Engineering adhærerende bakterier ved at skabe en enkelt syntetisk Curli Operon

Summary

Udformningen af ​​en syntetisk operon kodende både den sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer i curli fibre er beskrevet. Overproduktion af disse amyloider og adhærente polymerer giver en målbar gevinst for vedhæftning af den<em> E. coli</em> Chassis¹. Nemme måder at visualisere og kvantificere vedhæftning forklares.

Abstract

Den her beskrevne fremgangsmåde består i at omlægge E. coli-adhærensegenskaber ved at samle det mindste antal curli gener under kontrol af en stærk og metal-overinducible promotor og i visualisere og kvantificere den resulterende forstærkning af bakteriel vedhæftning. Denne metode gælder passende tekniske principper om abstraktion og standardisering af syntetisk biologi, og resultater på BBa_K540000 Biobrick (Bedste nye Biobrick enhed, manipuleret, iGEM 2011).

Det første trin består i udformningen af ​​den syntetiske operon helliget curli overproduktion som reaktion på metal, og dermed at øge vedhæftningen evner af vildtypestammen. Den oprindelige curli operon blev ændret i silico for at optimere transkriptionelle og translationelle signaler og undslippe den "naturlige" regulering af curli. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at teste med succes vores nuværende forståelse af curli produktion. Moreover, forenkle curli regulering ved at skifte den endogene kompleks promotor (mere end 10 transkriptionelle regulatorer identificeret) til et enkelt metal-reguleret promotor gør vedhæftning meget lettere at kontrollere.

Det andet trin omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering af overholdelse evner ved implementering af simple metoder. Disse fremgangsmåder er anvendelige til en lang række af adhærente bakterier uanset biologiske strukturer involveret i biofilmdannelse. Overholdelse test i 24-brønds polystyrenplader giver en hurtig indledende visualisering af den bakterielle biofilm efter krystalviolet farvning. Dette kvalitative test kan skærpes ved kvantificering af den procentdel af overholdelse. En sådan fremgangsmåde er meget enkel men mere præcis end kun krystalviolet farvning som beskrevet tidligere ¹ med både en god reproducerbarhed. Visualisering af GFP-mærkede bakterier på objektglas ved fluorescens eller laser confOcal mikroskopi tillader at styrke de opnåede resultater med den 24-brønds plade test ved direkte observation af fænomenet.

Introduction

Bakteriel tilslutning til abiotisk support spiller en vigtig rolle i bioremediering, biokatalyse eller mikrobiel brændselsceller. Bioremediering processer benytter kapacitet mikroorganismer til at nedbryde organiske stoffer, eller at ændre metalfordeling (immobilisering, flygtiggørelse) eller artsbestemmelse. Disse gavnlige aktiviteter er observeret i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer er udviklet til at behandle forurenet vand fra industri og husholdninger affald. Intensiteten og kvaliteten af ​​den mikrobielle aktivitet afhænger af fysisk-kemiske faktorer, men også af livsstil af mikroorganismer (fritflydende eller indlejret i biofilm). The biofilmdannelse er forbundet med en metabolisme fremme resistens over for biocider ved forskellige mekanismer. Dette fænomen vil derfor fremmes i de fleste bioremediering processer. Desuden har engineering Escherichia coli-celler til kontrol af biofilmdannelse er blevet anvendt med succes tilimmobilisere helcelle-sensorer på biochips ^2-3.

Tilpasning af mikroorganismer til høj koncentration af metaller sker via forskellige mekanismer såsom adsorption til ekstracellulære matrixkomponenter, aktivering af udstrømningspumpe eller specifikke bærere i stand til at koncentrere metallet ind i cellen. Fremme disse bakterielle aktiviteter via genteknologi muliggør effektiv og billig behandling af metal forurening i laboratorieskala, især i tilfælde af meget toksiske metaller i svag mængde som beskrevet af Raghu et al. 2008 ^4. Bakteriel rensning repræsenterer i dette tilfælde en konkurrencedygtig og omkostningsbesparende fremgangsmåde i forhold til klassiske kemiske processer ved hjælp af ionbytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis gensplejset for cobalt optagelse og retention ved først at banke det efflukspumpen kodende gen rcnA og derefter ved transformation med en multi kopi plasmid tillader overproduktion af ettransportør med præferentiel optagelse for cobalt. sådan stamme vises som et effektivt alternativ til ionbytterharpikser til behandling af radioaktivt spildevand, men et centralt uløst problem er genvinding af forurenede bakterier ved afslutningen af processen ^4. Målet med vores arbejde var derfor at konstruere en specialdesignet stamme i stand til at holde sig til abiotiske bærere såsom glas eller plastik.

Blandt hele sættet af adhæsiner og klæbende fimbriae identificeret i Gram-bakterier, valgte vi at designe et system, der giver curli produktion. Curli er tynde (2-5 nm diameter) og stærkt aggregative amyloid fibre, der rager ud fra E. coli and Salmonella overflade som en ikke-krystallinsk og uopløselig matrix ^5-7. Curli er også involveret i koloniseringen af abiotiske overflader og udvikling af biofilm ^8. Curli blev for nylig vist at binde kviksoelvionerne ^9. Amyloider er faktisk kendt for at besidde højaffinitet for metaller ioner, såsom ^{Cu2 +, Zn2 +} og ^{Fe3 + 10.} Denne egenskab kan yderligere forbedre dekontaminering af metal forurenede spildevand. CSG klynge er ansvarlig for produktionen af curli fibre og er udgøres af to divergerende transkriberede operoner (figur 1). The CSGB, csgA og csgC gener udgør den forstand operon, der koder for de to curli underenheder, CsgA og CSGB. CsgC synes at være involveret i redox aktivitet inden for curli Biogenese systemet og påvirke CsgG pore adfærd ^11. Imidlertid fravær af csgC i de fleste curli-producerende bakterier indikerer, at det tilsvarende protein indeholder kun en sekundær grad af kontrol over curli biogenese. At forenkle systemet har vi valgt at arbejde med det mindste antal gener.

Den csgDEFG operonencodes proteiner, essentielle i forordningen og transportaf CsgA og CSGB til celleoverfladen. CsgD er en transskriptionel aktivator ifølge den csgBAC operonen og spiller en central rolle i kontrollen af biofilmdannelse ved at styre produktionen af curli fimbriae og andre biofilm komponenter såsom cellulose ¹² og ved inhibering af flagel fremstilling ^13. CsgE, CsgF og CsgG udgør en curli-specifikt sekretorisk apparat ydermembranen, hvorigennem det store curli underenhedsprotein CsgA udskilles som et opløseligt protein. Polymerisationen af CsgA afhænger in vivo af membranbundne kimdannelsesmiddel protein CSGB (gennemgået i ^14). Komplekse regulatoriske veje, der involverer flere to-komponentsystemer er blevet vist at styre curli genekspression ^15-16. Disse komplekse regler tillader bakterier til dannelse af tykke biofilm via curli produktion som reaktion på miljømæssige signaler, men er vanskelige at styre til industrielle anvendelser. For at lette inddrivelsen af ​​The Metal-fyldte bakterier i en industriel proces, bakteriel fastgørelse til en fast bærer faktisk skal kontrolleres af veldefinerede parametre (ne). De adhærerende egenskaber curli hænger sammen med amyloid art ¹⁷ og kan anvendes til at forbedre bioremediering processer, men en enklere og let styret anordning skal oprettes.

Blandt disse syv gener ^18, absolut et sæt af 5 kræves gener for curli syntese (CSGB og csgA kodende fibre monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, der koder for curli sekretion komplekset) blev udvalgt til konstruktion af syntetiske operon. At undslippe den "naturlige" regulering af curli, en syntetisk operon omfatter disse 5 CSG ​​gener under kontrol af en stærk og kobolt-overinducible promotor (figur 2) blev designet og syntetiseret. Trin-for-trin analyse af curli-kodende region og design procedure for en funktionel SYNæstetiske operon beskrives. To metoder til at visualisere og kvantificere bakteriel vedhæftning til polystyren og glas er forklaret.

Protocol

1. Biobrick Design og syntese af Curli Operon Bestemme den genetiske organisation og lokalisere de endogene transkriptionelle og translationelle signaler fra curli gener. Disse informationer er samlet i specialiserede databaser, såsom RegulonDB a eller EcoGene b og afsluttet med en nærlæsning af relevante publikationer. Datastyring og in silico preanalysis blev udført med Clone Manager c.. Vælge de relevante kodende sekvenser. Et sæt på fem absolut n?…

Representative Results

In silico annotation af vildtype CSG-sekvensen af E. coli K12 forbundet med optimering af transkriptionelle og translationelle signaler har gjort det muligt at udforme enkelt syntetisk curli operon P RCN-CSG vist i figur 3 (fuld sekvens i supplerende data). Protokol nr. 2 og protokol 3, blev anvendt til at visualisere og kvantificere overholdelse er forbundet med curli produktion. Med krystalviolet farvning på 24-brønds polystyrenplader (protocole 2) biofilmdannelse…

Discussion

Kritiske trin

Det mest kritiske skridt i denne syntetisk biologi tilgang er gen design. Syntetisk gen design skal være omhyggelig for at sikre et effektivt system produktion. To gener, der koder fiber monomerer og tre gener, der koder proteiner involveret i deres sekretionssystem er samlet med en stærk og metal-inducerbar promotor for at skabe en ny funktionel enhed til en ny applikation: bio-dekontaminering af nuklear spildevand. Som planlagt og forudsagt, denne enhed fører til en forbedret…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pIG2			pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18			Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23			SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl2	Sigma		0,1M stock solution kept at Room Temperature
M63			29
24-well plate	Nunc	55429	Polystyrene 24-well plates