방법 논문

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

DOI:

10.3791/4176

⸱

2012년 11월 16일

 ,  ,  ,  , 
1UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, 2Département Biosciences, INSA de Lyon, Université de Lyon, 3INSERM U758, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université de Lyon, 4Laboratoire de Génie Civil et Ingénierie Environnementale, INSA de Lyon, Université de Lyon

이 논문에서

요약

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합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다 E. 대장균 섀시 1. 준수를 시각화하고 정량화하기 쉬운 방법이 설명되어 있습니다.

초록

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여기에 설명 된 방법은 E. 디자인을 변경해에 구성 강하고 금속 overinducible 발기인의 통제하에 curli 유전자의 최소 수를 조립하여, 그리고 세균 준수의 결과 이득을 시각화하고 정량화에 대장균을 준수 속성. 이 방법은 적절한 엔지니어링 추상화의 원리 및 합성 생물학의 표준화 및 BBa_K540000 Biobrick의 결과 (가장 새로운 Biobrick 장치, 설계, iGEM 2011) 적용됩니다.

첫 번째 단계는 야생 타입 스트레인의 준수 능력을 증가에 따라서 금속에 대한 응답으로 curli의 과잉에 전념 합성 오페론의 디자인으로 구성합니다. 원래 curli 오페론은 전사와 병진 신호를 최적화하고 curli의 "자연"규정을 탈출하기 위해 silico에 바뀌 었습니다. 이 방법은 성공 curli 생산의 현재 이해를 테스트 할 수있었습니다. MoreoveR은, 간단한 금속 규제​​ 발기인으로 내생 복잡한 발기인 (10 개 이상의 전사 규제가 확인)를 전환하여 curli 규정을 단순화하는 것은 제어 할보다 쉽게​​ 준수합니다.

두 번째 단계는 간단한 방법의 구현으로 준수 능력의 질적 및 양적 평가를 포함하고 있습니다. 이러한 방법은 biofilm 형성에 관여 생물학적 구조에 관계없이 자기편 박테리아의 큰 범위에 적용됩니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 준수 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 후 세균 biofilm의 빠른 사전 시각화를 제공합니다. 이 질적 시험은 준수의 비율을 정량화하여 날카롭게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 좋은 반복성과 재현성을 모두 이전 한 설명으로 만 크리스탈 바이올렛 염색보다 더 정확합니다. 형광 또는 레이저 믿어으로 유리 슬라이드에 GFP 태그 박테리아의 시각화ocal 현미경은 현상을 직접 관찰하여 24 잘 판 테스트를 얻은 결과를 강화 할 수 있습니다.

서론

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비 생물 적 지원 세균 준수는 bioremediation, biocatalysis 또는 미생물 연료 전지에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Bioremediation 공정은 유기 물질을 저하하거나 금속 분포 (고정, 휘발) 또는 분화를 수정 미생물의 용량을 사용합니다. 이러한 유익한 활동은 산업 및 국내 폐기물의 오염 물을 치료하기 위해 개발 된 인공 시스템에서도 수중 및 지상 생태계에서 관찰하지만 수 있습니다. 미생물 활동의 강도와 품질뿐만 아니라 미생물의 라이프 스타일 (자유 부동 또는 biofilm에 포함)에, physico - 화학 요소에 따라 달라집니다. biofilm 형성은 다양한 메커니즘에 의해 biocides에 대한 저항력을 증진 신진 대사와 연결되어 있습니다. 이러한 현상 따라서 대부분의 bioremediation 프로세스에 권장됩니다. 또한, biofilm 형성을 제어 할 수 엔지니어링 대장균 세포가 성공적으로 적용되었습니다biochips 2-3에서 전체 셀 센서를 고정.

금속의 높은 농도에 대한 미생물의 적응은 셀에 금속을 집중 할 수 다양한 세포 외 기질 구성 요소에 같은 흡착과 같은 메커니즘, 유출 펌프의 작동 또는 특정 이동 통신 사업자를 통해 발생합니다. 유전 공학을 통해이....

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프로토콜

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1. Curli 오페론의 Biobrick 설계 및 합성

  1. 유전자 조직을 결정하고 curli 유전자의 내생 전사와 병진 신호를 현지화. 이러한 정보는 해당 RegulonDB 또는 EcoGene B 등의 전문 데이터베이스에 수집 및 관련 출판물의주의 독서를 통해 완료됩니다. 데이터 관리 및 silico의 preanalysis의는 복제 관리자 소프트웨어를 C로 수행되었다.
  2. 관련 코딩 시퀀스를 선택합니다. curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curlin 분비물 복잡한 인코딩)를위한 다섯 절대적으로 필요한 유전자의 집합은 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. FASTA 형식의 데이터베이스에서 선택한 시퀀스를 추출합니다.
    csgGFE 클러스터는 E.의 안티센스이기 때문에 대장균의 게놈은 그 역 보수 counterp에이 시퀀스를 변환> 프로세스 분자> 분자를 반전 복제 관리자 도구 작업을 사용하여 예술. 기능 "Ligate"(클론> Ligate)을 사용하여 csgBA 뒤에 csgEFG 순서를 붙여 넣습니다.
  3. 해....

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결과

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E.의 야생 타입 CSG 시퀀스의 silico 특수 효과의 전사와 병진 신호의 최적화와 관련된 대장균 K12는 단일 합성 curli 오페론 P RCN-CSG는 그림 3 (보조 데이터의 전체 순서)에 표시된 설계 할 수있다. 프로토콜 2 프로토콜 3 curli 생산과 관련된 준수를 시각화하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 크리스탈 바이올렛 염색 (protocole 2) 각도의 하단에 biofilm 형성을 사용하면 빠르게 보여 질과 보라색 색상 강도의 차이에 의해 그림과 같이 야생 형 스트레인 엔지니어링 부담보다 자기편 것 같습니다 수 있습니다 (그림 4A). 이 질적 접근 방식은 준수의 비율은 엔지니어링 변형 (그림 4B)에서 1.5 배 높은 것으로 나타 정량 측정에 의해 강화된다. quantita의 또한, 정확성 tive 접근 방법은 코발트의 증가 .......

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토론

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중요 단계

이 합성 생물학의 접근에서 가장 중요한 단계는 유전자 디자인입니다. 합성 유전자 디자인은 효율적인 시스템 생산을 보장 할 수 세심한 할 수 있습니다. 핵 유출의 바이오 정화, 자신의 분비 시스템에 관련된 단백질을 인코딩 섬유 단량체 세 유전자를 인코딩 두 유전자는 소설 응용 프로그램을위한 새로운 기능 단위를 만들려면 강력한 금속 inducible 발기인으로 조립되었습니다. 계획 및 예측,이 장치는 매체에 코발트의 양을 증가에 의해 강화하는 향상된 높은 curli 생산,로 연결됩니다. 선택한 발기인 (P rcnA)에 해당 전사 신호, 그리고 효율적인 병진 신호 모두의 존재의 이러한 성공 결과는 curli 유전자의 각 세트 (csgBA 및 csgEFG) (그림 3 참조) 앞에 추가되었습니다. 또한, multicopy 플라스미드, 관심과 함께 작업 할 때 발기인 컨트롤에 관련된 레귤레이터.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

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우리는 리옹 인사 - 엔터프라이즈 네트워크의 iGEM 팀 (Viviane Chansavang, 마틸다 Dumond, 알렉산더 Duprey, 멜라니 Geffroy, Clémence Gonthier, 마고 Jaulin, 아루 레이 하겐, Goki 리, 토마스 Poinsot, 베릴 Royer - 버트 란드, 줄리 Soula, 마이클 Vonzy의 다른 회원들에게 감사 , 피에르 이브 Zundel, Soufiane Bouhmadi, 올리비에 Brette, 게일 Chambonnier, 로라 Izard, Aurianne Kroiss, 필립 Lejeune, 아그네스 Rodrigue, 아르노 Rondelet, Sylvie Reverchon와 발레리 Desjardin)의 재정적 인 지원을위한 후원자 (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation 인사, 엔터프라이즈 네트워크 - 리옹 (Lyon)과 Biosciences 인사 - 리옹 (Lyon)의 부), 중요한이 원고의 읽기, 스트레인 선물 박사 CC의 Sze를위한 F. Wisniewski - 염료. 작살 줄에 달린 부표 B.는 박사 학위를받은 지역 론 알프에서 교제.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
pIG2 합성 P RCN이 포함 된 3,165 BP EcoRI / PstI 조각과 pUC57 (pMB1 오라, 2710 BP) - csgBAEFG 오페론을, 앰프 연구
pUC18 앰프 R, (pMB1 오라, 2686 BP) Multicopy 플라스미드
S23 SSC1 (= GFP 태그 MG1655, CC Sze의 선물) / pIG2
S24 SSC1/pUC18
CoCl 2 시그마 0,1 M 주식 솔루션은 실온에서 보관
M63 29
24 잘 판 Nunc 55,429 폴리스티렌 24 잘 접시

참고문헌

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  1. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  2. Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
  3. Melamed, S.

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재인쇄 및 허가

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태그

CurliGFPClone Manager

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