Engineering Vidhäftande bakterier genom att skapa en enda syntetisk Curli Operon
Summary
Utformningen av en syntetisk operon kodande både den sekretoriska apparaten och de strukturella monomerer av curli fibrer beskrives. Överproduktion av dessa amyloider och tillhörande polymerer ger en mätbar vinst vidhäftning av<em> E. E. coli</em> Chassi<sup> 1</sup>. Enkla sätt att visualisera och kvantifiera följsamhet förklaras.
Abstract
Den metod som beskrivs här består i omkonstruktion E. coli följsamhet egenskaper genom att montera minsta antalet curli gener under kontroll av en stark och metall-overinducible promotor och att visualisera och kvantifiera vinst av bakteriell vidhäftning. Denna metod gäller lämpliga tekniska principer om abstraktion och standardisering av syntetisk biologi, och resulterar i BBa_K540000 Biobrick (Bästa nya Biobrick enhet, konstruerad, iGEM 2011).
Det första steget består i utformningen av den syntetiska operonet ägnas åt curli överproduktion som svar på metall, och därför öka följsamhet förmågor vildtypsstammen. Den ursprungliga curli operonet ändrades i silico för att optimera transkriptionella och translationella signaler och fly den "naturliga" reglering av curli. Detta tillvägagångssätt gjorde att testa med framgång vår nuvarande kunskap om curli produktion. MoreoveR, förenkla curli regleringen genom omkoppling av endogena komplex promotorn (mer än 10 transkriptionsregulatorer identifieras) till en enkel metall-reglerad promotor gör vidhäftning mycket lättare att kontrollera.
Det andra steget omfattar kvalitativ och kvantitativ bedömning av följsamhet förmågor genom tillämpning av enkla metoder. Dessa metoder är tillämpliga på ett stort antal vidhäftande bakterier oavsett biologiska strukturer är involverade i biofilmbildande. Vidhäftning prov i 24-brunnars polystyrenplattor ger en snabb preliminär visualisering av bakteriell biofilm efter kristallviolett färgning. Denna kvalitativa test kan slipas genom kvantifiering av andelen vidhäftning. Ett sådant förfarande är mycket enkelt men mer exakt än endast kristallviolett färgning såsom beskrivits tidigare 1 med både en god repeterbarhet och reproducerbarhet. Visualisering av GFP-märkta bakterier på glasskivor genom fluorescens eller laser confocal mikroskopi gör det möjligt att stärka de resultat som erhållits med den 24-brunnar test genom direkt observation av fenomenet.
Introduction
Bakteriell vidhäftning till abiotisk stöd spelar en viktig roll i biosanering, biokatalys eller mikrobiell bränsleceller. Bioremediering processer använder kapaciteten hos mikroorganismerna att bryta ner organiska ämnen, eller att modifiera metallfördelning (immobilisering, förångning) eller artbildning. Dessa positiva aktiviteter observeras i akvatiska och terrestra ekosystem, men även i de konstgjorda system som utvecklats för att behandla förorenat vatten av industri-och inhemska avfall. Intensiteten och kvaliteten på den mikrobiella aktiviteten är beroende av fysikalisk-kemiska faktorer, men också på livsstil mikroorganismer (fritt flytande eller inbäddat i biofilm). Den biofilmbildning är associerad med en ämnesomsättning främjar resistens mot biocider genom olika mekanismer. Detta fenomen kommer därför att uppmuntras i de flesta bioremediering processer. Dessutom har tekniska Escherichia coli-celler för att kontrollera biofilm bildning framgångsrikt tillämpats påimmobilisera hela-cell sensorer på biochips 2-3.
Anpassning av mikroorganismer till hög koncentration av metaller sker via olika mekanismer, såsom adsorption till extracellulära matriskomponenter, aktivering av effluxpump eller särskilda bärare som kan koncentrera metallen in i cellen. Öka dessa bakteriella aktiviteter via genetisk ingenjörskonst medger effektiv och billig behandling av metall föroreningar vid laboratorieskala, särskilt i fallet med mycket giftiga metaller i svag mängd såsom beskrivits av Raghu et al. 2008 4. Bakteriell sanering innebär i detta fall en konkurrenskraftig och kostnadsbesparande metod jämfört med klassiska kemiska processer med jonbytarhartser. Författarna beskrev ett E coli chassi konstruerade genetiskt för kobolt upptag och retention först genom att slå ut den effluxpumpen genen rcnA och därefter genom transformation med en multi kopia plasmid möjliggör överproduktion av etttransportör med företrädesrätt upptag för kobolt. sådan stam visas som ett effektivt alternativ till jonbytarhartser för att behandla radioaktivt utsläpp, men en viktig olöst fråga är återvinningen av förorenade bakterier i slutet av processen 4. Målet med vårt arbete var därför att konstruera ett skräddarsytt stam kan hålla sig till abiotisk stöd såsom glas eller plast.
Bland hela uppsättningen av adhesiner och vidhäftande fimbriae identifierats i Gram-bakterier, valde vi att utforma ett system som gör curli produktion. Curli är tunna (2-5 nm i diameter) och mycket aggregativa amyloid fibrer som sticker ut från E. coli and Salmonella yta som en icke-kristallin och olöslig matris 5-7. Curli är också involverade i koloniseringen av abiotiska ytor och utveckling av biofilmer 8. Curli har nyligen visat att binda kvicksilverjoner 9. Amyloider är faktiskt kända för att ha högaffinitet för metaller joner, såsom Cu 2 +, Zn 2 + och Fe 3 + 10. Den här egenskapen kan ytterligare förbättra sanering av metall förorenade utsläpp. CSG klustret är ansvarig för produktionen av curli fibrer och utgöres av två divergent transkriberade operoner (figur 1). Den CSGB, csgA och csgC gener utgör känslan operonet, som kodar för två curli subenheter, CsgA och CSGB. CsgC verkar vara inblandad i redoxaktivitet inom curli biogenes systemet och påverka CsgG por beteende 11. Emellertid indikerar frånvaron av csgC i de flesta curli-producerande bakterier som motsvarande protein ger endast en sekundär nivå av kontroll över curli biogenes. För att förenkla systemet, har vi valt att arbeta med minsta möjliga antal gener.
Den csgDEFG operonencodes proteiner viktiga i regleringen och transportav CsgA och CSGB till cellytan. CsgD är en transkriptionell aktivator av csgBAC operonet och spelar en viktig roll i kontrollen av biofilm bildning genom att kontrollera produktionen av curli fimbrier och andra komponenter biofilm såsom cellulosa 12 och genom att hämma den flagellen produktion 13. CsgE, CsgF och CsgG utgör en curli-specifik sekretorisk anordning i det yttre membran genom vilket den stora curli subenhetsproteinet CsgA utsöndras som ett lösligt protein. Polymerisationen av CsgA är beroende in vivo på det membranbundna proteinet nukleator CSGB (översikt i 14). Komplexa regulatoriska vägar med flera tvåkomponentsystem har visats kontrollera curli genuttryck 15-16. Dessa komplexa regelverk tillåter bakterierna att bilda tjocka biofilmer via curli produktionen som svar på miljöfrågor ledtrådar, men är svåra att kontrollera för industriella tillämpningar. För att underlätta återhämtningen av metal-fyllda bakterier under en industriell process, måste bakteriell fixering till en fast bärare verkligen styras av väl definierad parameter (er). De vidhäftande egenskaper curli är kopplade till deras amyloid natur 17 och kan användas för att förbättra bioremediering processer, men en enklare och lätt styrd anordning måste skapas.
Bland dessa 7 gener 18, en uppsättning av 5 absolut krävs gener för curli syntes (CSGB och csgA kodning monomerer fiber) och export (csgE csgF och csgG, som kodar för curli sekretion komplexet) valdes för att konstruera syntetiska operonet. För att undkomma den "naturliga" reglering av curli, en syntetisk operon innefattande dessa 5 CSG gener under kontroll av en stark och kobolt-overinducible promotorn (Figur 2) utformades och syntetiserades. Steg-för-steg analys av curli-kodande regionen och konstruktion förfarandet för en funktionell syntiska operonet beskrivs. Två metoder för att visualisera och kvantifiera bakteriell vidhäftning till polystyren och glas förklaras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg
Den mest kritiska steget i denna syntetisk biologi tillvägagångssätt är genen design. Syntetisk gen designen måste vara noggrann för att garantera ett effektivt system produktion. Två gener som kodar för fiber monomererna och tre gener som kodar för proteiner som är involverade i deras sekretion system har monterats med en stark och metall-inducerbar promotor för att skapa en ny funktionell enhet för en ny tillämpning: bio-dekontaminering av nukleärt utflödet. Som p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar övriga Lyon Insa-ENS iGEM laget (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Beryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zündel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon och Valérie Desjardin), våra sponsorer för deras ekonomiska stöd (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon och institutionen för biovetenskaper Insa-Lyon), F. Wisniewski-färgämne för kritisk läsning av detta manuskript och Dr CC Sze för stam gåva. B. påfyllningsanordning får en doktorsexamen stipendium från regionen Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
