Инженерные Приверженец бактерии путем создания единого синтетического Curli Operon
Summary
Дизайн синтетических кодирования оперона как секреторный аппарат и структурные мономеры curli волокон описаны. Перепроизводство этих амилоиды и приверженцем полимеров позволяет измеримые усиления приверженности<em> E. палочки</em> Шасси<sup> 1</sup>. Легкий путь, чтобы визуализировать и количественно соблюдение объясняется.
Abstract
Метод, описанный здесь состоит в реорганизации E. палочки соблюдение свойств сборки минимальное число генов curli под контролем сильных и металлом overinducible промоутер, и в визуализации и количественной оценки результате усиления бактериальной адгезии. Этот метод применяется соответствующих инженерных принципов абстракции и стандартизации синтетической биологии, и в результате BBa_K540000 Biobrick (Best новое устройство Biobrick, инженерии, ИГЕМ 2011).
Первый шаг состоит в разработке синтетических оперона посвящена перепроизводства curli в ответ на металл, и, следовательно, в повышении приверженности способности штамма дикого типа. Оригинальный curli оперона была изменена в кремнии с целью оптимизации транскрипции и трансляции сигналов и избежать "естественный" регулирование curli. Такой подход позволил проверить с успехом наших сегодняшних представлений о производстве curli. Moreoveг, упрощение регулирования curli путем переключения эндогенный промотор комплекса (более 10 транскрипционных регуляторов определены) к простой металл-регулируемого промотора делает соблюдение гораздо легче контролировать.
Второй этап включает в себя качественную и количественную оценку соблюдения способностей путем внедрения простых методов. Эти методы применимы для широкого спектра приверженцем бактерий независимо от биологических структур, вовлеченных в формирование биопленок. Соблюдение испытания в 24-луночные планшеты из полистирола обеспечивает быструю предварительную визуализацию бактериальной биопленки после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Этот качественный тест может быть заточена под количественная доля приверженности. Такой метод очень прост, но более точный, чем только кристалл фиолетового окрашивания, как описано ранее 1 с обеих хорошую повторяемость и воспроизводимость. Визуализация GFP с метками бактерии на предметных стеклах с помощью флуоресцентной или лазерного конфOCAL микроскопия позволяет усилить результаты, полученные с 24-луночный планшет теста путем непосредственного наблюдения этого явления.
Introduction
Бактериальные присоединение к абиотическим поддержка играет важную роль в клетках биоремедиации, биокатализа или микробных топлива. Биологическая очистка процессы используют потенциал микроорганизмов разрушать органические вещества, или изменить распределение металла (иммобилизация, испарение) или видообразования. Эти полезной деятельности наблюдается в водных и наземных экосистем, но и в искусственных системах, разработанных для лечения загрязненных вод промышленных и бытовых отходов. Интенсивность и качество микробную активность зависит от физико-химических факторов, но и от образа жизни микроорганизмов (свободно плавающий или встроенный в биопленку). Образование биопленки связано с метаболизмом содействие устойчивости к биоцидов разнообразными механизмами. Это явление, следовательно, необходимо поощрять в большинстве процессов биоремедиации. Кроме того, инженерные клетки кишечной палочки контролировать образование биопленки была успешно применена дляиммобилизации целых клеток датчиков на биочипов 2-3.
Адаптация микроорганизмов к высокой концентрации металлов происходит посредством различных механизмов, таких как адсорбция компонентов внеклеточного матрикса, активация оттока насоса или конкретных носителей в состоянии сконцентрироваться металла в клетке. Повышение этих бактериальных деятельности путем генной инженерии позволяет эффективно и дешево обработки металла загрязнения в лабораторном масштабе, особенно в случае высоко токсичных металлов в слабом количестве, как описано Raghu и соавт. 2008 4. Бактериальное восстановление в данном случае представляет конкурентоспособной и экономия метода по сравнению с классическими химическими процессами использованием ионообменных смол. Авторы описали E. палочки шасси генной инженерии для кобальта поглощения и удержания сначала выбив истечения насоса гена, кодирующего RCNA, а затем путем преобразования с несколькими копии плазмиды позволяет перепроизводстватранспортер с льготным поглощение кобальта. Такая деформация выступает в качестве эффективной альтернативы ионообменных смол для лечения радиоактивных стоков, но ключевым нерешенным вопросом является восстановление загрязненных бактериями в конце процесса 4. Целью нашей работы было, следовательно, инженер специально разработанных деформации в состоянии придерживаться абиотических опор, таких как стекло или пластик.
Среди всего множества адгезины и приверженцем фимбрий, определенных в Грам-бактерии, мы решили разработать систему, позволяющую curli производства. Curli тонкие (2-5 нм в диаметре) и очень агрегатного амилоидные волокна, которые выступают из E. палочка и сальмонелла поверхности, как некристаллических и нерастворимых матрицы 5-7. Curli также принимают участие в колонизации абиотических поверхностях и развития биопленок 8. Curli было недавно показано связывать ионы ртути 9. Амилоиды действительно как известно, обладают высокойсродство ионов металлов, таких как Cu 2 +, Zn 2 + и Fe 3 + 10. Это свойство может дальнейшему совершенствованию дезактивации металла загрязненных сточных вод. РГС кластер отвечает за производство волокон curli и составили из двух разных направлениях транскрипции оперона (рис. 1). CsgB, csgA и csgC гены составляют смысл оперона, кодирующего двух curli подразделений, CsgA и CsgB. CsgC, кажется, участвует в окислительно-восстановительной деятельности в рамках системы биогенеза curli и повлиять на CsgG пор поведение 11. Тем не менее, отсутствие csgC в большинстве curli бактерий, продуцирующих указывает, что соответствующий белок обеспечивает только вторичное уровень контроля над биогенеза curli. Для упрощения системы, мы были выбраны, чтобы работать с минимальным количеством генов.
CsgDEFG operonencodes белков, необходимых в регулировании и транспортировкииз CsgA и CsgB к поверхности клетки. CsgD является транскрипционный активатор csgBAC оперона и играет ключевую роль в управлении образования биопленки, контролируя производство curli фимбрий и другие компоненты биопленки, такие как целлюлоза 12 и путем ингибирования жгутик производства 13. CsgE, CsgF и CsgG представляют собой curli конкретных секреторный аппарат в наружной мембраны, через которую основных субъединицы белка curli CsgA выделяется в виде растворимого белка. Полимеризации CsgA зависит в естественных условиях на мембраносвязанных белков зародышей CsgB (обзор в 14). Комплекс регуляторных путей с участием нескольких двухкомпонентных систем было показано, что контроль curli экспрессии гена 15-16. Эти сложные правила позволяют бактерии образуют биопленки толстой через производство curli в ответ на экологические реплики, но трудно контролировать для промышленного применения. Для облегчения восстановления встретилисьаль-фаршированные бактерий во время производственного процесса, бактериальной фиксации на твердом носителе действительно должна находиться под контролем и определен параметр (ы). Приверженцем свойства curli связаны с их 17 природы амилоида и могут быть использованы для улучшения процессов биоремедиации, но более простой и легко управляемое устройство должно быть создано.
Среди них 7 генов 18, набор из 5 абсолютно необходимы гены curli синтеза (csgB и csgA мономеров кодирования волокна) и экспорта (csgE csgF и csgG, кодирующий комплекс curli секреции) были выбраны для построения синтетического оперона. Чтобы спастись от "естественных" регулирование curli, синтетический оперона, содержащие эти 5 генов РГС под контролем сильных и кобальт-overinducible промотора (рис. 2) был разработан и синтезирован. Шаг за шагом анализа curli кодирования региона и методика расчета для функционального синсинтетических оперона описаны. Два метода для визуализации и количественной оценки бактериальной адгезии к полистирола и стекла объяснил.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Наиболее важным шагом в этом синтетический подход биологии гена дизайна. Синтетический геном дизайн должен быть тщательно для обеспечения эффективной производственной системы. Два гена, кодирующие волокна мономеров и трех генов, кодирующих белки, учас?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим других членов Лион INSA-ENS ИГЕМ команды (Viviane Chansavang, Матильда Дюмон, Александра Дюпре, Мелани Жеффруа, Клеманс Gonthier, Margaux Jaulin, Орели Haag, Goki Ли, Томас Пуансо, берилл Royer-Бертран, Джули Soula, Майкл Vonzy Пьер Ив Зунделя, Soufiane Bouhmadi, Оливье Brette, Гаэль Chambonnier, Лаура Izard, Aurianne Кройс, Филипп Лежен, Аньес Rodrigue, Арно Ронделе, Сильви Reverchon и Валери Desjardin), нашим спонсорам за финансовую поддержку (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon и Департамент биологических наук INSA-Lyon), Ф. Вишневский-краситель для критического чтения этой рукописи и д-р CC Зи для штамма подарок. B. Drogue получает степень доктора философии стипендии от региона Рона-Альпы.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
