Summary
एक सिंथेटिक operon एन्कोडिंग दोनों स्रावी तंत्र और curli फाइबर के संरचनात्मक monomers के डिजाइन में वर्णित है. इन amyloids और पक्षपाती पॉलिमर के overproduction के पालन के एक औसत दर्जे का लाभ देता है
Abstract
यहाँ वर्णित विधि redesigning ई. में शामिल कोली द्वारा एक मजबूत और धातु overinducible प्रमोटर के नियंत्रण नीचे curli जीनों की न्यूनतम संख्या कोडांतरण, और visualizing और बढ़ाता बैक्टीरियल पालन के परिणामस्वरूप लाभ में पालन गुण. इस विधि अमूर्त के उपयुक्त इंजीनियरिंग के सिद्धांतों और सिंथेटिक जीव विज्ञान के मानकीकरण, और BBa_K540000 Biobrick में परिणाम (सर्वश्रेष्ठ नई Biobrick डिवाइस, इंजीनियर, 2011 iGEM) लागू होता है.
1 कदम सिंथेटिक धातु के लिए जवाब में curli overproduction के लिए समर्पित operon की डिजाइन में होते हैं, और इसलिए जंगली प्रकार के तनाव के पालन क्षमताओं को बढ़ाने में. मूल curli operon सिलिको में संशोधित किया गया था क्रम में transcriptional और translational संकेतों का अनुकूलन और curli का "प्राकृतिक" विनियमन बच. इस दृष्टिकोण के लिए सफलता के साथ हमारे curli उत्पादन के वर्तमान समझ का परीक्षण करने के लिए अनुमति दी. Moreover, एक साधारण धातु विनियमित प्रमोटर अंतर्जात जटिल प्रमोटर (10 से अधिक transcriptional नियामकों की पहचान) स्विचन द्वारा curli विनियमन सरल बनाने के पालन को नियंत्रित करने के लिए बहुत आसान बना देता है.
दूसरे चरण के सरल तरीकों के कार्यान्वयन द्वारा पालन क्षमताओं के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन शामिल हैं. इन विधियों पक्षपाती बैक्टीरिया की एक बड़ी जैविक biofilm गठन में शामिल संरचनाओं की परवाह किए बिना श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं. 24 अच्छी तरह polystyrene प्लेटें में पालन परीक्षण क्रिस्टल बैंगनी धुंधला हो जाना के बाद जीवाणु biofilm के एक त्वरित प्रारंभिक दृश्य प्रदान करता है. इस गुणात्मक परीक्षण पालन के प्रतिशत की मात्रा का ठहराव से तेज किया जा सकता है. इस तरह की एक विधि बहुत आसान है, लेकिन केवल क्रिस्टल बैंगनी धुंधला हो जाना है के रूप में पहले दोनों एक अच्छा repeatability और reproducibility साथ 1 वर्णित की तुलना में ज्यादा सटीक है. गिलास स्लाइड पर GFP टैग जीवाणुओं की प्रतिदीप्ति या लेजर conf विज़ुअलाइज़ेशनocal माइक्रोस्कोपी प्लेट 24 अच्छी तरह से परीक्षण के साथ घटना के प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा प्राप्त परिणामों को मजबूत बनाने के लिए अनुमति देता है.
Introduction
अजैव का समर्थन करने के लिए बैक्टीरियल पालन bioremediation biocatalysis, या माइक्रोबियल ईंधन कोशिकाओं में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. Bioremediation प्रक्रियाओं सूक्ष्मजीवों की क्षमता का उपयोग करने के लिए कार्बनिक पदार्थ को नीचा, या धातु (स्थिरीकरण औटना) वितरण या प्रजातीकरण संशोधित. इन लाभकारी गतिविधियों जलीय और स्थलीय पारितंत्रों में मनाया जाता है, लेकिन यह भी कृत्रिम औद्योगिक और घरेलू कचरे के प्रदूषित पानी के उपचार के लिए विकसित प्रणालियों में. और माइक्रोबियल गतिविधि की गुणवत्ता तीव्रता लेकिन सूक्ष्मजीवों के भी जीवन शैली (मुक्त अस्थायी या biofilm में एम्बेडेड) पर भौतिक रासायनिक कारकों पर निर्भर करते हैं. biofilm गठन एक biocides विविध तंत्र द्वारा प्रतिरोध चयापचय को बढ़ावा देने के साथ जुड़ा हुआ है. यह घटना इसलिए सबसे bioremediation प्रक्रियाओं में प्रोत्साहित किया जाएगा. इसके अलावा, इंजीनियरिंग Escherichia कोलाई कोशिकाओं biofilm गठन को नियंत्रित करने को सफलतापूर्वक किया गया है करने के लिए लागू2-3 biochips पूरे सेल सेंसर स्थिर.
धातुओं के उच्च एकाग्रता के लिए सूक्ष्मजीवों के अनुकूलन बाह्य मैट्रिक्स घटकों को सोखना के रूप में विविध तंत्र, तपका पंप के सक्रियण या विशिष्ट वाहक सेल में धातु ध्यान केंद्रित करने में सक्षम के माध्यम से होता है. जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से इन बैक्टीरिया गतिविधियों को बढ़ाने प्रयोगशाला पैमाने पर धातु के प्रदूषण के कुशल और सस्ते उपचार की अनुमति देता है, रघु एट अल द्वारा वर्णित के रूप में कमजोर मात्रा में अत्यधिक विषाक्त धातुओं के मामले में विशेष रूप से 4 2008. बैक्टीरियल remediation इस मामले में एक प्रतिस्पर्धी और लागत बचत शास्त्रीय रासायनिक आयन एक्सचेंज रेजिन प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए तुलना विधि का प्रतिनिधित्व करता है. लेखक एक ई वर्णित कोलाई न्याधार आनुवंशिक बाहर दस्तक तपका पंप एन्कोडिंग जीन rcnA, और फिर परिवर्तन के द्वारा एक बहु की नकल के साथ एक के प्लाज्मिड अनुमति देता है overproduction कोबाल्ट तेज और पहली प्रतिधारण इंजीनियरकोबाल्ट के लिए तेज के साथ तरजीही ट्रांसपोर्टर तनाव आयन एक्सचेंज रेजिन के लिए एक कुशल वैकल्पिक रेडियोधर्मी प्रवाह के इलाज के रूप में प्रकट होता है, लेकिन एक प्रमुख अनसुलझे मुद्दे 4 की प्रक्रिया के अंत में दूषित जीवाणुओं की वसूली है. इसलिए हमारे काम का उद्देश्य था एक तनाव कस्टम डिजाइन कांच या प्लास्टिक के रूप में अजैव समर्थन करने के लिए छड़ी करने में सक्षम इंजीनियर.
ग्राम बैक्टीरिया में पहचान adhesins और पक्षपाती fimbriae के पूरे सेट के बीच, हम एक curli उत्पादन की अनुमति प्रणाली डिजाइन करने के लिए चुना है. Curli (2-5 एनएम व्यास) पतली और अत्यधिक योगात्मक ई. से amyloid फाइबर कि बहर कर रहे हैं कोलाई और साल्मोनेला की सतह के रूप में एक गैर क्रिस्टलीय और अघुलनशील मैट्रिक्स 5-7. भी Curli अजैव सतहों और 8 biofilms के विकास के उपनिवेश में शामिल कर रहे हैं. Curli हाल ही में पारा आयनों BIND 9 के लिए दिखाया गया है. Amyloids वास्तव में उच्च अधिकारी करने के लिए जाना जाता है2 घन के रूप में धातु आयनों के लिए आत्मीयता, Zn 2 + और 3 Fe 10 +. इस संपत्ति आगे धातु प्रदूषित अपशिष्ट का परिशोधन में सुधार हो सकता है. CSG क्लस्टर curli फाइबर के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है और दो divergently लिखित operons (1 चित्रा) का गठन किया है. csgB csgA, और csgC जीन भावना operon का गठन, दो curli सब यूनिटों, CsgA और CsgB एन्कोडिंग. CsgC लिए curli biogenesis प्रणाली के भीतर redox गतिविधि में शामिल होने के लिए और 11 ताकना व्यवहार CsgG प्रभावित लगता है. हालांकि, बैक्टेरिया curli बहुमत में csgC के अभाव यह इंगित करता है कि इसी प्रोटीन केवल curli biogenesis पर नियंत्रण के एक secundary स्तर प्रदान करता है. प्रणाली को सरल, हम जीन की न्यूनतम संख्या के साथ काम करने के लिए चुना गया है.
csgDEFG विनियमन और परिवहन में आवश्यक प्रोटीन operonencodesCsgA और CsgB की कोशिका की सतह. CsgD csgBAC operon के transcriptional उत्प्रेरक और biofilm गठन की curli fimbriae और 12 सेलूलोज़ जैसे अन्य biofilm घटकों के उत्पादन को नियंत्रित करने और बाधा कशाभिका उत्पादन 13 से नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. CsgE CsgF, और CsgG है एक curli विशिष्ट बाहरी झिल्ली में स्रावी तंत्र के माध्यम से जो प्रमुख curli सबयूनिट प्रोटीन CsgA घुलनशील प्रोटीन के रूप में secreted है का गठन. के polymerization CsgA झिल्ली ही सीमित nucleator प्रोटीन CsgB (में 14 समीक्षा) vivo में निर्भर है. जटिल विनियामक कई दो घटक प्रणालियों को शामिल रास्ते जीन curli 15-16 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है. इन जटिल नियमों बैक्टीरिया पर्यावरण cues के जवाब में curli उत्पादन के माध्यम से मोटी biofilms रूप करने की अनुमति देते हैं, लेकिन औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रण के लिए मुश्किल हैं. मुलाकात की वसूली की सुविधाएक औद्योगिक प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया अल भरवां, एक ठोस समर्थन करने के लिए जीवाणु निर्धारण वास्तव में अच्छी तरह से परिभाषित पैरामीटर (ओं) के द्वारा नियंत्रित किया जा जरूरत है. उनके amyloid प्रकृति 17 curli के पक्षपाती गुण जुड़े हुए हैं और bioremediation प्रक्रियाओं में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक सरल और आसानी से नियंत्रित डिवाइस के लिए बनाया जा सकता है.
इन 7 18 जीन के बीच, 5 का एक सेट बिल्कुल संश्लेषण curli (csgB और csgA एन्कोडिंग फाइबर monomers) और निर्यात (csgE csgF और csgG, curli स्राव जटिल एन्कोडिंग) के लिए जीन की आवश्यकता सिंथेटिक operon का निर्माण करने के लिए चयन किया गया था. "प्राकृतिक" curli के विनियमन, एक सिंथेटिक एक मजबूत और कोबाल्ट overinducible प्रमोटर (2 चित्रा) के नियंत्रण के तहत इन 5 CSG जीन शामिल बनाया गया था और संश्लेषित operon बच. क्षेत्र curli एन्कोडिंग विश्लेषण कदम दर कदम और एक कार्यात्मक syn के लिए डिजाइन की प्रक्रियाthetic operon वर्णित हैं. कल्पना और polystyrene और कांच के लिए जीवाणु पालन यों दो तरीके से व्याख्या कर रहे हैं.
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Protocol
1. डिजाइन Biobrick और Curli operon के संश्लेषण
- आनुवंशिक संगठन निर्धारित और curli जीन की अंतर्जात transcriptional और translational संकेतों स्थानीय बनाना. इन informations RegulonDB एक या EcoGene ख के रूप में विशेष डेटाबेस में इकट्ठा कर रहे हैं और उचित प्रकाशनों की एक सावधान पढ़ने के द्वारा पूरा किया. डाटा प्रबंधन और सिलिको preanalysis में क्लोन प्रबंधक सॉफ्टवेयर ग के साथ प्रदर्शन किया गया.
- उचित कोडिंग दृश्यों का चयन करें. संश्लेषण curli (csgB और csgA एन्कोडिंग फाइबर monomers) और निर्यात (csgE csgF और csgG, Curlin स्राव जटिल एन्कोडिंग) के लिए पाँच बिल्कुल आवश्यक जीन का एक सेट सिंथेटिक operon का निर्माण करने के लिए चयन किया गया था. FASTA प्रारूप में डेटा के आधार से चुना दृश्यों निकालें.
के रूप में ई. में csgGFE क्लस्टर antisense कोलाई जीनोम, अपनी रिवर्स पूरक counterp में इस अनुक्रम में परिवर्तितक्लोन संचालन प्रबंधक उपकरण का उपयोग> प्रक्रिया अणु अणु उलटें द्वारा कला. समारोह "कटी घमनी को बांधना" (क्लोन कटी घमनी को बांधना>) का उपयोग करके csgBA पीछे csgEFG अनुक्रम पेस्ट करें. - उपयुक्त प्रमोटर जोड़ें. प्रमोटर पी RCN के नियंत्रण के तहत पाँच चयनित curli जीन रखने से curli कोबाल्ट और निकल की उपस्थिति में अधिक उत्पादन किया जा भविष्यवाणी कर रहे हैं. RCN बिन्दुपथ एक तपका नी और सह (rcnA) detoxification और उसके आत्मीय metallo-नियामक (rcnR) के लिए जिम्मेदार पंप encodes. RcnR rcnA की अभिव्यक्ति और नी और सह 19 के जवाब में अपने जीन को नियंत्रित करता है. RCN rcnR सीडीएस शामिल अनुक्रम, पूरे RCN intergenic क्षेत्र प्लस rcnA के 41 1 nucleotides placedin csgBAEFG असाध्य अनुक्रम (1 चित्रा, पूरे निर्माण के अनुक्रम अनुपूरक डेटा के रूप में प्रदान की जाती है) के सामने था.
- Transcriptional ऑप्टिमाइज़संकेत है. एक संपूर्ण ribosome बाध्यकारी साइट (या सही तक आरबीएस AAGGAGGTATATA =) 1 csgBA डीएनए अनुक्रम का ATG के सामने में जोड़ा गया है. एक दूसरे सही आरबीएस csgEFG अनुक्रम के सामने में जोड़ा गया है. के लिए अंतर्जात आरबीएस csgB और csgF और csgG जीन संरक्षित थे.
- IGEM मानकों फिट करने के लिए, डिवाइस एक मानक BioBrick उपसर्ग और प्रत्यय द्वारा flanked किया जाना चाहिए, पारिस्थितिकी आरआई के लिए प्रतिबंध साइटों, PST (उपसर्ग) मैं और विशेष मैं और Xba मैं (प्रत्यय) से युक्त है. डिवाइस घ के प्रत्येक के अंत में इसी दृश्यों चिपकाएँ.
- किसी भी पारिस्थितिकी आरआई, Pst मैं, मैं विशेष और डिवाइस में Xba मैं मान्यता साइट हटा दें. आगे विधानसभा की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, BioBrick हिस्सा ही इन साइटों के प्रतिबंध शामिल नहीं हो सकते. सिलिको डिवाइस के प्रतिबंध के विश्लेषण में एक Pst मैं अनुक्रम में csgA, rcnR अनुक्रम में एक Pst मैं साइट से पता चलाऔर एक csgE जीन में पारिस्थितिकी आरआई साइट. इन साइटों क्रमशः, 80 (Mut1), 1340 (Mut2) और 1830 (Mut3) डिवाइस अनुक्रम (अनुपूरक डेटा) की स्थिति में स्थित हैं और मूक परिवर्तन से पालन के रूप में संशोधित किया गया.
Mut1 Pst मैं साइट CGTCTG में बदल CTGCAG
Mut2 Pst मैं साइट CAGCAG में बदल CTGCAG
Mut3 पारिस्थितिकी आरआई साइट GAATT में बदल GAATTC - अनुवाद अनुकरण के माध्यम से चलाने के क्लोन प्रबंधक सॉफ्टवेयर (ऑपरेशन> प्रोसेस अणुओं> अनुवाद अणुओं) का उपयोग कर. अनुक्रम संरेखण कार्यक्रम BLAST का उपयोग करने के लिए जंगली प्रकार curli प्रोटीन और सिंथेटिक operon द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के बीच सही अनुरूपता सत्यापित.
- सिंथेटिक operon आदेश. वाणिज्यिक जीन संश्लेषण सेवाओं और कई कंपनियों से दुनिया भर में उपलब्ध हैं, हमारे साथी Genecust (लक्समबर्ग) था. कृत्रिम operon (3165 बीपी) की 4 ग्राम के कुछ हफ्तों के बाद प्राप्त हुए थे और में डाला (pIG2) pUC57.
2. कल्पना और Polystyrene पर पक्षपाती जीवाणु यों
- M63 न्यूनतम मध्यम ग्लूकोज (0.2%) के 2 मिलीलीटर के साथ एक polystyrene 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें और एक रात में संस्कृति के 106 कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से टीका लगाना. 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया मिलाते हुए बिना 18 से 48 घंटे के लिए आगे बढ़ें. प्रत्येक स्तंभ (4 कुओं) एक साधन का प्रतिनिधित्व करता है. कोबाल्ट की उचित मात्रा में (25 से 100 मिमी) और एंटीबायोटिक जोड़ें (एम्पीसिलीन 100 μg.L -1) जब जरूरत थी. 24 अच्छी तरह से थाली के 3 1 पंक्तियों 3 repetitions औसत से पक्षपाती बैक्टीरिया यों के लिए उपयोग किया जाता है, अंतिम पंक्ति बाईं biofilm कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- 24 अच्छी तरह से थाली के 3 1 पंक्तियों के लिए प्रत्येक के लिए अच्छी तरह planktonic कोशिकाओं से युक्त तैरनेवाला ठीक.
- ध्यान से प्रत्येक M63 के 1 मिलीग्राम और 2.2 में प्राप्त प्रारंभिक तैरनेवाला के साथ पूल 1 मिलीलीटर धोने) के साथ अच्छी तरह कुल्ला. इस पूल में तैराकी कोशिकाओं (एस =) के रूप में जाना जाता है.
- 1 मिलीग्राम ओ में biofilm पुनर्प्राप्तM63 scraping और pipetting और नीचे च (= बी). भंवर सेकंड 15. पालन करने के लिए प्रत्येक साधन के लिए इसी प्रतिशत देने के लिए 600 एनएम (OD600) ऑप्टिकल घनत्व से सतह संलग्न और तैराकी बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान है.
- पालन का प्रतिशत सूत्र का उपयोग करके गणना की है: Bx100 / (3xS + बी).
- के केवल 24 अच्छी तरह से थाली की अंतिम पंक्ति के लिए: planktonic कोशिकाओं त्यागें.
- M63 biofilm जो प्लेट के नीचे पर विकसित की थी 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला.
- 80 में 1 घंटे के लिए खुले थाली सूखी डिग्री सेल्सियस
- अच्छी तरह से पानी के साथ व्यापक washes द्वारा पीछा करने के लिए सतह से संलग्न बैक्टीरिया कल्पना प्रत्येक में 2 मिनट के लिए 20% क्रिस्टल बैंगनी के 100 μl जोड़ें.
तीन स्वतंत्र assays (प्लेट) करने के लिए reproducibility सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया जा है.
3. माइक्रोस्कोपी द्वारा ग्लास पर पक्षपाती जीवाणु कल्पना
- एक फ्लोरोसेंट चेसिस. ई. कोलाई SCC1 ई तनाव constitutivel जोy 20 MG1655 प्लाज्मिड असर सिंथेटिक curli operon के लिए एक उपयुक्त मेजबान माता पिता के तनाव से कोई नमूदार अंतर के साथ हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को व्यक्त करता है.
- S23 तनाव प्राप्त pIG2 प्लाज्मिड (= सिंथेटिक curli पारिस्थितिकी आरआई / मैं pUC57 प्लाज्मिड के साइट Pst पर डाला operon) के साथ SCC1 रूपांतरण. एक प्लाज्मिड नियंत्रण (pUC18) नियंत्रण तनाव 21 S24 प्राप्त के साथ SCC1 रूपांतरण.
- S23 और नियंत्रण के रातोंरात precultures (S24) में 30 उपभेदों ° सी M63 ग्लूकोज के साथ पूरक मध्यम (0.2%) और एम्पीसिलीन (100 -1 μg.L) में आगे बढ़ें.
- Precultures के 100 μl के साथ पेट्री डिश में एक ही माध्यम के 15 मिलीलीटर टीका लगाना. कोबाल्ट (यानी 25 सुक्ष्ममापी) के उचित एकाग्रता जोडें और कोबाल्ट बिना नकारात्मक नियंत्रण भूल नहीं है. प्रत्येक पेट्री डिश में 3 आयताकार गिलास coverslip परिचय. मिलाते हुए बिना 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
- Coverslip fro हटाएंमी पेट्री डिश और ध्यान से यह पलायन. एक छोटे से कपास से हर बैक्टीरियल अवशेषों पोंछते द्वारा 70 ° इथेनॉल के साथ गर्भवती सामान के साथ सावधानी से कम चेहरा साफ. Confocal अवलोकन के लिए, कुछ मिलीमीटर पर साफ करने के लिए दोनों ऊपरी समाप्त होता coverslip के आगे निर्धारण की अनुमति.
- पक्षपाती बैक्टीरिया प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे सीधे लेकिन जल्दी कल्पना कर सकते हैं, लेकिन ध्यान नमूना के सूखने से बचें.
- Confocal अवलोकन के लिए, एक गिलास स्लाइड पर ऊपरी चेहरा ऊपर रखा biofilm द्वारा कवर चेहरे के साथ coverslip जमा. biofilm तो एक बड़ा coverslip, जो वार्निश के साथ गिलास स्लाइड करने के लिए तय है के साथ कवर किया जाता है. सेटअप उलटें इतना है कि biofilm अब कम चेहरे पर होगा.
- लेजर confocal खुर्दबीन के नीचे सेटअप रखें. एक सही LSM510 Axioplan2 (Zeiss) लेजर confocal खुर्दबीन Platim मंच च में इस्तेमाल किया गया था.
- स्थापना. 488 एनएम पर उत्तेजित GFP, और बैक्टीरियल प्रतिदीप्ति रेंज में 500 से 600 एनएम इकट्ठा . स्कैनिंग लेजर confocal मोड में छवियों को प्राप्त करने के लिए 40x तेल विसर्जन उद्देश्य से प्रयोग करें. ठोस सतह से मध्यम विकास के साथ इंटरफेस के लिए biofilms के समग्र तीन आयामी संरचना, 1 सुक्ष्ममापी की एक कदम का उपयोग स्कैन.
- IMARIS सॉफ्टवेयर (Bitplane, ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) के साथ तीन आयामी के अनुमानों के प्रदर्शन. सांख्यिकीय अनुदैर्ध्य वर्गों के साथ औसत z मान के विश्लेषण से biofilm मोटाई का निर्धारण करते हैं. Biofilm biovolumes की मात्रा confocal z-ढेर से निकाला जा सकता है के रूप में 22 कहीं वर्णित.
एक RegulonDB प्रतिलेखन इकाइयों, प्रमोटरों और उनके सिग्मा प्रकार, जीन और उनके ribosome बाध्यकारी साइटों, terminators, विशिष्ट transcriptional नियामकों के बाध्यकारी साइटों, साथ ही नियामक वाक्यांशों में उनके संगठन में operon संगठन और उनके अपघटन के बारे में यंत्रवत जानकारी प्रदान करता है.एट => "_blank" http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
ख EcoGene डेटाबेस ई. के बारे में अद्यतन जानकारी शामिल K-12 जीनोम और व्यापक जीन bibliographies सहित proteome दृश्यों, कोलाई एक प्रमुख EcoGene ध्यान अनुवाद शुरू साइटों की फिर से मूल्यांकन किया गया है. http://ecogene.org/
ग http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
घ http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
चुन चौधरी Sze, नेन यांग तकनीकी विश्वविद्यालय, सिंगापुर की ई उपहार.
च Platim सूक्ष्म मंच UMS3444 बायोसाइंसेज Gerland ल्यों सूद.
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Representative Results
ई. के जंगली प्रकार CSG अनुक्रम की सिलिको एनोटेशन K12 कोलाई के transcriptional और translational संकेतों के अनुकूलन के साथ जुड़े डिजाइन एक सिंथेटिक curli operon पी RCN - CSG चित्रा 3 (अनुपूरक डेटा में पूर्ण अनुक्रम) में दिखाया करने के लिए अनुमति दी गई है. प्रोटोकॉल 2 और प्रोटोकॉल 3 के लिए कल्पना और पालन curli उत्पादन के साथ जुड़े यों के लिए इस्तेमाल किया गया. क्रिस्टल 24 अच्छी तरह polystyrene प्लेटों पर बैंगनी धुंधला हो (2 protocole) प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे biofilm गठन का उपयोग तेजी से देखे जा सकता है और ऐसा लगता है कि जंगली प्रकार तनाव कम इंजीनियर तनाव से पक्षपाती है के रूप में बैंगनी रंग की तीव्रता में अंतर से दिखाया गया है (4A चित्रा). यह गुणात्मक मात्रात्मक माप जो पता चलता है कि पालन का प्रतिशत 1.5 गुना इंजीनियर तनाव (4B चित्रा) में अधिक है दृष्टिकोण से मजबूत है. इसके अलावा की सटीकता quantita, सक्रिय दृष्टिकोण पालन के कोबाल्ट की बढ़ती सांद्रता की उपस्थिति में एक महत्वपूर्ण सुदृढीकरण के माप की अनुमति देता है. दरअसल, 0 सुक्ष्ममापी, 25 सुक्ष्ममापी या 50 सुक्ष्ममापी कोबाल्ट सांद्रता के साथ मीडिया में, पक्षपाती कोशिकाओं का प्रतिशत 25%, 30% और 40% क्रमशः (4B चित्रा) तक पहुँचने. पालन क्षमता भी कांच स्लाइड पर हो GFP टैग बैक्टीरिया के साथ माइक्रोस्कोपी का उपयोग तुलना की जा सकती है. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों (काली पृष्ठभूमि पर हरी बैक्टीरिया) से पता चलता है कि इंजीनियर तनाव कई परतों बड़े कुल एक biofilm के रूप में माना जाता है जबकि जंगली प्रकार तनाव केवल सूक्ष्म कालोनियों (5 चित्रा) रूपों रूपों. Confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण biofilm तीन आयामी संरचना का एक समग्र दृष्टिकोण प्रदान करता है और पुष्टि की है कि इंजीनियर तनाव अधिक अनुयायी है, एक सघन और मोटा biofilm (6 चित्रा) बनाने.
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चित्रा 1. दो csgB और csgA जीन द्वारा इनकोडिंग monomers के Curli प्रणाली जंगली प्रकार. Curli बना रहे हैं. उनके संकेत पेप्टाइड के लिए धन्यवाद, CsgA और CsgB curli monomers सेक प्रणाली के माध्यम से cytoplasmic झिल्ली भर translocated हैं. एक विशिष्ट 3 मुख्य घटकों, अर्थात् CsgE CsgF, और CsgG बना मशीनरी बाहरी झिल्ली भर में curli monomers के स्थानान्तरण की अनुमति देता है.
चित्रा 2. एक मजबूत और कोबाल्ट inducible (BBa_K540001) प्रमोटर प्रमोटर पी rcnA transcriptional repressor RcnR द्वारा नियंत्रित किया जाता है. अपनी अंतर्जात प्रमोटर पी rcnR से rcnR जीन लिखित है, divergently पी rcnA से. पी rcnA विनियामक बनाम rcnR जीन की उपस्थिति एक repressor प्रतियों की सही अनुपात सुनिश्चित करता हैक्षेत्र. कोबाल्ट के अभाव में, RcnR डीएनए पर RcnR बॉक्स को बांध और अनुप्रवाह जीनों के transcriptional सक्रियण रोकता. यदि कोबाल्ट उगता है intracellular एकाग्रता, कोबाल्ट RcnR प्रोटीन बाध्यकारी और PrcnA 19 बढ़ जाती transcriptional गतिविधि प्रमोटर repressor के निर्धारण को रोकता है.
चित्रा 3. सिंथेटिक curli operon. Curli जीन पी rcnA के नियंत्रण के तहत रखा जाता है. अपने स्वयं के प्रमोटर से व्यक्त rcnR जीन repressor पर्याप्त एक कोबाल्ट निर्भर तरीके में curli जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए प्रदान करना चाहिए. Periplasmic यातायात curli monomer (CsgB और CsgA) overproduction, curli विशिष्ट स्राव तंत्र के घटकों (CsgE, CsgF और CsgG) के कारण जाम से बचने के लिए भी overproduced किया जाना है. जोड़ा गया traductional संकेतों में ग्रे (आरबीएस = परफेक्ट आरबीएस) में dicated. ई = पारिस्थितिकी आरआई एक्स = Xba मैं एस = Sph मैं पी = Pst आई. यह सिंथेटिक Bba_K540000 के रूप में भेजा हिस्सा इंजीनियर तनाव गिलास, रेत, या प्लास्टिक के अनुयायी curli overproduction के माध्यम से बनने के लिए अनुमति देता है.
चित्रा 4. विज़ुअलाइज़ेशन और 24 अच्छी तरह polystyrene प्लेट पर पक्षपाती बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव. ए क्रिस्टल बैंगनी दाग biofilm polystyrene पर पक्षपाती बैक्टीरिया द्वारा गठित. जंगली प्रकार और कोबाल्ट के विभिन्न सांद्रता के साथ इंजीनियर उपभेदों की polystyrene पर पालन के बी प्रतिशत. उपचार के बीच मतभेद सांख्यिकीय लोअरकेस अक्षरों (, पी <0.05) विचरण और फिशर की कम से कम महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के विश्लेषण से संकेत कर रहे हैं.
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चित्रा 5. पक्षपाती जीवाणु GFP टैग गिलास स्लाइड पर बैक्टीरिया. Epifluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर हरे हैं. तीर microcolonies बिंदु पर.
6 चित्रा. Confocal microscropy गिलास स्लाइड पर biofilm संरचना के तीन आयामी पुनर्निर्माण सहायता: ए शीर्ष दृश्य पुनर्निर्माण बी साइड देखें पुनर्निर्माण.
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Discussion
महत्वपूर्ण कदम
इस सिंथेटिक जीव विज्ञान के दृष्टिकोण में सबसे महत्वपूर्ण कदम जीन डिजाइन है. सिंथेटिक जीन डिजाइन करने के लिए एक कुशल प्रणाली उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना है. परमाणु प्रवाह की जैव परिशोधन: दो फाइबर monomers और तीन जीनों उनके स्राव प्रणाली में शामिल प्रोटीन एन्कोडिंग जीन एन्कोडिंग एक उपन्यास आवेदन के लिए एक नया कार्यात्मक इकाई बनाने के लिए एक मजबूत और धातु inducible प्रमोटर के साथ इकट्ठा किया गया है. के रूप में की योजना बनाई है और भविष्यवाणी की, इस डिवाइस एक बढ़ाया उच्च curli उत्पादन, जो मध्यम में कोबाल्ट की राशि बढ़ाने के द्वारा प्रबलित है की ओर जाता है. चुना प्रमोटर (पी rcnA) में दोनों उपयुक्त transcriptional का संकेत है, और कुशल translational संकेतों की उपस्थिति से इस तरह के एक सफलता परिणाम. Curli जीनों के प्रत्येक सेट (csgBA और csgEFG) (चित्र देखें 3) के सामने जोड़ा. इसके अलावा, जब एक MULTICOPY प्लाज्मिड ध्यान, के साथ काम कर रहे हैं नियामक की प्रतिलिपि संख्या (ओं) प्रमोटर नियंत्रण में शामिल करने के लिए भुगतान किया जाना है. यहाँ, प्रयुक्त प्रमोटर (पी rcnA) के मुख्य नियामक RcnR की multicopies एक ही प्लाज्मिड (3 चित्रा) से प्रदान किया गया.
सीमाओं, संभव संशोधनों
एक आदर्श reproductibility सुनिश्चित करने के लिए, पालन परीक्षण हमेशा polystyrene प्लेटों के एक ही ब्रांड में प्रदर्शन किया (तालिका देखें). प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट टैग उपभेदों के साथ आसान है, लेकिन इस आवश्यकता Syto, या प्लाज्मिड ले जाने लाख GFP 23 fusions के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. Polystyrene और कांच जैसे अजैव सतहों बैक्टीरियल लगाव ईओण या माध्यम की ताकत osmolarity पर निर्भर करता है. सर्वश्रेष्ठ परिणाम आम तौर पर कम से कम मध्यम या पतला 22 पौंड, 24 में प्राप्त कर रहे हैं.
भविष्य अनुप्रयोगों या माहिर के बाद इस तकनीक दिशाओं
सामग्री "> विधि यहाँ वर्णित बैक्टीरियल पालन तेजी से और सस्ते है जिसका अंदाजा हालांकि, उपभेदों या संस्कृति की स्थिति की एक बड़ी संख्या को चिह्नित करने के लिए, और / या biofilms के एक विस्तृत संरचनात्मक लक्षण, उच्च throughput लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी पर आधारित पद्धति प्राप्त. 96-अच्छी तरह प्लेटें microtiter के उपयोग के साथ संयुक्त 25 विचार किया जाना चाहिए.MBEC स्क्रीनिंग सिस्टम, पूर्व कैलगरी Biofilm 26 डिवाइस भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रणाली के एक हटाये ढक्कन के साथ एक microtiter प्लेट का उपयोग करें कि 96 खूंटे sonication द्वारा एक पानी की मेज (sonicator पर विघटन के बाद biofilm में biofilm 27 संरचना, या कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के सूक्ष्म टिप्पणियों की अनुमति बुनियाद पकड़ पर आधारित है MBEC उच्च throughput ( HTP) परख, Innovotech, एडमोंटन, कनाडा). एक और प्रणाली, Biofilm रिंग टेस्ट, पर नज़र रखता है कैसे निष्क्रिय paramagnetic संस्कृति के माध्यम में शामिल मोती गठन के दौरान स्थिर28 biofilm का और biofilm गठन यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MBEC और Biofilm अँगूठी टेस्ट विशिष्ट सामग्री है कि इस अध्ययन में इस्तेमाल बुनियादी उपभोग्य सामग्रियों की तुलना में अधिक महंगे हैं की आवश्यकता होती है.
तकनीक के मौजूदा तरीकों के लिए सम्मान के साथ महत्व
एक एकल स्वतंत्र curli operon बनाने के लिए, हम दो विधियों का समानांतर में करने की कोशिश की: एक सिंथेटिक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित है, और एक क्लासिक mutagenesis शामिल आंतरिक पारिस्थितिकी आरआई और Pst मैं प्रतिबंध साइटों, और पीसीआर कदम ligations द्वारा पीछा किया हटाने विधि. दोनों दृष्टिकोण एक ही समय में शुरू किए गए थे, लेकिन शास्त्रीय विधि द्वारा प्राप्त operon के अनुक्रमण विश्लेषण अवांछनीय म्यूटेशनों का पता चला. इसलिए, इस उपकरण के संश्लेषण और अधिक कुशल और अधिक शास्त्रीय क्लोनिंग और mutagenesis प्रक्रियाओं की तुलना में तेजी से किया गया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ल्यों iGEM आईएनएसए ENS टीम (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, एलेक्जेंडर Duprey, Mélanie GEFFROY, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie हाग, Goki Ly, थॉमस Poinsot, Beryl रोयेर बर्ट्रेंड, जूली Soula, माइकल Vonzy के अन्य सदस्यों को धन्यवाद , पियरे Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, ओलिवर Brette, Gaël Chambonnier, लौरा Izard, Aurianne Kroiss, फिलिप Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon और Valérie Desjardin), उनके वित्तीय सहायता के लिए हमारे प्रायोजकों (bioMerieux, Assystem, EDF, Fondation आईएनएसए, ENS-Lyon और आईएनएसए ल्यों बायोसाइंसेज के विभाग), इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और डॉ. तनाव उपहार के लिए सीसी Sze के लिए एफ Wisniewski डाई. तैरता पुल बी एक पीएच.डी. प्राप्त Rhône-Alpes क्षेत्र से फैलोशिप.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
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