gemeenschap en bioreactor fabrikanten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken BBSRC voor de financiering van een doctoraat voor de heer Frazer Bye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
