एक एकल सिंथेटिक Curli ओपेरोन बनाना द्वारा पक्षपाती जीवाणु इंजीनियरिंग
Summary
एक सिंथेटिक operon एन्कोडिंग दोनों स्रावी तंत्र और curli फाइबर के संरचनात्मक monomers के डिजाइन में वर्णित है. इन amyloids और पक्षपाती पॉलिमर के overproduction के पालन के एक औसत दर्जे का लाभ देता है<em> ई. कोलाई</em> हवाई जहाज़ के पहिये<sup> 1</sup>. आसान पालन के लिए कल्पना और मात्रा ठहराना तरीके से व्याख्या कर रहे हैं.
Abstract
यहाँ वर्णित विधि redesigning ई. में शामिल कोली द्वारा एक मजबूत और धातु overinducible प्रमोटर के नियंत्रण नीचे curli जीनों की न्यूनतम संख्या कोडांतरण, और visualizing और बढ़ाता बैक्टीरियल पालन के परिणामस्वरूप लाभ में पालन गुण. इस विधि अमूर्त के उपयुक्त इंजीनियरिंग के सिद्धांतों और सिंथेटिक जीव विज्ञान के मानकीकरण, और BBa_K540000 Biobrick में परिणाम (सर्वश्रेष्ठ नई Biobrick डिवाइस, इंजीनियर, 2011 iGEM) लागू होता है.
1 कदम सिंथेटिक धातु के लिए जवाब में curli overproduction के लिए समर्पित operon की डिजाइन में होते हैं, और इसलिए जंगली प्रकार के तनाव के पालन क्षमताओं को बढ़ाने में. मूल curli operon सिलिको में संशोधित किया गया था क्रम में transcriptional और translational संकेतों का अनुकूलन और curli का "प्राकृतिक" विनियमन बच. इस दृष्टिकोण के लिए सफलता के साथ हमारे curli उत्पादन के वर्तमान समझ का परीक्षण करने के लिए अनुमति दी. Moreover, एक साधारण धातु विनियमित प्रमोटर अंतर्जात जटिल प्रमोटर (10 से अधिक transcriptional नियामकों की पहचान) स्विचन द्वारा curli विनियमन सरल बनाने के पालन को नियंत्रित करने के लिए बहुत आसान बना देता है.
दूसरे चरण के सरल तरीकों के कार्यान्वयन द्वारा पालन क्षमताओं के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन शामिल हैं. इन विधियों पक्षपाती बैक्टीरिया की एक बड़ी जैविक biofilm गठन में शामिल संरचनाओं की परवाह किए बिना श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं. 24 अच्छी तरह polystyrene प्लेटें में पालन परीक्षण क्रिस्टल बैंगनी धुंधला हो जाना के बाद जीवाणु biofilm के एक त्वरित प्रारंभिक दृश्य प्रदान करता है. इस गुणात्मक परीक्षण पालन के प्रतिशत की मात्रा का ठहराव से तेज किया जा सकता है. इस तरह की एक विधि बहुत आसान है, लेकिन केवल क्रिस्टल बैंगनी धुंधला हो जाना है के रूप में पहले दोनों एक अच्छा repeatability और reproducibility साथ 1 वर्णित की तुलना में ज्यादा सटीक है. गिलास स्लाइड पर GFP टैग जीवाणुओं की प्रतिदीप्ति या लेजर conf विज़ुअलाइज़ेशनocal माइक्रोस्कोपी प्लेट 24 अच्छी तरह से परीक्षण के साथ घटना के प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा प्राप्त परिणामों को मजबूत बनाने के लिए अनुमति देता है.
Introduction
अजैव का समर्थन करने के लिए बैक्टीरियल पालन bioremediation biocatalysis, या माइक्रोबियल ईंधन कोशिकाओं में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. Bioremediation प्रक्रियाओं सूक्ष्मजीवों की क्षमता का उपयोग करने के लिए कार्बनिक पदार्थ को नीचा, या धातु (स्थिरीकरण औटना) वितरण या प्रजातीकरण संशोधित. इन लाभकारी गतिविधियों जलीय और स्थलीय पारितंत्रों में मनाया जाता है, लेकिन यह भी कृत्रिम औद्योगिक और घरेलू कचरे के प्रदूषित पानी के उपचार के लिए विकसित प्रणालियों में. और माइक्रोबियल गतिविधि की गुणवत्ता तीव्रता लेकिन सूक्ष्मजीवों के भी जीवन शैली (मुक्त अस्थायी या biofilm में एम्बेडेड) पर भौतिक रासायनिक कारकों पर निर्भर करते हैं. biofilm गठन एक biocides विविध तंत्र द्वारा प्रतिरोध चयापचय को बढ़ावा देने के साथ जुड़ा हुआ है. यह घटना इसलिए सबसे bioremediation प्रक्रियाओं में प्रोत्साहित किया जाएगा. इसके अलावा, इंजीनियरिंग Escherichia कोलाई कोशिकाओं biofilm गठन को नियंत्रित करने को सफलतापूर्वक किया गया है करने के लिए लागू2-3 biochips पूरे सेल सेंसर स्थिर.
धातुओं के उच्च एकाग्रता के लिए सूक्ष्मजीवों के अनुकूलन बाह्य मैट्रिक्स घटकों को सोखना के रूप में विविध तंत्र, तपका पंप के सक्रियण या विशिष्ट वाहक सेल में धातु ध्यान केंद्रित करने में सक्षम के माध्यम से होता है. जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से इन बैक्टीरिया गतिविधियों को बढ़ाने प्रयोगशाला पैमाने पर धातु के प्रदूषण के कुशल और सस्ते उपचार की अनुमति देता है, रघु एट अल द्वारा वर्णित के रूप में कमजोर मात्रा में अत्यधिक विषाक्त धातुओं के मामले में विशेष रूप से 4 2008. बैक्टीरियल remediation इस मामले में एक प्रतिस्पर्धी और लागत बचत शास्त्रीय रासायनिक आयन एक्सचेंज रेजिन प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए तुलना विधि का प्रतिनिधित्व करता है. लेखक एक ई वर्णित कोलाई न्याधार आनुवंशिक बाहर दस्तक तपका पंप एन्कोडिंग जीन rcnA, और फिर परिवर्तन के द्वारा एक बहु की नकल के साथ एक के प्लाज्मिड अनुमति देता है overproduction कोबाल्ट तेज और पहली प्रतिधारण इंजीनियरकोबाल्ट के लिए तेज के साथ तरजीही ट्रांसपोर्टर तनाव आयन एक्सचेंज रेजिन के लिए एक कुशल वैकल्पिक रेडियोधर्मी प्रवाह के इलाज के रूप में प्रकट होता है, लेकिन एक प्रमुख अनसुलझे मुद्दे 4 की प्रक्रिया के अंत में दूषित जीवाणुओं की वसूली है. इसलिए हमारे काम का उद्देश्य था एक तनाव कस्टम डिजाइन कांच या प्लास्टिक के रूप में अजैव समर्थन करने के लिए छड़ी करने में सक्षम इंजीनियर.
ग्राम बैक्टीरिया में पहचान adhesins और पक्षपाती fimbriae के पूरे सेट के बीच, हम एक curli उत्पादन की अनुमति प्रणाली डिजाइन करने के लिए चुना है. Curli (2-5 एनएम व्यास) पतली और अत्यधिक योगात्मक ई. से amyloid फाइबर कि बहर कर रहे हैं कोलाई और साल्मोनेला की सतह के रूप में एक गैर क्रिस्टलीय और अघुलनशील मैट्रिक्स 5-7. भी Curli अजैव सतहों और 8 biofilms के विकास के उपनिवेश में शामिल कर रहे हैं. Curli हाल ही में पारा आयनों BIND 9 के लिए दिखाया गया है. Amyloids वास्तव में उच्च अधिकारी करने के लिए जाना जाता है2 घन के रूप में धातु आयनों के लिए आत्मीयता, Zn 2 + और 3 Fe 10 +. इस संपत्ति आगे धातु प्रदूषित अपशिष्ट का परिशोधन में सुधार हो सकता है. CSG क्लस्टर curli फाइबर के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है और दो divergently लिखित operons (1 चित्रा) का गठन किया है. csgB csgA, और csgC जीन भावना operon का गठन, दो curli सब यूनिटों, CsgA और CsgB एन्कोडिंग. CsgC लिए curli biogenesis प्रणाली के भीतर redox गतिविधि में शामिल होने के लिए और 11 ताकना व्यवहार CsgG प्रभावित लगता है. हालांकि, बैक्टेरिया curli बहुमत में csgC के अभाव यह इंगित करता है कि इसी प्रोटीन केवल curli biogenesis पर नियंत्रण के एक secundary स्तर प्रदान करता है. प्रणाली को सरल, हम जीन की न्यूनतम संख्या के साथ काम करने के लिए चुना गया है.
csgDEFG विनियमन और परिवहन में आवश्यक प्रोटीन operonencodesCsgA और CsgB की कोशिका की सतह. CsgD csgBAC operon के transcriptional उत्प्रेरक और biofilm गठन की curli fimbriae और 12 सेलूलोज़ जैसे अन्य biofilm घटकों के उत्पादन को नियंत्रित करने और बाधा कशाभिका उत्पादन 13 से नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. CsgE CsgF, और CsgG है एक curli विशिष्ट बाहरी झिल्ली में स्रावी तंत्र के माध्यम से जो प्रमुख curli सबयूनिट प्रोटीन CsgA घुलनशील प्रोटीन के रूप में secreted है का गठन. के polymerization CsgA झिल्ली ही सीमित nucleator प्रोटीन CsgB (में 14 समीक्षा) vivo में निर्भर है. जटिल विनियामक कई दो घटक प्रणालियों को शामिल रास्ते जीन curli 15-16 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है. इन जटिल नियमों बैक्टीरिया पर्यावरण cues के जवाब में curli उत्पादन के माध्यम से मोटी biofilms रूप करने की अनुमति देते हैं, लेकिन औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रण के लिए मुश्किल हैं. मुलाकात की वसूली की सुविधाएक औद्योगिक प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया अल भरवां, एक ठोस समर्थन करने के लिए जीवाणु निर्धारण वास्तव में अच्छी तरह से परिभाषित पैरामीटर (ओं) के द्वारा नियंत्रित किया जा जरूरत है. उनके amyloid प्रकृति 17 curli के पक्षपाती गुण जुड़े हुए हैं और bioremediation प्रक्रियाओं में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक सरल और आसानी से नियंत्रित डिवाइस के लिए बनाया जा सकता है.
इन 7 18 जीन के बीच, 5 का एक सेट बिल्कुल संश्लेषण curli (csgB और csgA एन्कोडिंग फाइबर monomers) और निर्यात (csgE csgF और csgG, curli स्राव जटिल एन्कोडिंग) के लिए जीन की आवश्यकता सिंथेटिक operon का निर्माण करने के लिए चयन किया गया था. "प्राकृतिक" curli के विनियमन, एक सिंथेटिक एक मजबूत और कोबाल्ट overinducible प्रमोटर (2 चित्रा) के नियंत्रण के तहत इन 5 CSG जीन शामिल बनाया गया था और संश्लेषित operon बच. क्षेत्र curli एन्कोडिंग विश्लेषण कदम दर कदम और एक कार्यात्मक syn के लिए डिजाइन की प्रक्रियाthetic operon वर्णित हैं. कल्पना और polystyrene और कांच के लिए जीवाणु पालन यों दो तरीके से व्याख्या कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
महत्वपूर्ण कदम
इस सिंथेटिक जीव विज्ञान के दृष्टिकोण में सबसे महत्वपूर्ण कदम जीन डिजाइन है. सिंथेटिक जीन डिजाइन करने के लिए एक कुशल प्रणाली उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक किया…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ल्यों iGEM आईएनएसए ENS टीम (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, एलेक्जेंडर Duprey, Mélanie GEFFROY, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie हाग, Goki Ly, थॉमस Poinsot, Beryl रोयेर बर्ट्रेंड, जूली Soula, माइकल Vonzy के अन्य सदस्यों को धन्यवाद , पियरे Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, ओलिवर Brette, Gaël Chambonnier, लौरा Izard, Aurianne Kroiss, फिलिप Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon और Valérie Desjardin), उनके वित्तीय सहायता के लिए हमारे प्रायोजकों (bioMerieux, Assystem, EDF, Fondation आईएनएसए, ENS-Lyon और आईएनएसए ल्यों बायोसाइंसेज के विभाग), इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और डॉ. तनाव उपहार के लिए सीसी Sze के लिए एफ Wisniewski डाई. तैरता पुल बी एक पीएच.डी. प्राप्त Rhône-Alpes क्षेत्र से फैलोशिप.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
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