Engineering tilhenger bakterier ved å opprette en enkelt Syntetisk Curli operon

Summary

Utformingen av en syntetisk operon koding både sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer med curli fibre er beskrevet. Overproduksjon av disse amyloids og vedheftende polymerer tillater en målbar gevinst adhesjon av<em> E. coli</em> Chassis¹. Enkle måter å visualisere og kvantifisere tilslutning forklares.

Abstract

Metoden beskrevet her består i å omstrukturere E. coli tilslutning egenskaper ved montering av minimum antall curli gener under kontroll av en sterk og metall-overinducible promoter, og i å visualisere og kvantifisere den resulterende gevinst på bakteriell tilslutning. Denne metoden gjelder hensiktsmessige tekniske prinsipper av abstraksjon og standardisering av syntetisk biologi, og resultater i BBa_K540000 Biobrick (Beste nye Biobrick enhet, konstruert iGEM 2011).

Det første trinnet består i utformingen av den syntetiske operon viet curli overproduksjon i respons til metall, og derfor i å øke vedheftningen evner av villtype stamme. Den opprinnelige curli operon ble endret i silico for å optimalisere transkripsjonelle og translasjonell signaler og unnslippe den "naturlige" regulering av curli. Denne tilnærmingen lov til å teste med suksess vår nåværende forståelse av curli produksjon. Moreover, forenkle curli regulering ved å bytte den endogene komplekse promoter (mer enn 10 transcriptional regulatorer identifisert) til en enkel metall-regulert promoter gjør tilslutning mye enklere å kontrollere.

Det andre trinnet omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering av etterlevelse evner ved gjennomføring av enkle metoder. Disse metodene anvendes for en lang rekke adherente bakterier uavhengig av biologiske strukturer som er involvert i dannelse av biofilm. Overholdelse test i 24-brønners polystyren plater gir en rask foreløpig visualisering av bakteriell biofilm etter krystallfiolett farging. Denne kvalitative testen kan slipes ved kvantifisering av hvor stor prosentandel av etterlevelse. En slik metode er meget enkel, men mer nøyaktig enn bare krystallfiolett farging som beskrevet tidligere ¹ med både en god repeterbarhet og reproduserbarhet. Visualisering av GFP-merket bakterier på glassplater av fluorescens eller laser confØcal mikroskopi tillater å styrke resultatene oppnådd med den 24-brønns plate test ved direkte observasjon av fenomenet.

Introduction

Bakteriell tilslutning til abiotiske støtte spiller en stor rolle i bioremediering, Biokatalyse eller mikrobiell brenselceller. Bioremediering prosesser bruker kapasiteten til mikroorganismer å degradere organiske stoffer, eller å endre metall fordeling (immobilisering, fordampning) eller artsdannelse. Disse gunstige virksomhet blir fulgt i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer utviklet for å behandle forurenset vann av industrielle og innenlandske avfall. Intensiteten og kvaliteten på mikrobiell aktivitet avhenge fysikalsk-kjemiske faktorer, men også på livsstil av mikroorganismer (frittflytende eller innebygd i biofilm). Biofilmdannelse er assosiert med en metabolisme fremme resistens mot biocider ved ulike mekanismer. Dette fenomenet vil derfor bli oppmuntret i de fleste bioremediering prosesser. Videre har tekniske Escherichia coli-celler for å kontrollere dannelse av biofilm blitt brukt tilimmobilize hel-celle sensorer på biochips ^2-3.

Tilpasning av mikroorganismer for høy konsentrasjon av metaller skjer via diverse mekanismer slik som adsorpsjon til ekstracellulære matriks-komponenter, aktivering av efflukspumpe eller spesifikke bærere kunne konsentrere metallet inn i cellen. Styrking disse bakterielle aktivitetene via genteknologi tillater effektiv og billig behandling av metall forurensningen på laboratorieskala, spesielt i tilfelle av svært giftige metaller i svak mengde som beskrevet av Raghu m.fl.. 2008 ^4. Bakteriell utbedring representerer i dette tilfellet en konkurransedyktig og kostnadsbesparende metode i forhold til klassiske kjemiske prosesser ved hjelp av ionebytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis genmodifisert for kobolt opptak og retensjon første ved å slå ut den efflukspumpe koding genet rcnA, og deretter ved transformasjon med en multi kopi plasmid slik overproduksjon av entransportør med fortrinnsrett opptak for kobolt. slikt stamme vises som et effektivt alternativ til ioneutvekslende å behandle radioaktive effluent, men en nøkkel uløst problem er utvinningen av forurensede bakterier ved slutten av prosessen ^4. Målet med vårt arbeid har derfor vært å konstruere en spesialdesignede belastning i stand til å holde seg til abiotiske støtter som glass eller plast.

Blant hele settet av adhesiner og tilhenger fimbriae identifisert i Gram-bakterier, valgte vi å utforme et system som tillater curli produksjon. Curli er tynne (2-5 nm diameter) og svært aggregative amyloid fibre som stikker fra E. coli og Salmonella overflaten som et ikke-krystallinsk og uoppløselig matrise ^5-7. Curli er også involvert i koloniseringen av abiotiske overflater og utvikling av biofilm ^8. Curli ble nylig vist å binde kvikksølv ioner ^9. Amyloids er faktisk kjent for å ha høyaffinitet for metallioner som Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} og Fe ^{3 + 10.} Denne egenskapen kan ytterligere forbedre rensing av metall forurensede utslipp. CSG klyngen er ansvarlig for produksjonen av curli fibre og er konstituert av to divergently transkriberte operons (figur 1). Den csgB, csgA og csgC gener utgjør den forstand operon, koding de to curli subenheter, CsgA og CsgB. CsgC synes å være involvert i redoks aktivitet innen curli biogenesis systemet og påvirke CsgG pore oppførsel ^11. Imidlertid indikerer fravær av csgC i de fleste curli-produserende bakterier som tilsvarende protein gir bare en sekundær nivå av kontroll over curli biogenesis. For å forenkle systemet, har vi blitt valgt til å jobbe med minimum antall gener.

Den csgDEFG operonencodes proteiner essensielle i reguleringen og transportav CsgA og CsgB til celleoverflaten. CsgD er en transkripsjonen aktivator av csgBAC operonen og spiller en sentral rolle i kontrollen av biofilmdannelse ved å kontrollere produksjonen av curli fimbriae og andre biofilmprosesser komponenter som cellulose ¹² og ved å hemme flagellum produksjonen ^13. CsgE, CsgF og CsgG utgjør en curli-spesifikk sekretoriske apparat i den ytre-membran hvorigjennom store curli subenhetsprotein CsgA utskilles som et oppløselig protein. Polymerisasjon av CsgA er avhengig i vivo på membranen-bundet nucleator proteinet CsgB (gjennomgått i ^14). Komplekse regulatoriske trasé involverer flere to-komponent systemer har vist seg å kontrollere curli genekspresjon ^15-16. Disse komplekse regelverk tillate bakterier å danne tykke biofilmer via curli produksjon i respons til miljømessige signaler, men er vanskelig å kontrollere for industrielle applikasjoner. For å lette utvinning av metal-fylt bakterier under en industriell prosess, må bakteriell festing til en fast bærer faktisk å bli kontrollert av veldefinert parameter (e). De adherente egenskapene curli er knyttet til deres amyloid natur ¹⁷ og kan brukes til å forbedre bioremediering prosesser, men en enklere og lett kontrollert enhet må skapes.

Blant disse 7 gener ^18, et sett av 5 absolutt nødvendig gener for curli syntese (csgB og csgA koding fiber monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, koding av curli sekresjon komplekset) ble valgt til å konstruere den syntetiske operon. Å unnslippe "naturlige" regulering av curli, et syntetisk operon omfattende disse 5 CSG ​​gener under kontroll av en sterk og kobolt-overinducible promotoren (figur 2) ble designet og syntetisert. Trinn-for-trinn analyse av curli-koding regionen og design prosedyre for en funksjonell synsyntetiske operon er beskrevet. To metoder for å visualisere og kvantifisere bakteriell tilslutning til isopor og glass blir forklart.

Protocol

1. Biobrick Design og syntese av Curli operon Fastslå den genetiske organisasjonen og lokalisere de endogene transkripsjons-og translasjons-signaler av curli gener. Disse opplysninger er samlet i spesialiserte databaser som RegulonDB a eller EcoGene b og fullført av en grundig lesning av relevante publikasjoner. Data management og i silico preanalysis ble utført med Clone Manager c. Velg de aktuelle kodende sekvenser. Et sett av fem helt nødvendige gener…

Representative Results

I silico annotering av villtype CSG sekvens av E. coli K12 knyttet optimalisering av transkripsjons-og translasjons-signaler har tillatt å utforme den enkle syntetiske curli operonen P RCN-CSG vist i figur 3 (full sekvens i utfyllende data). Protokoll 2 og protokoll 3 ble brukt til å visualisere og kvantifisere tilslutning forbundet med curli produksjon. Bruke krystallfiolett flekker på 24-brønners polystyren plater (protocole 2) biofilmdannelse nederst fra hver b…

Discussion

Kritiske trinn

Den mest kritiske trinn i denne syntetiske biologi tilnærming er genet motivet. Syntetisk gen design har å være grundig for å sikre et effektivt system produksjon. To gener som koder for fiber monomerer og tre gener som koder for proteiner involvert i deres sekresjon system er satt sammen med en sterk og metall-induserbar promoter å opprette en ny funksjonell enhet for en ny anvendelse: bio-rensing av kjernefysisk avløp. Som planlagt og spådd, fører denne enheten til en f…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
pIG2			pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18			Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23			SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl2	Sigma		0,1M stock solution kept at Room Temperature
M63			29
24-well plate	Nunc	55429	Polystyrene 24-well plates