Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

doi: 10.3791/4176 Published: November 16, 2012

Summary

Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van de

Abstract

De hier beschreven methode bestaat in E. herontwerpen coli hechting eigenschappen door het monteren van de minimum aantal Curli genen onder de controle van een sterke en metaal overinducible promoter en het visualiseren en kwantificeren van de winsten van bacteriële hechting. Deze methode is van toepassing geschikte engineering principes van abstractie en standaardisatie van de synthetische biologie, en de resultaten in de BBa_K540000 BioBrick (Beste nieuwe BioBrick apparaat, ontworpen, iGEM 2011).

De eerste stap bestaat uit het ontwerp van de synthetische operon gewijd aan Curli overproductie in reactie op metaal en derhalve het vergroten van de hechting mogelijkheden van de wild type stam. De oorspronkelijke Curli operon werd gewijzigd in silico om transcriptionele en translationele signalen te optimaliseren en te ontsnappen aan de "natuurlijke" regulering van Curli. Deze aanpak mag testen met succes ons huidige begrip van Curli productie. Moreover, de vereenvoudiging van de regelgeving Curli door over te schakelen van de endogene complex promotor (meer dan 10 transcriptionele regulatoren geïdentificeerd) om een ​​eenvoudige metaal-gereguleerde promotor maakt de naleving veel makkelijker te controleren.

De tweede stap bestaat uit kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van de naleving vaardigheden door de uitvoering van eenvoudige methoden. Deze methoden zijn van toepassing op een breed scala van het aanklevende bacteriën ongeacht biologische structuren die betrokken zijn bij biofilmvorming. Hechting test in 24-well platen polystyreen een snelle eerste visualisatie van de bacteriële biofilm na kristalviolet kleuring. Deze kwalitatieve test kan worden versterkt door de kwantificering van het percentage hechting. Een dergelijke werkwijze is zeer eenvoudig maar nauwkeuriger dan alleen kristalviolet kleuring zoals eerder beschreven met een zowel een goede herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Visualisatie van GFP-gelabelde bacteriën op glas dia's met behulp van fluorescentie of laser confokale microscopie maakt het mogelijk om het versterken van de resultaten verkregen met de 24-well plaat test door directe waarneming van het fenomeen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bacteriële hechting aan abiotische ondersteuning speelt een belangrijke rol in bioremediatie, biokatalyse of microbiële brandstofcellen. Bioremediatie processen gebruiken de capaciteiten van microorganismen aan organische stoffen afgebroken, of de metaalverdeling (immobilisatie vervluchtiging) of vorming wijzigen. Deze gunstige activiteiten worden waargenomen in aquatische en terrestrische ecosystemen, maar ook in de kunstmatige systemen ontwikkeld om vervuild water van industrieel en huishoudelijk afval te behandelen. De intensiteit en de kwaliteit van de microbiële activiteit afhankelijk fysisch-chemische factoren, maar ook van de levensstijl van micro-organismen (vrij zwevende of ingebed in biofilm). De biofilmvorming is gekoppeld aan een metabolisme bevorderen weerstand tegen biociden door verschillende mechanismen. Dit fenomeen zal dan ook worden aangemoedigd in de meeste bioremediatie processen. Bovendien heeft techniek Escherichia coli cellen om de biofilmvorming regelen succes toegepast opimmobiliseren whole-cell sensoren op biochips 2-3.

Adaptatie van microorganismen aan hoge concentratie van metalen plaatsvindt via diverse mechanismen, zoals adsorptie aan extracellulaire matrixcomponenten, activering van efflux pomp of specifieke dragers het metalen concentreren in de cel. Stimuleren deze bacteriële activiteiten via genetische manipulatie maakt een efficiënte en goedkope behandeling van metalen verontreiniging op laboratoriumschaal, vooral in het geval van zeer toxische metalen in zwakke hoeveelheid beschreven door Raghu et al.. 2008 4. Bacteriële sanering is in dit geval een concurrerende en kostenbesparing methode ten opzichte van klassieke chemische processen met ionenwisselaarharsen. De auteurs beschrijven een E. coli chassis genetisch gemanipuleerde voor kobalt opname en retentie eerst door het uitschakelen van de efflux pomp coderende gen rcnA en door transformatie met een multi-kopie plasmide zodat overproductie van eentransporter met preferentiële opname van kobalt. dergelijke stam wordt als een efficiënt alternatief ionenuitwisselingsharsen te behandelen radioactief afvalwater, maar een belangrijk onopgelost probleem is het herstel van besmette bacteriën aan het einde van het proces 4. Het doel van ons werk was dan ook om ingenieur een op maat ontworpen stam staat om naar de abiotische dragers zoals glas of plastic.

Onder de hele set van adhesinen en aanhanger fimbriae die in Gram-bacteriën, kozen we ervoor om een ​​systeem waarbij Curli productie te ontwerpen. Curli dun (2-5 nm diameter) en zeer aggregatieve amyloid vezels die uitsteken uit de E. coli en Salmonella oppervlak als niet-kristallijne en onoplosbare matrix 5-7. Curli zijn ook betrokken bij de kolonisatie van abiotische oppervlakken en de ontwikkeling van biofilms 8. Curli werd onlangs aangetoond binden kwikionen 9. Amyloïden zijn inderdaad bekend dat bezit zijn van hogeaffiniteit voor metalen ionen, zoals Cu 2 +, Zn2 + en Fe3 + 10. Deze eigenschap kan een verdere verbetering van de sanering van metalen vervuilde afvalwater. CSG cluster is verantwoordelijk voor de productie van Curli vezels en is samengesteld uit twee divergent getranscribeerd operons (figuur 1). De CSGB, csgA en csgC genen vormen de zin operon, coderen voor de twee Curli subeenheden, CsgA en CSGB. CsgC lijkt betrokken bij redox activiteit binnen het Curli biogenese systeem en beïnvloeden CsgG porie gedrag 11. De afwezigheid van csgC in de meeste Curli producerende bacteriën dat het desbetreffende eiwit alleen een secundair niveau van controle over de Curli biogenese biedt. Vereenvoudiging van het systeem, hebben we gekozen om te werken met een minimum aantal genen.

De csgDEFG operonencodes eiwitten essentieel in de regulering van en het transportvan CsgA en CSGB naar het celoppervlak. CsgD is een transcriptionele activator van het csgBAC operon en speelt een belangrijke rol bij de controle van biofilmvorming door het regelen van de productie van Curli fimbriae en biofilm componenten zoals cellulose en 12 remmen de productie 13 flagellum. CsgE, CsgF en CsgG vormen Curli specifieke secretoire inrichting in de buitenmembraan waardoor grote Curli subeenheideiwit CsgA wordt uitgescheiden als een oplosbaar eiwit. De polymerisatie van CsgA hangt in vivo op de membraangebonden eiwit CSGB kiemvormer (beoordeeld in 14). Complexe regulerende pathways die verschillende tweecomponentensystemen is aangetoond Curli genexpressie controleren 15-16. Deze complexe regelgeving de bacteriën te dikke biofilms via de Curli productie als reactie op omgevingsfactoren vormen, maar zijn moeilijk te controleren voor industriële toepassingen. Om het herstel van de status van marktgericht te vergemakkelijkenbacteriën al-gevuld in een industrieel proces, bacteriële bevestiging aan een vaste drager is inderdaad worden door goed gedefinieerde parameter (s). De hechtende eigenschappen van Curli verbonden met hun aard amyloid 17 en kan worden gebruikt om bioremediatie te verbeteren echter eenvoudiger en eenvoudig te bedienen inrichting moet worden gecreëerd.

Onder deze 7 genen 18, een set van 5 absoluut vereist genen voor Curli synthese (CSGB en csgA codeert voor fiber monomeren) en uitvoer (csgE csgF en csgG, codeert de Curli secretie complex) werden geselecteerd om de synthetische operon construeren. Om de "natuurlijke" regulering van Curli, een synthetisch operon bestaat uit deze 5 CSG ​​genen onder de controle van een sterke en kobalt-overinducible promotor (figuur 2) is ontworpen en gesynthetiseerd ontsnappen. De stap-voor-stap analyse van de Curli-coderende regio en de ontwerpprocedure voor een functionele synsynthetische operon beschreven. Er zijn twee methoden om te visualiseren en te kwantificeren bacteriële naleving van polystyreen en glas worden toegelicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. BioBrick Design en Synthese van de Curli Operon

  1. Bepaal de genetische organisatie en lokaliseer endogene transcriptionele en translationele signalen van de Curli genen. Deze informatie wordt verzameld in gespecialiseerde databases zoals RegulonDB a of EcoGene b en aangevuld met een zorgvuldige lezing van relevante publicaties. Gegevensbeheer en in silico preanalysis werden uitgevoerd met Clone Manager software c.
  2. Selecteer de relevante coderende sequenties. Een reeks van vijf absoluut vereist genen voor Curli synthese (CSGB en csgA codeert voor fiber monomeren) en uitvoer (csgE csgF en csgG, codeert de Curlin secretie complex) werden geselecteerd om de synthetische operon construeren. Extraheer de sequenties gekozen uit de database in FASTA formaat.
    De csgGFE cluster antisense in E. coli genoom, zet deze volgorde in zijn omgekeerde complement counterpkunst met behulp van de Clone Manager gereedschappen Operations> Process molecuul> Omkeren molecuul. Plak de csgEFG volgorde achter csgBA met behulp van de functie "Ligeer" (Clone> Ligeer).
  3. Voeg de juiste promoter. Door de vijf geselecteerde Curli genen onder controle van de promoter P RCN worden Curli voorspeld dat overproductie in aanwezigheid van kobalt en nikkel. De RCN locus codeert voor een efflux-pomp die verantwoordelijk is voor Ni en Co ontgifting (rcnA) en zijn verwante metallo-regulator (RCNR). RCNR de expressie van rcnA en eigen gen in reactie op Ni en Co 19. De RCN sequentie die RCNR CDS, de gehele RCN intergeen gebied plus de 41 eerste nucleotiden van rcnA was placedin voor de csgBAEFG chimère sequentie (Figuur 1, de sequentie van het gehele construct wordt als aanvullende gegevens).
  4. Optimaliseer de transcriptionelesignalen. Een perfect ribosoombindingsplaats (RBS of perfect = AAGGAGGTATATA) werd voor de eerste ATG de csgBA DNA sequentie. Een tweede perfect RBS toegevoegd voor het csgEFG sequentie. Endogene RBS voor de CSGB en csgF en csgG genen werden geconserveerd.
  5. Om iGEM normen passen, moet het apparaat worden geflankeerd door een standaard BioBrick prefix en suffix, met restrictieplaatsen voor EcoRI, Pstl (prefix) en Spe I en Xbal (achtervoegsel). Plak de overeenkomstige sequenties aan elk uiteinde van de inrichting d.
  6. Elimineren EcoRI, PstI, Spe I en Xba I herkenningsplaats in het apparaat. Om verdere montage te vergemakkelijken, kan de BioBrick deel zelf geen van deze restrictieplaatsen. In silico restrictieanalyse van de inrichting onthulde een Pst I site in de csgA sequentie, een Pst I site in de volgorde RCNRen een Eco RI site in de csgE gen. Deze plaatsen worden respectievelijk in positie 80 (Mut1), 1340 (Mut2) en 1830 (Mut3) van de inrichting sequentie (aanvullende data) en werden als volgt gewijzigd worden door stille mutaties.
    Mut1 PstI CTGCAG veranderd CGTCTG
    Mut2 PstI CTGCAG veranderd CAGCAG
    Mut3 Eco RI-plaats GAATTC veranderd in GAATT
  7. Ren door de vertaling simulatie met behulp van de Clone Manager-software (Bewerking> Process moleculen> Vertaal moleculen). Gebruik de sequentie uitlijningsprogramma BLAST de perfecte homologie tussen het wild type eiwit en Curli de eiwitten gecodeerd door het synthetische operon verifiëren.
  8. Bestel de synthetische operon. Commerciële gensynthese services die beschikbaar zijn van tal van bedrijven over de hele wereld, onze partner was Genecust (Luxemburg). 4 ug van de kunstmatige operon (3165 bp) werden enkele weken later ontvangen en opgenomen in pUC57 (pIG2).

2. Visualiseer en Adherent Bacteriën Kwantificeer op polystyreen

  1. Vul elke well van een 24-wells plaat polystyreen met 2 ml van M63 minimaal medium (0,2% glucose) en beënt elk putje met 106 cellen van een overnachtcultuur. Bacteriën groeien bij 30 ° C voor 18 tot 48 uur zonder schudden. Elke kolom (4 wells) vertegenwoordigt een modaliteit. Voeg de juiste hoeveelheid kobalt (25 tot 100 mM) en antibiotica (ampicilline 100 μg.L -1) indien nodig. De eerste 3 rijen van de 24-well plaat gebruikt om de hechtende bacteriën kwantificeren door het gemiddelde van 3 herhalingen, wordt de laatste rij links gebruikt om de biofilm visualiseren.
  2. Voor de eerste 3 rijen van de 24-well plaat: voor elke wel, herstelt het supernatant dat het planktonische cellen.
  3. Zorgvuldig goed spoelen met elk 1 ml M63 en het zwembad van het 1 ml wassen met de initiële supernatant verkregen in 2.2). Deze pool wordt aangeduid als swimming cellen (= S).
  4. Herstel de biofilm in 1 ml of M63 door schrapen en en neer te pipetteren (= B). Vortex 15 sec. Schatten hoeveel oppervlak aangebracht en zwemmen bacteriën uit de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) om de hechting percentage overeenkomt met elke modaliteit geven.
  5. Het percentage hechting wordt berekend met de formule: BX100 / (3x + B).
  6. Alleen voor de laatste rij van de 24-well plaat: gooi planktonische cellen.
  7. Spoelen met 1 ml van de M63 biofilm die waren ontwikkeld op de bodem van de plaat.
  8. Droog de open plaat gedurende 1 uur bij 80 ° C.
  9. Voeg 100 ul van 20% crystal violet gedurende 2 min in elk putje gevolgd door uitgebreid wassen met water om het oppervlak-ingeschreven bacteriën visualiseren.
    Drie onafhankelijke assays (platen) worden uitgevoerd om reproduceerbaarheid te garanderen.

3. Visualiseer Adherent Bacteriën op Glas door Microscopie

  1. Hier krijg je een tl-chassis. De E. coli stam die SCC1 e constitutively expressie green fluorescent protein (GFP) met geen waarneembaar verschil van de stam MG1655 20 is een geschikte gastheer voor de plasmide dat de synthetische Curli operon.
  2. SCC1 transformeren met plasmide pIG2 (= synthetische operon Curli ingevoegd op de Eco RI / Pst I plaats van het plasmide pUC57) de stam S23 verkrijgen. SCC1 transformeren met een controle plasmide (pUC18) aan de controlestam verkrijgen S24 21.
  3. Groeien overnacht precultures van de S23 en de controle (S24) stammen bij 30 ° C in M63 medium aangevuld met glucose (0,2%) en ampicilline (100 μg.L -1).
  4. Inoculeer 15 ml van hetzelfde medium in petrischalen met 100 ul van de precultures. Voeg de juiste concentratie van kobalt (dwz 25 uM) en niet te vergeten de negatieve controle zonder kobalt. Introduceer 3 rechthoekige glazen dekglaasje in elke petrischaal. Incubeer overnacht bij 30 ° C zonder schudden.
  5. Fro Verwijder de dekglaasjem de petrischaal en zorgvuldig uitlekken. Reinig de onderkant van het gezicht met een klein katoenen materiaal geïmpregneerd met 70 ° ethanol door afvegen van elke bacteriële residu. Voor confocale observatie reinig beide boveneinden van enkele millimeters verder bevestiging van het dekglaasje mogelijk.
  6. Adherent bacteriën kunnen direct, maar al snel worden gevisualiseerd onder fluorescentiemicroscoop, maar zorgvuldig voorkomen dat ze uitdrogen van het monster.
  7. Voor confocale observatie, stort het dekglaasje op een glasplaatje met het bovenvlak onder de biofilm geplaatst boven. De biofilm wordt vervolgens bedekt met een grotere dekglaasje, die is bevestigd aan het objectglaasje met vernis. Keer de setup, zodat de biofilm wordt nu op de onderste gezicht.
  8. Plaats de setup onder de confocale laser microscoop. Een recht Axioplan2 LSM510 (Zeiss) confocale laser microscoop werd gebruikt bij de Platim platform f.
  9. Instellen. Excite GFP bij 488 nm en verzamel de bacteriële fluorescentie in het bereik van 500 tot 600 nm . Gebruik 40x olie-immersie objectief voor het verwerven van beelden in laser scanning confocale modus. Scan de totale driedimensionale structuren van de biofilms van het vaste oppervlak het raakvlak met het groeimedium, met een stap van 1 urn.
  10. Voer driedimensionale projecties met IMARIS software (bitvlak, Zürich, Zwitserland). Bepaal biofilm dikte van de analyse van de gemiddelde z-waarde langs statistische longitudinale secties. Kwantificering van biofilm biovolumes kan worden gewonnen uit confocale z-stacks zoals beschreven elders 22.

een RegulonDB geeft mechanistische informatie over operon organisatie en decompositie in transcriptie-eenheden, promoters en hun sigma type, genen en hun ribosoombindingsplaatsen, terminators, bindingsplaatsen van specifieke transcriptionele regulatoren, alsmede de organisatie in regulerende zinnen.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

b De EcoGene database bevat actuele informatie over de E. coli K-12 genoom en proteoom sequenties, inclusief uitgebreide gen bibliografieën. Een belangrijke EcoGene focus is de herevaluatie van vertaal startplaatsen. http://ecogene.org/

c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

e Gift van Chun Chau Sze, Nan Yang Technische Universiteit, Singapore.

f Platim microscopisch platform UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In silico annotatie van het wild-type CSG volgorde van E. coli K12 geassocieerd met optimalisatie van transcriptionele en translationele signalen is toegestaan ​​ontwerp van de interne synthetische operon Curli P RCN-CSG getoond in figuur 3 (volledige sequentie in aanvullende data). Protocol nr. 2 en Protocol nr. 3 werden gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren naleving in verband met Curli productie. Met kristalviolet kleuring op 24-well platen polystyreen (protocole 2) biofilmvorming onderaan elk putje kan snel en gevisualiseerd blijkt dat de wild type stam minder aanhangend dan de gemanipuleerde stam zoals blijkt uit het verschil in paarse kleur intensiteit (Figuur 4A). Deze kwalitatieve benadering wordt versterkt door kwantitatieve meting waaruit blijkt dat het percentage hechting is 1,5 keer hoger in de gemanipuleerde stam (Figuur 4B). Bovendien, de nauwkeurigheid van de kwantitatieve tieve benadering maakt meting van een aanzienlijke versterking van de hechting in aanwezigheid van toenemende concentraties van kobalt. Inderdaad, in media met kobalt concentraties van 0 uM, 25 uM en 50 uM, percentages van hechtende cellen te bereiken 25%, 30% en 40% respectievelijk (Figuur 4B). De naleving van vaardigheden kunnen ook worden vergeleken met behulp van microscopie met GFP-gemerkte bacteriën gegroeid op glasplaatjes. Epifluorescentiemicroscopie waarnemingen (groene bacteriën op zwarte achtergrond) blijkt dat de gemanipuleerde stam een groot aantal lagen aggregaat als een biofilm dat de wild type stam vormt slechts micro-kolonies (Figuur 5) vormt. Confocale microscopie analyse geeft een overzicht van de biofilm driedimensionale structuur en bevestigt dat de gemanipuleerde stam meer hechtende, die een dichtere en dikkere biofilm (figuur 6).

4176fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Curli wild-type systeem. Curli zijn gemaakt van twee monomeren gecodeerd door de CSGB en csgA genen. Dankzij hun signaalpeptide, worden de CsgA en CSGB Curli monomeren translocatie over de cytoplasmatische membraan via het Sec-systeem. Een specifieke machines bestaat uit 3 belangrijke componenten, namelijk CsgE, CsgF en CsgG kan de translocatie van Curli monomeren over het buitenste membraan.

Figuur 2
Figuur 2. Een sterke en induceerbare kobalt-promoter (BBa_K540001). De promoter P rcnA wordt door de transcriptionele repressor RCNR. De RCNR gen wordt getranscribeerd van de endogene promoter P RCNR, divergerend van P rcnA. De aanwezigheid van de RCNR gen zorgt voor een juiste verhouding van repressor exemplaren versus P rcnA regelgevenderegio. Indien de kobalt, RCNR bindt aan de DNA RCNR doos op en voorkomt de volledige transcriptionele activering van de downstream genen. Indien de intracellulaire concentratie van kobalt stijgt, de binding van kobalt de RCNR eiwit voorkomt de bevestiging van de repressor van de promotor en de transcriptionele activiteit van PrcnA toe 19.

Figuur 3
Figuur 3. De synthetische Curli operon. Curli genen onder de controle van P rcnA. De RCNR gen tot expressie gebracht vanaf zijn eigen promoter zou voldoende repressor de expressie van genen in een Curli cobalt afhankelijke wijze gereguleerd. Om periplasmatische file door overproductie Curli monomeer (CSGB en CsgA), de componenten van de specifieke secretie Curli inrichting (CsgE, CsgF en CsgG) te vermijden moet ook worden overgeproduceerd. Toegevoegd traductional signalen zijn in dicated in grijs (RBS = Perfect RBS). E = EcoRI X = XbaI S = SphI P = Pst I. Deze kunststof onderdeel aangeduid als Bba_K540000 laat de kunstmatige spanning om aanhanger van glas, zand of kunststof worden via Curli overproductie.

Figuur 4
Figuur 4. Visualisatie en kwantificering van de adherente bacteriën op 24-well polystyreen plaat. A. Crystal violet gekleurd biofilm gevormd door hechtende bacteriën op polystyreen. B. Percentage van de hechting op polystyreen van het wildtype en de gemanipuleerde stammen met verschillende concentraties kobalt. Statistische verschillen tussen behandelingen zijn aangegeven met kleine letters (variantieanalyse en minst significant verschil Fisher's test; P <0,05).

76/4176fig5.jpg "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Epifluorescentiemicroscopie beelden van het aanklevende GFP-gelabelde bacteriën op glasplaatjes. Bacteriën zijn groen op een zwarte achtergrond. Pijlen wijzen naar microkolonies.

Figuur 6
Figuur 6. Confocale microscropy bijgestaan ​​driedimensionale reconstructies van biofilm structuur op glas dia: A. Bovenaanzicht reconstructies B. Zijaanzicht reconstructies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritische stappen

De meest kritische stap in deze synthetische biologie aanpak is het gen ontwerp. Synthetische gen model moet zorgvuldig in een doeltreffende productie. Twee genen die coderen voor de fiber monomeren en drie genen die coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij de secretie systeem zijn voorzien van een sterk en metaal-induceerbare promoter een nieuwe functionele eenheid voor een nieuwe toepassing te maken: de bio-decontaminatie van nucleaire effluent. Zoals gepland en voorspeld, deze inrichting leidt tot een verbeterde hoge Curli productie, die wordt versterkt door toenemende hoeveelheid kobalt in het medium. Zo'n succes gevolg van de aanwezigheid van de geschikte transcriptie signalen in de gekozen promoter (P rcnA) en de efficiënte translationele signalen toegevoegd voor elke set Curli genen (csgBA en csgEFG) (zie figuur 3). Bovendien, bij het werken met een multicopy plasmide, aandacht moet worden besteed aan het aantal kopieën van de regelaar (s) bij de promoter controle. Hier werden multicopies van de hoofdregelaar RCNR van de gebruikte promoter (P rcnA) die door hetzelfde plasmide (figuur 3).

Beperkingen, mogelijke wijzigingen

Om ervoor te zorgen een perfecte reproduceerbaarheid, de hechting test altijd worden uitgevoerd in hetzelfde merk van polystyreen platen (zie tabel). Fluorescentiemicroscopie is gemakkelijker met fluorescent-gelabeld stammen, maar deze eis kan worden ondervangen door gebruik van fluorescerende kleurstoffen zoals Syto of plasmide dat lac-GFP-fusies 23. Bacteriële aanhechting aan abiotische oppervlakken zoals polystyreen en glas afhangt van de ionensterkte of osmolariteit van het medium. De beste resultaten worden gewoonlijk verkregen in minimaal medium of verdund LB 22, 24.

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen nadat ze zich deze techniek

content "> De hier beschreven methode te kwantificeren bacteriële hechting snel en goedkoop. echter een groot aantal stammen of kweekomstandigheden karakteriseren, en / of een gedetailleerde structurele karakterisering van biofilms, high throughput methode van confocale laser scanning microscopie verkrijgen combinatie met het gebruik van 96-well microtiterplaten moet worden beschouwd 25.

De MBEC screeningssysteem, voorheen Calgary Biofilm inrichting 26 kan ook worden gebruikt. Dit systeem is gebaseerd op het gebruik van een microtiterplaat met een verwijderbaar deksel dat 96 pinnen substraat waardoor microscopische observaties van biofilmstructuur 27 of kwantificering van cellen in biofilm na verstoring door sonicatie op grondwaterstand sonicator (Houd de MBEC High-throughput ( HTP) Assay, Innovotech, Edmonton, Canada). Een ander systeem, de biofilm ringtest op hoe inert paramagnetische deeltjes in het kweekmedium worden geïmmobiliseerd tijdens de vormingvan de biofilm 28, en kan worden gebruikt om biofilmvorming te kwantificeren. MBEC en Biofilm Ring Test vereisen specifieke materialen die zijn duurder dan gangbare consumptiegoederen die in deze studie.

Betekenis van de techniek met betrekking tot de bestaande methoden

Een enkel onafhankelijk Curli operon maken we twee methoden geprobeerd in parallel: een synthetische benadering hier beschreven, en een methode waarbij klassieke mutagenese interne EcoRI en Pstl restrictieplaatsen en PCR stappen gevolgd door ligaties verwijderen. Beide benaderingen werden ingeleid tegelijk, maar sequentieanalyse van het operon verkregen door de klassieke methode geopenbaard ongewenste mutaties. Daarom heeft synthese van de inrichting is efficiënter en sneller dan klassieke mutagenese klonen en procedures.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken de andere leden van de Lyon INSA-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Melanie Geffroy, Clemence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurelie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Beryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon en Valerie Desjardin), onze sponsors voor hun financiële steun (bioMerieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon en het ministerie van Biosciences INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dye voor kritische lezing van dit manuscript en Dr CC Sze voor stam geschenk. B. stabilisatieparachutes ontvangt een Ph.D. beurs van Region Rhône-Alpes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pIG2 pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18 Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23 SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2
S24 SSC1/pUC18
CoCl2 Sigma 0,1M stock solution kept at Room Temperature
M63 29
24-well plate Nunc 55429 Polystyrene 24-well plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
  2. Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. (2011).
  3. Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
  4. Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
  5. Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
  6. Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  9. Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
  10. Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
  11. Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
  12. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
  13. Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
  14. Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
  15. Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
  16. Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
  17. Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
  18. Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
  19. Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
  20. Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
  23. Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
  24. Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. Springer-Verlag. (2006).
  25. Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
  26. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  27. Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
  28. Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
  29. Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drogue, B., Thomas, P., Balvay, L., Prigent-Combaret, C., Dorel, C. Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon. J. Vis. Exp. (69), e4176, doi:10.3791/4176 (2012).More

Drogue, B., Thomas, P., Balvay, L., Prigent-Combaret, C., Dorel, C. Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon. J. Vis. Exp. (69), e4176, doi:10.3791/4176 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter