Summary
Utformningen av en syntetisk operon kodande både den sekretoriska apparaten och de strukturella monomerer av curli fibrer beskrives. Överproduktion av dessa amyloider och tillhörande polymerer ger en mätbar vinst vidhäftning av
Abstract
Den metod som beskrivs här består i omkonstruktion E. coli följsamhet egenskaper genom att montera minsta antalet curli gener under kontroll av en stark och metall-overinducible promotor och att visualisera och kvantifiera vinst av bakteriell vidhäftning. Denna metod gäller lämpliga tekniska principer om abstraktion och standardisering av syntetisk biologi, och resulterar i BBa_K540000 Biobrick (Bästa nya Biobrick enhet, konstruerad, iGEM 2011).
Det första steget består i utformningen av den syntetiska operonet ägnas åt curli överproduktion som svar på metall, och därför öka följsamhet förmågor vildtypsstammen. Den ursprungliga curli operonet ändrades i silico för att optimera transkriptionella och translationella signaler och fly den "naturliga" reglering av curli. Detta tillvägagångssätt gjorde att testa med framgång vår nuvarande kunskap om curli produktion. MoreoveR, förenkla curli regleringen genom omkoppling av endogena komplex promotorn (mer än 10 transkriptionsregulatorer identifieras) till en enkel metall-reglerad promotor gör vidhäftning mycket lättare att kontrollera.
Det andra steget omfattar kvalitativ och kvantitativ bedömning av följsamhet förmågor genom tillämpning av enkla metoder. Dessa metoder är tillämpliga på ett stort antal vidhäftande bakterier oavsett biologiska strukturer är involverade i biofilmbildande. Vidhäftning prov i 24-brunnars polystyrenplattor ger en snabb preliminär visualisering av bakteriell biofilm efter kristallviolett färgning. Denna kvalitativa test kan slipas genom kvantifiering av andelen vidhäftning. Ett sådant förfarande är mycket enkelt men mer exakt än endast kristallviolett färgning såsom beskrivits tidigare 1 med både en god repeterbarhet och reproducerbarhet. Visualisering av GFP-märkta bakterier på glasskivor genom fluorescens eller laser confocal mikroskopi gör det möjligt att stärka de resultat som erhållits med den 24-brunnar test genom direkt observation av fenomenet.
Introduction
Bakteriell vidhäftning till abiotisk stöd spelar en viktig roll i biosanering, biokatalys eller mikrobiell bränsleceller. Bioremediering processer använder kapaciteten hos mikroorganismerna att bryta ner organiska ämnen, eller att modifiera metallfördelning (immobilisering, förångning) eller artbildning. Dessa positiva aktiviteter observeras i akvatiska och terrestra ekosystem, men även i de konstgjorda system som utvecklats för att behandla förorenat vatten av industri-och inhemska avfall. Intensiteten och kvaliteten på den mikrobiella aktiviteten är beroende av fysikalisk-kemiska faktorer, men också på livsstil mikroorganismer (fritt flytande eller inbäddat i biofilm). Den biofilmbildning är associerad med en ämnesomsättning främjar resistens mot biocider genom olika mekanismer. Detta fenomen kommer därför att uppmuntras i de flesta bioremediering processer. Dessutom har tekniska Escherichia coli-celler för att kontrollera biofilm bildning framgångsrikt tillämpats påimmobilisera hela-cell sensorer på biochips 2-3.
Anpassning av mikroorganismer till hög koncentration av metaller sker via olika mekanismer, såsom adsorption till extracellulära matriskomponenter, aktivering av effluxpump eller särskilda bärare som kan koncentrera metallen in i cellen. Öka dessa bakteriella aktiviteter via genetisk ingenjörskonst medger effektiv och billig behandling av metall föroreningar vid laboratorieskala, särskilt i fallet med mycket giftiga metaller i svag mängd såsom beskrivits av Raghu et al. 2008 4. Bakteriell sanering innebär i detta fall en konkurrenskraftig och kostnadsbesparande metod jämfört med klassiska kemiska processer med jonbytarhartser. Författarna beskrev ett E coli chassi konstruerade genetiskt för kobolt upptag och retention först genom att slå ut den effluxpumpen genen rcnA och därefter genom transformation med en multi kopia plasmid möjliggör överproduktion av etttransportör med företrädesrätt upptag för kobolt. sådan stam visas som ett effektivt alternativ till jonbytarhartser för att behandla radioaktivt utsläpp, men en viktig olöst fråga är återvinningen av förorenade bakterier i slutet av processen 4. Målet med vårt arbete var därför att konstruera ett skräddarsytt stam kan hålla sig till abiotisk stöd såsom glas eller plast.
Bland hela uppsättningen av adhesiner och vidhäftande fimbriae identifierats i Gram-bakterier, valde vi att utforma ett system som gör curli produktion. Curli är tunna (2-5 nm i diameter) och mycket aggregativa amyloid fibrer som sticker ut från E. coli and Salmonella yta som en icke-kristallin och olöslig matris 5-7. Curli är också involverade i koloniseringen av abiotiska ytor och utveckling av biofilmer 8. Curli har nyligen visat att binda kvicksilverjoner 9. Amyloider är faktiskt kända för att ha högaffinitet för metaller joner, såsom Cu 2 +, Zn 2 + och Fe 3 + 10. Den här egenskapen kan ytterligare förbättra sanering av metall förorenade utsläpp. CSG klustret är ansvarig för produktionen av curli fibrer och utgöres av två divergent transkriberade operoner (figur 1). Den CSGB, csgA och csgC gener utgör känslan operonet, som kodar för två curli subenheter, CsgA och CSGB. CsgC verkar vara inblandad i redoxaktivitet inom curli biogenes systemet och påverka CsgG por beteende 11. Emellertid indikerar frånvaron av csgC i de flesta curli-producerande bakterier som motsvarande protein ger endast en sekundär nivå av kontroll över curli biogenes. För att förenkla systemet, har vi valt att arbeta med minsta möjliga antal gener.
Den csgDEFG operonencodes proteiner viktiga i regleringen och transportav CsgA och CSGB till cellytan. CsgD är en transkriptionell aktivator av csgBAC operonet och spelar en viktig roll i kontrollen av biofilm bildning genom att kontrollera produktionen av curli fimbrier och andra komponenter biofilm såsom cellulosa 12 och genom att hämma den flagellen produktion 13. CsgE, CsgF och CsgG utgör en curli-specifik sekretorisk anordning i det yttre membran genom vilket den stora curli subenhetsproteinet CsgA utsöndras som ett lösligt protein. Polymerisationen av CsgA är beroende in vivo på det membranbundna proteinet nukleator CSGB (översikt i 14). Komplexa regulatoriska vägar med flera tvåkomponentsystem har visats kontrollera curli genuttryck 15-16. Dessa komplexa regelverk tillåter bakterierna att bilda tjocka biofilmer via curli produktionen som svar på miljöfrågor ledtrådar, men är svåra att kontrollera för industriella tillämpningar. För att underlätta återhämtningen av metal-fyllda bakterier under en industriell process, måste bakteriell fixering till en fast bärare verkligen styras av väl definierad parameter (er). De vidhäftande egenskaper curli är kopplade till deras amyloid natur 17 och kan användas för att förbättra bioremediering processer, men en enklare och lätt styrd anordning måste skapas.
Bland dessa 7 gener 18, en uppsättning av 5 absolut krävs gener för curli syntes (CSGB och csgA kodning monomerer fiber) och export (csgE csgF och csgG, som kodar för curli sekretion komplexet) valdes för att konstruera syntetiska operonet. För att undkomma den "naturliga" reglering av curli, en syntetisk operon innefattande dessa 5 CSG gener under kontroll av en stark och kobolt-overinducible promotorn (Figur 2) utformades och syntetiserades. Steg-för-steg analys av curli-kodande regionen och konstruktion förfarandet för en funktionell syntiska operonet beskrivs. Två metoder för att visualisera och kvantifiera bakteriell vidhäftning till polystyren och glas förklaras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biobrick design och syntes av Curli Operon
- Bestäm den genetiska organisationen och lokalisera de endogena transkriptionella och translationella signaler av curli generna. Dessa informationer är samlade i specialiserade databaser som RegulonDB a eller EcoGene b och kompletteras av en noggrann läsning av relevanta publikationer. Datahantering och in silico preanalysis utfördes med Clone Manager c..
- Välj relevanta kodande sekvenserna. En uppsättning av fem absolut nödvändiga gener för curli syntes (CSGB och csgA kodning monomerer fiber) och export (csgE csgF och csgG, som kodar för Curlin sekretion komplexet) valdes för att konstruera syntetiska operonet. Extrahera valda sekvenserna från databasen i FASTA-format.
Eftersom csgGFE klustret är antisens i E. E. coli-genomet, konvertera denna sekvens till dess omvända komplement counterpkonst med hjälp av Clone Chef verktyg Verksamhet> Process molekyl> Invertera molekyl. Klistra in csgEFG sekvensen bakom csgBA med hjälp av funktionen "ligatet" (klon> ligat). - Tillsätt lämplig promotor. Genom att placera de fem utvalda curli gener under kontroll av promotorn P RCN, är curli förutsägs över producerade i närvaro av kobolt och nickel. RCN locus kodar en effluxpump ansvar för Ni och Co avgiftning (rcnA) och dess besläktade metallo-regulator (rcnR). RcnR kontrollerar uttrycket av rcnA och sin egen gen som svar på Ni och Co 19. Den RCN sekvens omfattande rcnR CDS, var hela RCN intergena regionen plus 41 1. Nukleotiderna rcnA placedin framför csgBAEFG FANTASIFULL sekvensen (figur 1, sekvensen av hela konstruktionen tillhandahålls som kompletterande data).
- Optimera den transkriptionellasignaler. En perfekt ribosombindningsställe (eller perfekt RBS = AAGGAGGTATATA) tillsattes framför det första ATG i csgBA DNA-sekvensen. En andra perfekt RBS lades framför csgEFG sekvensen. Endogen RBS för CSGB och csgF och csgG gener bevaras.
- För att montera iGEM standarder måste enheten flankeras av en standard BioBrick prefix och suffix, som innehåller restriktionsställen för EcoRI, PstI (prefix) och Spe I och Xbal (suffix). Klistra motsvarande sekvenser vid varje ände av anordningen d..
- Eliminera eventuella EcoRI, PstI, Spe I-och Xba I igenkänningsställe i enheten. För att underlätta ytterligare monteringsprocess kan BioBrick delen själv innehåller inte något av dessa restriktionsställen. In silico restriktionsanalys av anordningen avslöjade en Pstl-ställe i csgA sekvensen, en Pstl-ställe i sekvensen rcnRoch ett EcoRI-ställe i csgE genen. Dessa ställen är respektive belägna i position 80 (Mut1), 1340 (Mut2) och 1830 (Mut3) hos anordningen sekvensen (tilläggsdata) och modifierades som följer genom tysta mutationer.
Mut1 Pstl webbplats CTGCAG förändrats CGTCTG
Mut2 Pstl webbplats CTGCAG förändrats CAGCAG
Mut3 EcoRI-stället GAATTC förändrats i GAATT - Kör igenom översättningen simulering med hjälp av programmet Clone Manager (Operation> Process molekyler> Translate molekyler). Använd sekvensen BLAST anpassningen för att verifiera den perfekta homologin mellan vildtyp curli protein och de proteiner som kodas av den syntetiska operonet.
- Beställa syntetiska operonet. Kommersiella gensyntes tjänster är tillgängliga från många företag över hela världen, var vår partner Genecust (Luxemburg). 4 pg av den konstgjorda operonet (3165 bp) erhölls några veckor senare och sätts in pUC57 (pIG2).
2. Visualisera och kvantifiera Vidhäftande bakterier på polystyren
- Fyll varje brunn i en 24-brunnars polystyrenplatta med 2 ml av M63 minimalmedium (glukos 0,2%) och inokulera varje brunn med 106 celler av en odling över natten. Odla bakterier vid 30 ° C under 18 till 48 timmar utan skakning. Varje kolumn (4 brunnar) representerar en modalitet. Tillsätt lämplig mängd kobolt (25 till 100 mM) och antibiotika (ampicillin 100 μg.L -1) vid behov. De 3 första raderna av den 24-brunnars platta används för att kvantifiera de vidhäftande bakterierna genom medelvärdesbildning av 3 upprepningar, är den sista raden vänster används för att visualisera biofilmen.
- För de 3 första raderna av 24-brunnsplattan: för varje brunn, återvinna supernatanten innehållande planktonceller.
- Försiktigt skölja varje brunn med 1 ml M63 och pool 1 ml tvätt med den ursprungliga supernatanten erhålls i 2,2). Denna pool kallas simning celler (= S).
- Återvinn biofilmen i 1 ml Of M63 genom skrapning och pipettera upp och ned (= B). Vortex 15 sek. Uppskatta antalet yt-anslutna och simning bakterier från den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) för att ge vidhäftning procentsats som motsvarar varje modalitet.
- Den procentuella andelen följsamhet beräknas med formeln: BX100 / (3xS + B).
- Endast för den sista raden av 24-brunnar: kasta planktoniska celler.
- Skölj med 1 ml M63 biofilmen som hade utvecklats på botten av plattan.
- Torka den öppna plattan under 1 timme vid 80 ° C.
- Tillsätt 100 | il 20% kristallviolett i 2 minuter i varje brunn följt av omfattande tvättningar med vatten för att visualisera yta-anslutna bakterier.
Tre oberoende analyser (plattor) måste utföras för att säkerställa reproducerbarhet.
3. Visualisera Vidhäftande bakterier på glas genom mikroskopi
- Skaffa en fluorescerande chassi. E. E. coli SCC1 e stam som constitutively uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) med ingen observerbar skillnad från moderstammen MG1655 20 är en lämplig värd för plasmiden bär syntetiska curli operonet.
- Transformera SCC1 med pIG2 plasmiden (= syntetisk curli operonet insatt vid EcoRI / Pstl-stället av pUC57-plasmiden) för att erhålla S23 stammen. Transformera SCC1 med en kontroll-plasmid (pUC18) för att erhålla kontroll stammen S24 21.
- Växa över natten förkulturer av S23 och av kontrollen (S24) stammar vid 30 ° C i M63-medium kompletterat med glukos (0,2%) och ampicillin (100 μg.L -1).
- Inokulera 15 ml av samma medium i petriskålar med 100 | il av förkulturer. Tillsätt en lämplig koncentration av kobolt (dvs. 25 M) och glöm inte den negativa kontrollen utan kobolt. Inför 3 rektangulär täckglas i varje petriskål. Inkubera över natten vid 30 ° C utan skakning.
- Ta bort täckglaset tillbakam petriskålen och försiktigt tömma den. Rengör försiktigt den nedre ytan med en liten bomull grejer impregnerad med 70 ° etanol genom att torka av varje bakteriell återstod. För konfokal observation, rengör båda övre ändar på några millimeter för att möjliggöra ytterligare fixering av täckglaset.
- Vidhäftande bakterier kan visualiseras direkt men snabbt under fluorescensmikroskop, men försiktigt undvika uttorkning av provet.
- För konfokal observation, deponera täckglas på en glasplatta med den övre ytan täcks av biofilmen placeras med framsidan uppåt. Biofilmen täcks sedan med en större täckglas, som är fäst till objektglaset med lack. Invertera konfigurationen så att biofilmen kommer nu att på den undre ytan.
- Placera inställningen under konfokalt lasermikroskop. En rätt Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokalt lasermikroskop användes vid Platim plattformen f..
- Inställning. Excite GFP vid 488 nm, och samla den bakteriella fluorescens i området 500 till 600 nm . Använd 40x oljeimmersionsobjektivet för att förvärva bilder i laserskanning konfokala läge. Scan de övergripande tredimensionella strukturer biofilmer från den fasta ytan till gränsytan med tillväxtmediet, med användning av en steg 1 um.
- Utför tredimensionella projektioner med IMARIS programvara (Bitplane, Zürich, Schweiz). Bestäm biofilm tjocklek av analysen av det genomsnittliga z-värde längs statistiska längsgående sektioner. Kvantifiering av biofilm biovolumes kan extraheras från konfokal z-stackar som beskrivits på annat ställe 22.
en RegulonDB ger mekanistisk information om operon organisationen och deras nedbrytning till transkriptionsenheter, initiativtagare och deras sigma typ, gener och deras ribosombindningsställen, termineringar, bindningsställen för specifika transkriptionsregulatorer samt deras organisation i regulatoriska fraser.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
b. EcoGene databasen innehåller uppdaterad information om E. coli K-12 genomet och proteom sekvenser, inklusive omfattande gen bibliografier. En stor EcoGene fokus varit omprövningen av platser översättning start. http://ecogene.org/
c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
e gåva Chun Chau Sze, Nan Yang tekniska universitet, Singapore.
f Platim mikroskopisk plattform UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In silico annotering av den vilda typen CSG sekvens av E. coli K12 i samband med optimering av transkriptionella och translationella signaler har rätt att utforma den enda syntetiska curli operon P RCN-CSG som visas i figur 3 (fullständig sekvens i kompletterande uppgifter). Protokoll 2 och protokoll 3 användes för att visualisera och kvantifiera anslutning i samband med curli produktion. Använda färgning kristallviolett på 24-brunnars polystyrenplattor (protokoll om 2) biofilmbildning på botten av varje brunn kan vara snabbt visualiseras och det verkar som den vilda stammen är mindre vidhäftande än den manipulerade stammen såsom visas genom skillnaden i lila färg intensitet (Figur 4A). Denna kvalitativa tillvägagångssätt förstärks av kvantitativ mätning som visar att andelen vidhäftning är 1,5 gånger högre i den manipulerade stammen (figur 4B). Dessutom noggrannhet kvantitativa tiva tillvägagångssätt medger mätning av en betydande förstärkning av vidhäftning i närvaro av ökande koncentrationer av kobolt. Faktum i medier med kobolt koncentrationer av 0 pM, 25 pM eller 50 pM, procentsatser av adherenta cellerna når 25%, 30% och 40% respektive (figur 4B). Följsamhet förmågor kan också jämföras med mikroskopi med GFP-märkta bakterier odlas på glasskivor. Epifluorescensmikroskopi observationer (gröna bakterier på svart bakgrund) visar att den manipulerade stammen bildar en flera lager stor aggregat betraktas som en biofilm, medan den vilda stammen bildar endast mikro-kolonier (Figur 5). Konfokalmikroskopi analysen ger en övergripande bild av biofilmen tredimensionella strukturen och bekräftar att den manipulerade stammen är mer vidhäftande, bildar en tätare och tjockare biofilm (Figur 6).
4176fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Curli vildtyp systemet. Curli är gjorda av två monomerer som kodas av CSGB och csgA gener. Tack vare sin signalpeptid är de CsgA och CSGB curli monomerer translokeras över cytoplasmamembranet via Sec-systemet. En specifik maskiner består av 3 huvudkomponenter, nämligen CsgE, CsgF och CsgG tillåter förflyttning av curli monomerer över det yttre membranet.
Figur 2. En stark och kobolt inducerbar-promotor (BBa_K540001). Promotorn P rcnA styrs av den transkriptionella repressor RcnR. Den rcnR genen transkriberas från sin endogena promotor P rcnR, divergent från P rcnA. Närvaron av rcnR gen säkerställer en korrekt förhållande mellan repressorproteiner kopior kontra P rcnA föreskrivanderegionen. I frånvaro av kobolt, binder RcnR till RcnR rutan på DNA och förhindrar fullständig transkriptionell aktivering av nedströms generna. Om den intracellulära koncentrationen av kobolt ökar, förhindrar bindningen av kobolt till RcnR proteinet fixeringen av repressorn till promotorn och den transkriptionella aktiviteten av PrcnA ökar 19.
Figur 3. Den syntetiska curli operonet. Curli gener står under kontroll av P rcnA. Den rcnR genen uttrycks från dess egen promotor bör ge tillräckligt repressom att kontrollera uttrycket av curli gener i ett kobolt beroende sätt. För att undvika periplasmiska trafikstockning på grund av curli monomer överproduktion (CSGB och CsgA) komponenterna i curli specifika sekretion apparater (CsgE, CsgF och CsgG) måste överproduceras också. Lade traductional signaler i dicated i grått (RBS = Perfekt RBS). E = EcoRI X = Xbal S = Sphl P = Pstl Denna syntetiska delen kallas Bba_K540000 tillåter konstruerade stammen att bli anhängare till glas, sand eller plast via curli överproduktion.
Figur 4. Visualisering och kvantifiering av de vidhäftande bakterierna på 24-brunnars polystyrenplatta. A. kristallviolett färgade biofilm bildas av vidhäftande bakterier på polystyren. B. Procent vidhäftning på polystyren av vildtyp och de tekniska stammarna med olika koncentrationer av kobolt. Statistiska skillnader mellan behandlingarna anges med små bokstäver (variansanalys och Fishers minsta signifikanta skillnad test, P <0,05).
76/4176fig5.jpg "alt =" Bild 5 "/>
Figur 5. Epifluorescensmikroskopi bilder av vidhäftande GFP-märkta bakterier på glasskivor. Bakterier är grönt på en svart bakgrund. Pilarna pekar på mikrokolonier.
Figur 6. Konfokal microscropy biträdd tredimensionella rekonstruktioner av biofilm struktur på glasskivor: A. Top view rekonstruktioner B. Side view rekonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
Den mest kritiska steget i denna syntetisk biologi tillvägagångssätt är genen design. Syntetisk gen designen måste vara noggrann för att garantera ett effektivt system produktion. Två gener som kodar för fiber monomererna och tre gener som kodar för proteiner som är involverade i deras sekretion system har monterats med en stark och metall-inducerbar promotor för att skapa en ny funktionell enhet för en ny tillämpning: bio-dekontaminering av nukleärt utflödet. Som planerat och förutspått leder denna enhet till en förbättrad hög curli produktion, som förstärks genom att öka mängden kobolt i mediet. Sådan framgång beror förekomsten av båda dessa transkriptionella signaler i den valda promotorn (P rcnA) och de effektiva translationella signaler läggs framför varje uppsättning av curli gener (csgBA och csgEFG) (se figur 3). Dessutom, när man arbetar med ett multikopie-plasmid, uppmärksamhet måste ägnas åt antalet kopior av regulatorn (er) involverade i promotorn kontrollen. Här, var multicopies av den huvudsakliga regulatorn RcnR av den använda promotorn (P rcnA) tillhandahålls från samma plasmid (figur 3).
Begränsningar, eventuella ändringar
För att säkerställa en perfekt reproducerbarhet har följsamhet testet alltid utföras i samma märke av polystyren plattor (se tabell). Fluorescensmikroskopi är lättare med fluorescerande-märkta stammar, men detta krav kan övervinnas genom användning av fluorescerande färgämnen såsom Syto, eller plasmid som bär lac-GFP fusioner 23. Bakteriell fastsättning abiotisk ytor såsom polystyren och glas beror på jonstyrkan eller osmolariteten hos mediet. De bästa resultaten erhålles vanligen i minimalt medium eller utspädd LB 22, 24.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter behärska denna teknik
innehåll "> Metoden som beskrivs här för att kvantifiera bakteriell vidhäftning är snabb och billig. emellertid att karakterisera ett stort antal stammar eller odlingsbetingelser, och / eller för att erhålla en detaljerad strukturell karakterisering av biofilmer, hög genomströmning metod baserad på konfokal laserscanning mikroskopi i kombination med användning av 96-brunnars mikrotiterplattor måste beaktas 25.Den MBEC screeningssystem, tidigare Calgary biofilmanordningen 26 kan också användas. Detta system är baserat på användningen av en mikrotiterplatta med ett borttagbart lock som håller 96 peggar substrat möjliggör mikroskopiska observationer av biofilm struktur 27, eller kvantifiering av celler i biofilm efter störningar genom sonikering på en grundvattennivån sonikator (Den MBEC hög kapacitet ( HTP) Analys, Innovotech, Edmonton, Kanada). Ett annat system, biofilm Ring Test, övervakar hur inerta paramagnetiska pärlor ingår i odlingsmediet immobiliseras under bildandetav biofilmen 28, och kan användas för att kvantifiera biofilmbildande. MBEC och biofilm Ring Test kräver särskilda material som är dyrare än grundläggande förbrukningsvaror som används i denna studie.
Betydelse av tekniken i förhållande till befintliga metoder
För att skapa en enda oberoende curli operon, försökte vi två metoder parallellt: en syntetisk metod som beskrivs här, och en klassisk metod med mutagenes för att avlägsna interna EcoRI och PstI restriktionsställen och PCR-stegen följs av ligeringar. Båda tillvägagångssätten påbörjats på samma gång, men sekvensanalys av operonet erhålles genom den klassiska metoden avslöjade oönskade mutationer. Därför har syntes av anordningen varit mer effektiv och snabbare än klassisk kloning och förfaranden mutagenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar övriga Lyon Insa-ENS iGEM laget (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Beryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zündel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon och Valérie Desjardin), våra sponsorer för deras ekonomiska stöd (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon och institutionen för biovetenskaper Insa-Lyon), F. Wisniewski-färgämne för kritisk läsning av detta manuskript och Dr CC Sze för stam gåva. B. påfyllningsanordning får en doktorsexamen stipendium från regionen Rhône-Alpes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S.
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
