Summary
합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다
Abstract
여기에 설명 된 방법은 E. 디자인을 변경해에 구성 강하고 금속 overinducible 발기인의 통제하에 curli 유전자의 최소 수를 조립하여, 그리고 세균 준수의 결과 이득을 시각화하고 정량화에 대장균을 준수 속성. 이 방법은 적절한 엔지니어링 추상화의 원리 및 합성 생물학의 표준화 및 BBa_K540000 Biobrick의 결과 (가장 새로운 Biobrick 장치, 설계, iGEM 2011) 적용됩니다.
첫 번째 단계는 야생 타입 스트레인의 준수 능력을 증가에 따라서 금속에 대한 응답으로 curli의 과잉에 전념 합성 오페론의 디자인으로 구성합니다. 원래 curli 오페론은 전사와 병진 신호를 최적화하고 curli의 "자연"규정을 탈출하기 위해 silico에 바뀌 었습니다. 이 방법은 성공 curli 생산의 현재 이해를 테스트 할 수있었습니다. MoreoveR은, 간단한 금속 규제 발기인으로 내생 복잡한 발기인 (10 개 이상의 전사 규제가 확인)를 전환하여 curli 규정을 단순화하는 것은 제어 할보다 쉽게 준수합니다.
두 번째 단계는 간단한 방법의 구현으로 준수 능력의 질적 및 양적 평가를 포함하고 있습니다. 이러한 방법은 biofilm 형성에 관여 생물학적 구조에 관계없이 자기편 박테리아의 큰 범위에 적용됩니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 준수 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 후 세균 biofilm의 빠른 사전 시각화를 제공합니다. 이 질적 시험은 준수의 비율을 정량화하여 날카롭게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 좋은 반복성과 재현성을 모두 이전 한 설명으로 만 크리스탈 바이올렛 염색보다 더 정확합니다. 형광 또는 레이저 믿어으로 유리 슬라이드에 GFP 태그 박테리아의 시각화ocal 현미경은 현상을 직접 관찰하여 24 잘 판 테스트를 얻은 결과를 강화 할 수 있습니다.
Introduction
비 생물 적 지원 세균 준수는 bioremediation, biocatalysis 또는 미생물 연료 전지에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Bioremediation 공정은 유기 물질을 저하하거나 금속 분포 (고정, 휘발) 또는 분화를 수정 미생물의 용량을 사용합니다. 이러한 유익한 활동은 산업 및 국내 폐기물의 오염 물을 치료하기 위해 개발 된 인공 시스템에서도 수중 및 지상 생태계에서 관찰하지만 수 있습니다. 미생물 활동의 강도와 품질뿐만 아니라 미생물의 라이프 스타일 (자유 부동 또는 biofilm에 포함)에, physico - 화학 요소에 따라 달라집니다. biofilm 형성은 다양한 메커니즘에 의해 biocides에 대한 저항력을 증진 신진 대사와 연결되어 있습니다. 이러한 현상 따라서 대부분의 bioremediation 프로세스에 권장됩니다. 또한, biofilm 형성을 제어 할 수 엔지니어링 대장균 세포가 성공적으로 적용되었습니다biochips 2-3에서 전체 셀 센서를 고정.
금속의 높은 농도에 대한 미생물의 적응은 셀에 금속을 집중 할 수 다양한 세포 외 기질 구성 요소에 같은 흡착과 같은 메커니즘, 유출 펌프의 작동 또는 특정 이동 통신 사업자를 통해 발생합니다. 유전 공학을 통해이 박테리아 활동을 증폭하는 것은 특히 Raghu 외 의해 설명 된대로 약한 수량에 높은 독성 금속의 경우, 실험실 규모의 금속 오염의 효율적이고 저렴한 치료를 할 수 있습니다. 2,008 4. 세균 개선이 경우에는 이온 교환 수지를 사용하여 클래식 화학 공정에 비해 경쟁력과 비용을 절약 방법을 나타냅니다. 저자는 E. 설명 대장균 섀시는 유 전적으로 여러 사본을 변형하여 다음의 플라스미드 수 있도록 과잉을 유출 펌프 인코딩 유전자 rcnA을 패고, 그리고에 의해 코발트 이해와 첫 보존을위한 설계코발트에 대한 우대 이해와 전송이 있습니다. 이러한 긴장은 방사능이 유출 치료 이온 교환 수지에 대한 효율적인 대안으로 보이지만 핵심 해결되지 않은 문제는 프로세스 (4)의 말에 오염 된 세균의 회복입니다. 우리 연구의 목적은 유리 또는 플라스틱과 같은 비 생물 적 지원에 대항 할 수있는 맞춤 디자인 스트레인 할 수 엔지니어링하는 것이했습니다.
adhesins 및 그람 박테리아에서 확인 자기편 fimbriae의 전체 세트 사이, 우리는 curli 생산을 허용하는 시스템을 설계하기로 결정했습니다. Curli는 E.에서 돌출 얇은 (2-5 나노 미터 직경)와 매우 aggregative 아밀로이드 섬유 아르 비 결정과 불용성 매트릭스 5-7로 대장균 및 살모넬라 균의 표면. Curli도 비 생물 적 표면과 biofilms 8 개발의 식민지에 참여하고 있습니다. Curli 최근 수은 이온에게 9 바인딩 게재되었습니다. Amyloids은 실제로 높은 가지고하는 것으로 알려져 있습니다이러한 잘라 내기 : 2 금속 이온에 대한 친화력 +, 아연 2 +와 철 3 + 10. 이 속성은 더 이상 금속 오염 유출 물들의 정화를 개선 할 수 있습니다. CSG 클러스터는 curli 섬유의 생산을 책임지고 두 divergently 베꼈 operons (그림 1)의 형성되어 있습니다. csgB, csgA 및 csgC 유전자는 두 curli의 subunits, CsgA 및 CsgB을 인코딩 감각의 오페론를 구성합니다. CsgC는 curli의 biogenesis 시스템 내에서 산화 환원 활동에 참여하고 기공 동작 11 CsgG에 영향을 보인다. 그러나, curli - 생산 박테리아의 대부분의 csgC의 부재는 해당 단백질이 curli의 biogenesis 제어 만 secundary 수준을 제공했음을 나타냅니다. 시스템을 단순화하기 위해, 우리는 유전자의 최소 수와 작동하도록 선택되었습니다.
csgDEFG는 규정 및 운송에 필수적인 단백질을 operonencodesCsgA와 CsgB의 세포 표면에. CsgD는 csgBAC 오페론의 전사 활성이며, curli의 fimbriae 및 셀룰로오스 12 다른 biofilm 구성 요소의 생산을 제어하여과 억제 편모 생산 13의 biofilm 형성의 제어에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. CsgE, CsgF과 CsgG는 주요 curli subunit 단백질 CsgA은 수용성 단백질로 분비되는 통해 외부 - 막에 curli 특정 분비 장치를 구성합니다. CsgA의 중합은 막에 바인딩 nucleator 단백질 CsgB (14에서 검토)에 생체에 따라 달라집니다. 여러 두 구성 요소 시스템을 포함하는 복잡한 규제 경로는 curli 유전자 발현 15-16을 제어하는 표시되었습니다. 이러한 복잡한 규정은 박테리아가 환경 단서에 대한 응답으로 curli 생산을 통해 두꺼운 biofilms를 형성 할 수 있지만, 산업용 애플리케이션을위한 제어하기가 어렵습니다. 메트로폴리스의 회복을 촉진하기산업 과정에서 박테리아를 알이 - 박제, 고체 지원 세균 고정은 참으로 잘 정의 된 매개 변수 (들)에 의해 제어해야합니다. curli의 점착성의 속성들은 아밀로이드 자연 17에 연결되어 bioremediation 프로세스를 개선하는 데 사용할 수 있지만, 간단하고 쉽게 제어 장치가 만들어 져야한다.
이 일곱 유전자 18 사이, 5 세트가 절대적으로 curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curli 분비물 복잡한 인코딩)에 대한 유전자 필요는 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. curli의 "자연"규정, 설계 및 합성 된 강력하고 코발트 - overinducible 발기인 (그림 2)의 통제하에이 5 CSG 유전자를 포함하는 합성 오페론을 탈출 할 수 있습니다. curli 인코딩 지역의 단계별 분석 및 기능 SYN에 대한 설계 절차thetic 오페론이 설명되어 있습니다. 폴리스티렌과 유리에 세균 준수를 시각화하고 정량화하는 방법에는 다음 두 가지 방법이 설명되어 있습니다.
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Protocol
1. Curli 오페론의 Biobrick 설계 및 합성
- 유전자 조직을 결정하고 curli 유전자의 내생 전사와 병진 신호를 현지화. 이러한 정보는 해당 RegulonDB 또는 EcoGene B 등의 전문 데이터베이스에 수집 및 관련 출판물의주의 독서를 통해 완료됩니다. 데이터 관리 및 silico의 preanalysis의는 복제 관리자 소프트웨어를 C로 수행되었다.
- 관련 코딩 시퀀스를 선택합니다. curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curlin 분비물 복잡한 인코딩)를위한 다섯 절대적으로 필요한 유전자의 집합은 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. FASTA 형식의 데이터베이스에서 선택한 시퀀스를 추출합니다.
csgGFE 클러스터는 E.의 안티센스이기 때문에 대장균의 게놈은 그 역 보수 counterp에이 시퀀스를 변환> 프로세스 분자> 분자를 반전 복제 관리자 도구 작업을 사용하여 예술. 기능 "Ligate"(클론> Ligate)을 사용하여 csgBA 뒤에 csgEFG 순서를 붙여 넣습니다. - 해당 발기인을 추가합니다. 발기인 P RCN의 통제하에 다섯 선택한 curli 유전자를 배치함으로써 curli는 코발트와 니켈의 존재에 이상 생산 될 것으로 예상하고 있습니다. RCN 궤적은 니켈과 공동 해독 (rcnA)와 같은 종류의 금속 - 레귤레이터 (rcnR)에 대한 책임 유출 펌프를 인코딩합니다. RcnR는 rcnA의 표현과 니켈 및 공동 19에 대한 응답으로 자신의 유전자를 제어합니다. rcnR의 CDS를 포함 RCN 순서는 전체 RCN intergenic 지역 플러스 rcnA의 41 첫번째 세포핵은 csgBAEFG 괴물 같은 순서 (전체 구조의 순서가 보조 데이터로 제공됩니다 그림 1)의 placedin 프런트했다.
- 전사를 최적화신호. 완벽한 ribosome 구속력이 사이트 (또는 완벽 RBS = AAGGAGGTATATA)은 csgBA의 DNA 시퀀스의 첫 번째 ATG 앞에 추가되었습니다. 두 번째 완벽한 RBS는 csgEFG 순서의 앞에 추가되었습니다. csgB 및 csgF 및 csgG 유전자에 대한 내생 RBS가 보존되었습니다.
- iGEM 표준을 맞추려면 장치는 에코 RI에 대한 제한 사이트, 태평양 표준시 I (접두사)와 SPE I 및 Xba I (접미사)를 포함, 표준 BioBrick 접두사와 접미사으로 둘러싸인해야합니다. 장치 D의 각 끝 부분에 해당 시퀀스를 붙여 넣습니다.
- 모든 에코 RI, 태평양 표준시 I, SPE I 및 장치 Xba I 인식 사이트를 제거합니다. 자세한 조립 공정을 촉진하기 위해 BioBrick 부분 자체는 이러한 제한 사이트 중 하나를 포함 할 수 없습니다. 장치의 silico 제한 분석에서 한 PST 나는 csgA 순서에서 사이트 rcnR 순서에서 한 PST I 사이트를 공개csgE 유전자의 하나 에코 RI 사이트입니다. 이 사이트는 각각 장치 순서 (보충 자료)의 위치 80 (Mut1), 1340 (Mut2) 및 1830 (Mut3)를에 위치하고 있으며, 침묵 돌연변이에 의해 다음과 같이 수정되었습니다.
Mut1 PST I 사이트는 CGTCTG에서 변경 CTGCAG
Mut2 PST I 사이트는 CAGCAG에서 변경 CTGCAG
GAATT에서 변경 Mut3 에코 RI 사이트 GAATTC - 복제 관리자 소프트웨어 (운영> 프로세스 분자> 번역 분자)를 사용하여 번역 시뮬레이션을 통해 실행합니다. 야생 유형 curli 단백질과 합성 오페론으로 인코딩 된 단백질 사이의 완벽한 호몰 로지을 확인하기 위해 순서 정렬 프로그램 BLAST를 사용하십시오.
- 합성 오페론를 주문하십시오. 상업 유전자 합성 서비스는 전 세계적으로 수많은 기업에서 사용할 수 있습니다, 우리의 파트너 Genecust (룩셈부르크)였습니다. 인공 오페론 (3,165 BP) 4 μg은 몇 주 후 접수 및 pUC57 (pIG2)에 삽입되었다.
2. 폴리스티렌에 점착성의 박테리아를 시각화하고 정량화
- M63 최소한의 매체 (포도당 0.2 %)의 2 ML과 24 잘 폴리스티렌 판의 각 우물을 입력하고 야간 문화의 106 세포 각 우물을 예방. 흔들림없이 18-48 시간에 30 ° C에서 박테리아를 성장. 각 열 (4 우물)는 양상을 나타냅니다. 필요할 때 적절한 코발트의 양 (25-100 ㎜)과 항생제 (암피실린 100 μg.L -1)을 추가합니다. 24 잘 접시의 3 첫번째 행 3 반복 평균하여 점착성의 세균을 수량화하는 데 사용됩니다, 마지막 행 왼쪽은 biofilm을 시각화하는 데 사용됩니다.
- 24 잘 플레이트의 3 첫번째 행 : 각 잘 들어, planktonic 세포를 포함하는 표면에 뜨는을 복구합니다.
- 조심스럽게 한 M63의 ML과 수영장 2.2에서 얻은 초기 표면에 뜨는있는 한 ML 세척)과 잘 각각 씻어. 이 수영장은 수영장 세포 (= S)로 언급됩니다.
- 한 ML O에서 biofilm을 복구스크랩와 등을 아래로 pipetting하여 F M63 (= B). 와동 15 초. 각 양상에 해당하는 준수 비율을 제공하는 600 나노 미터 (OD600)에서 광학 밀도의 표면 부착 수영 박테리아의 수를 추정합니다.
- 준수의 비율은 수식을 사용하여 계산됩니다 Bx100 / (3xS + B).
- 만 24 잘 접시의 마지막 행의 경우 : planktonic 전지를 폐기하십시오.
- M63 접시의 바닥에 개발 한 biofilm의 1 ML을 씻어.
- 80 1 시간에 열려있는 판을 건조 ° C.
- 잘 표면 첨부 박테리아를 시각화하는 물과 다양한 세차 다음 각에서 2 분 동안 20 % 크리스탈 바이올렛 100 μl를 추가합니다.
세 독립 assays (접시)는 재현성을 보장하기 위해 수행해야합니다.
3. 현미경으로 유리에 점착성의 박테리아를 시각화
- 형광 섀시를 얻을. E. 어떤 constitutivel 대장균 SCC1 전자 스트레인y는 MG1655 20 플라스미드 베어링 합성 curli 오페론에 적합한 호스트 부모 부담로부터 관찰 할 수있는 차이가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하고 있습니다.
- S23 부담을 얻기 위해 pIG2 플라스미드 (에코 RI / PST I pUC57 플라스미드의 사이트에 삽입 = 합성 curli 오페론)을 SCC1을 변환 할 수 있습니다. 제어 변종에게 S24 21 얻을 수 플라스미드 제어 (pUC18)에 SCC1을 변환 할 수 있습니다.
- S23과 컨트롤의 밤 precultures (S24) 30의 변종 ° M63 포도당을 보충 매체 (0.2 %) 및 암피실린 (100 μg.L -1)에서 C를 성장.
- precultures 100 μl와 페트리 접시에서 동일한 매체 15 ML의 예방. 코발트 (예 : 25 μM)의 적절한 농도를 추가하고 코발트없이 부정적인 컨트롤을 잊지 마세요. 각 페트리 접시 3 사각 유리 coverslip을 소개합니다. 떨지 않고 30 ° C에서 하루 아침에 품다.
- 아프로 coverslip을 제거페트리 접시와주의 깊게 배수 m. 모든 박테리아 잔류 물을 닦아으로 70 °의 에탄올를 임신 작은면 물건을 낮은 얼굴을 조심스럽게 닦아주십시오. 공 촛점 관찰은 coverslip의 추가 고정 할 수 있도록 몇 밀리미터에 두 상부 끝을 청소하십시오.
- 점착성의 박테리아는 형광 현미경으로 직접하지만 신속하게 시각화하지만, 조심스럽게 샘플의 건조 방지 할 수 있습니다.
- 공 촛점 관찰를 들어, 얼굴을 배치 biofilm이 적용 위쪽 얼굴을 유리 슬라이드에 coverslip을 입금. biofilm 그런 다음 광택이있는 유리 슬라이드에 고정되어있는 큰 coverslip,로 덮여 있습니다. biofilm 이제 낮은 얼굴에 수 있도록 설정을 반전.
- 공 촛점 레이저 현미경으로 설치를 놓습니다. 오른쪽 Axioplan2 LSM510 (Zeiss) 공 촛점 레이저 현미경은 Platim 플랫폼 F에서 사용되었다.
- 설정합니다. 일으키다 488 nm의에서 GFP 및 범위의 세균 형광 500-600 nm의 수집 . 공 촛점 모드를 스캔 레이저의 이미지를 획득을위한 40x 기름 침지 목표를 사용합니다. 1 μm의 단계를 사용하여 고체 표면에서 성장 매체와 인터페이스에 biofilms의 전체 입체 구조를 검사합니다.
- IMARIS 소프트웨어 (Bitplane, 스위스 취리히)의 입체 투영을 수행합니다. 통계 세로 섹션을 따라 평균 Z 값의 분석에 의해 biofilm의 두께를 결정합니다. 다른 곳에서 22에 설명 된대로 biofilm의 biovolumes의 정량화는 공 촛점 Z-스택에서 추출 할 수 있습니다.
RegulonDB는 전사 단위, 발기인 및 시그마 유형, 유전자 및 ribosome 바인딩 사이트, 터미네이터, 특정 전사 규제 당국의 구속 사이트뿐만 아니라, 규제 문구로 자신의 조직에 오페론의 구조 및 분해에 대한 기계론의 정보를 제공합니다.동부 표준시 = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
B EcoGene 데이터베이스는 E.에 대한 최신 정보가 포함되어 있습니다 대장균 K-12 게놈과 광범위한 유전자 참고 문헌을 포함하여 프로테옴 시퀀스. 주요 EcoGene의 초점은 번역 시작 사이트의 재평가되었습니다. http://ecogene.org/
C http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
d 개 http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
춘 차우 Sze, 난 양은 기술 대학, 싱가포르의 전자 선물.
F Platim 현미경 플랫폼 UMS3444 BioSciences 모이는 - 리옹 수드.
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Representative Results
E.의 야생 타입 CSG 시퀀스의 silico 특수 효과의 전사와 병진 신호의 최적화와 관련된 대장균 K12는 단일 합성 curli 오페론 P RCN-CSG는 그림 3 (보조 데이터의 전체 순서)에 표시된 설계 할 수있다. 프로토콜 2 프로토콜 3 curli 생산과 관련된 준수를 시각화하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 크리스탈 바이올렛 염색 (protocole 2) 각도의 하단에 biofilm 형성을 사용하면 빠르게 보여 질과 보라색 색상 강도의 차이에 의해 그림과 같이 야생 형 스트레인 엔지니어링 부담보다 자기편 것 같습니다 수 있습니다 (그림 4A). 이 질적 접근 방식은 준수의 비율은 엔지니어링 변형 (그림 4B)에서 1.5 배 높은 것으로 나타 정량 측정에 의해 강화된다. quantita의 또한, 정확성 tive 접근 방법은 코발트의 증가 농도의 존재에 준수의 중요한 강화 측정 할 수 있습니다. 실제로, 0 μM, 25 μM 또는 50 μm의 코발트 농도와 미디어, 자기편 세포의 비율이 25 %, 30 % 각각 40% (그림 4B)를 다가 갈 수 있습니다. 준수 능력은 유리 슬라이드에 성장 GFP 태그 박테리아와 현미경을 사용하여 비교할 수 있습니다. Epifluorescence 현미경 관찰 (검은 색 배경에 녹색 박테리아)는 엔지니어링 스트레인 야생 유형 변형은 마이크로 식민지 (그림 5)을 형성 반면 biofilm로 간주 여러 층 대형 통합을 형성하는 것을 알 수있다. 공 촛점 현미경 분석은 biofilm 입체 구조의 전체보기를 제공하고 엔지니어링 스트레인 밀도와 두께 biofilm (그림 6)을 형성, 더 자기편임을 확인합니다.
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1 그림. Curli 야생 형 시스템입니다. curli은 csgB와 csgA 유전자에 의해 인코딩이 단량체로 구성됩니다. 자신의 신호 펩티드 덕분에 CsgA 및 CsgB curli의 단량체는 초 시스템을 통해 세포질 막에 걸쳐 translocated 있습니다. 즉 세 가지 주요 구성 요소, CsgE, CsgF 및 CsgG 구성 특정 기계의 외부 막에 걸쳐 curli의 단량체의 translocation 수 있습니다.
그림 2. 강하고 코발트 inducible - 프로모터 (BBa_K540001). 발기인 P rcnA는 전사 억제 RcnR에 의해 제어됩니다. rcnR 유전자는 P rcnA에서 divergently, 그 내생 발기인 P rcnR에서 베꼈 있습니다. rcnR 유전자의 존재는 P rcnA 규제 대 억제 사본 올바른 비율을 보장합니다지역. 코발트의 부재에서 RcnR는 DNA에 RcnR 상자에 바인딩하고 하류 유전자의 전체 전사 활성화를 방지 할 수 있습니다. 코발트 상승의 세포 내 농도 경우, RcnR 단백질에 코발트의 바인딩 PrcnA 증가 19 발기인과 전사 활동을 억제의 고정 것을 방지 할 수 있습니다.
그림 3. 합성 curli의 오페론. Curli 유전자는 P rcnA의 통제하에 게재됩니다. 자신의 발기인의 표현 rcnR 유전자 충분히 억제 코발트 의존 방식으로 curli 유전자의 표현을 제어 할 제공해야합니다. curli 단량체 생산 과잉 (CsgB 및 CsgA), curli 특정 분비 장치의 구성 요소 (CsgE, CsgF 및 CsgG)에 의한 periplasmic 교통 체증을 피하기 위해 것도 overproduced해야합니다. 추가 traductional 신호에 회색 (RBS = 완벽한 RBS)에 dicated. E = 에코 RI X = Xba I S = SPH I P = 태평양 표준시 I. Bba_K540000라고이 합성 부분은 엔지니어링 스트레인 curli의 과잉을 통해 유리, 모래 또는 플라스틱에 자기편이 될 수 있습니다.
4 그림. 24 잘 폴리스티렌 판에있는 자기편 박테리아의 시각화 및 정량화. A. 크리스탈 바이올렛 스테인드의 biofilm은 폴리스티렌에 점착성의 세균에 의해 형성. 야생 유형과 코발트의 다양한 농도와 엔지니어링 긴장의 폴리스티렌에 대한 준수 B. 비율. 트리트먼트 사이의 통계 차이가 소문자 (; P <0.05 차이와 피셔의 최소 상당한 차이 시험 분석)로 표시됩니다.
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그림 5. 자기편 GFP 태그 유리 슬라이드에 박테리아를. 박테리아의 Epifluorescence 현미경 이미지는 검은 배경에 녹색입니다. 화살표는 microcolonies에서 지적한다.
6 그림. 공 촛점 microscropy은 유리 슬라이드에 biofilm 구조의 세 차원 reconstructions을 도와 주었던 : A. 톱보기 reconstructions B. 사이드 뷰 reconstructions.
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Discussion
중요 단계
이 합성 생물학의 접근에서 가장 중요한 단계는 유전자 디자인입니다. 합성 유전자 디자인은 효율적인 시스템 생산을 보장 할 수 세심한 할 수 있습니다. 핵 유출의 바이오 정화, 자신의 분비 시스템에 관련된 단백질을 인코딩 섬유 단량체 세 유전자를 인코딩 두 유전자는 소설 응용 프로그램을위한 새로운 기능 단위를 만들려면 강력한 금속 inducible 발기인으로 조립되었습니다. 계획 및 예측,이 장치는 매체에 코발트의 양을 증가에 의해 강화하는 향상된 높은 curli 생산,로 연결됩니다. 선택한 발기인 (P rcnA)에 해당 전사 신호, 그리고 효율적인 병진 신호 모두의 존재의 이러한 성공 결과는 curli 유전자의 각 세트 (csgBA 및 csgEFG) (그림 3 참조) 앞에 추가되었습니다. 또한, multicopy 플라스미드, 관심과 함께 작업 할 때 발기인 컨트롤에 관련된 레귤레이터의 사본 번호 (들)에 지불해야합니다. 여기 사용 된 발기인 (P rcnA)의 주요 레귤레이터 RcnR의 multicopies는 동일한 플라스미드 (그림 3)에서 제공되었습니다.
제한, 가능한 수정
완벽한 reproductibility을 보장하기 위해 준수 테스트 (표 참조) 폴리스티렌 플레이트의 동일한 브랜드에서 실시되는 항상 있습니다. 형광 현미경은 형광 태그 긴장과 쉽게하지만, 이러한 요구 사항은 이러한 Syto, 또는 플라스미드 수행 LAC-GFP의 fusions 23과 같은 형광 염료를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 이러한 폴리스티렌과 유리와 같은 비 생물 적 표면에 세균 첨부 파일 매체의 이온 강도 또는 osmolarity에 따라 달라집니다. 최상의 결과는 일반적으로 최소한 중간이나 희석 LB 22, 24에 얻을 수 있습니다.
미래의 응용 프로그램 또는 마스터 후 방향이 기법
내용 ">이 방법은 박테리아 준수는 신속하고 저렴 계량화하려면 여기를 설명했다. 그러나, 긴장이나 문화 조건의 많은 성격 및 / 또는 biofilms에 대한 자세한 구조 특성, 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경을 바탕으로 높은 처리량 방법을 얻기 위해 96 잘 microtiter 플레이트의 사용과 결합 25 고려되어야한다.MBEC 검사 시스템, 이전 캘거리 Biofilm 장치 (26)도 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 물 테이블 sonicator (에 sonication에 의해 중단 후 biofilm의 biofilm 구조 27, 또는 세포의 정량화의 현미경 관찰을 허용 96 나무못의 하층를 개최 이동식 뚜껑이있는 microtiter 플레이트의 사용을 기반으로합니다 MBEC 높은 처리량 ( HTP) 분석, Innovotech, 에드먼턴, 캐나다). 다른 시스템, Biofilm 링 테스트, 문화 매체에 포함 된 불활성 상자성체의 비즈가 형성 기간 동안 고정하는 방법을 모니터링biofilm 28 및 biofilm 형성을 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. MBEC과 Biofilm 링 테스트 본 연구에 사용 된 기본 소모품보다 더 비싼 구체적인 자료가 필요합니다.
기존의 방법에 관하여 기술의 의의
합성 방법은 여기에 설명 된, 내부 에코 RI 및 PST I 제한 사이트 및 ligations 다음 PCR 단계를 제거 할 mutagenesis를 포함하는 고전적인 방법 : 하나의 독립적 인 curli 오페론을 만들려면, 우리는 병렬로 두 가지 방법을 시도. 두 접근 방법은 같은 시간에 시작하지만, 고전 방법으로 얻은 오페론의 시퀀싱 분석 바람직하지 않은 변이를 공개했다. 따라서, 장치의 합성 더 효율적이고 클래식 복제 및 mutagenesis 절차보다 더 빠른했습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 리옹 인사 - 엔터프라이즈 네트워크의 iGEM 팀 (Viviane Chansavang, 마틸다 Dumond, 알렉산더 Duprey, 멜라니 Geffroy, Clémence Gonthier, 마고 Jaulin, 아루 레이 하겐, Goki 리, 토마스 Poinsot, 베릴 Royer - 버트 란드, 줄리 Soula, 마이클 Vonzy의 다른 회원들에게 감사 , 피에르 이브 Zundel, Soufiane Bouhmadi, 올리비에 Brette, 게일 Chambonnier, 로라 Izard, Aurianne Kroiss, 필립 Lejeune, 아그네스 Rodrigue, 아르노 Rondelet, Sylvie Reverchon와 발레리 Desjardin)의 재정적 인 지원을위한 후원자 (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation 인사, 엔터프라이즈 네트워크 - 리옹 (Lyon)과 Biosciences 인사 - 리옹 (Lyon)의 부), 중요한이 원고의 읽기, 스트레인 선물 박사 CC의 Sze를위한 F. Wisniewski - 염료. 작살 줄에 달린 부표 B.는 박사 학위를받은 지역 론 알프에서 교제.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
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