Summary
인간화 마우스를 사용하여 종양 특정 T 세포의 생성 및 특성이 여기에 설명되어 있습니다. 인간 thymic 조직 및 유전자 변형 인간의 조혈 줄기 세포는 면역 저하 된 쥐에 이식되어 있습니다. 안티 종양 면역 반응의 생체 시험에서 허용하는 엔지니어링 인간의 면역 시스템의 reconstitution에이 발생합니다.
Abstract
같은 마우스와 같은 작은 동물 모델은 광범위하게 인간의 질병을 연구하고 새로운 치료 개입을 개발하는 데 사용되었습니다. 정보의 풍부한이 연구에서 얻은에도 불구하고, 마우스 면역뿐만 아니라 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염과 같은 바이러스 성 질병의 종 특이성의 독특한 특성은 인간화 마우스 모델의 개발되었다. 이전 모델은 C. B 17 SCID / SCID 마우스와 칭했다 인간의 태아 thymus와 태아 간 이식의 사용을 포함 네 / 리브 (SCID-후) 1, 2 또는 인간의 말초 혈액 백혈구의 입양 전송 (SCID-huPBL ) 3. 두 모델은 주로 HIV 감염의 연구에 활용되었다.
이러한 모델 모두의 주요 한계 중 하나는 그들에게 HIV 질환을 연구 할 수있는 더 많은 생리 학적 관련성이 높은 모델을 할 수있는 주변의 인간 면역 세포의 안정적 reconstitution의 부족이었다. 이를 위해, BLT 흠anized 마우스 모델은 개발되었습니다. BLT는 골수 / 간 / thymus을 의미합니다. 이 모델에서 6~8주 오래된 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) 면역 저하 마우스는 두 번째 인간의 조혈 줄기 세포 이식 네 뒤에 할 만 SCID-후 마우스 모델에서와 같이 네 / 리브 이식을받을 수 있습니다. 이 시스템의 장점은 주변에있는 인간의 면역 체계의 전체 reconstitution입니다. 이 모델은 HIV 감염 및 지연 5-8을 연구하는 데 사용되었습니다.
우리는 유 전적으로 hHSC 7, 9 autologous transduced의 주입 다음 네 / 리브 임플란트를 구성하는 인간의 조혈 줄기 세포 (hHSC)을 수정 사용되는이 모델의 수정 된 버전을 생성합니다. 이 방법은 유전자 변형 lineages의 세대에 결과를 표시합니다. 더 중요한 것은, 우리는 흑색 증 특정 T 세포 수용체를 표현하는 기능 세포 독성 T 세포 (CTL)을 생성의 가능성을 검토하는이 시스템을 적응. 이 모델을 사용하여 우리는 종양 회귀 (9) 결정하기 위해 라이브 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상을 활용하여 우리의 유전자 변형 CTL의 기능을 평가 할 수있었습니다.
이 프로토콜의 목적은 이러한 유전자 변형 쥐를 생성하고 실시간으로 PET 영상을 사용하여 생체 효능에 평가의 과정을 설명하는 것입니다. 우리가 인간의 조직 및 lentiviral 벡터를 사용 있기 때문에 참고로, 우리의 부대 시설로는 특별한주의 (BSL2 +)와 바이오 레벨 2 (BSL2)에 대한 CDC NIH 지침을 따릅니다. 또한, NSG 쥐가 심각하므로 면역 저하되며, 자신의 주택 및 유지 보수가 가장 높은 건강 수준 (을 준수해야합니다 http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).
Protocol
BLT 마우스 A. 생성
태아 조직 및 CD34 인간의 조혈 줄기 세포의 준비 (1) 처리, (2) 인간의 조직의 이식, 그리고 (3) 이차 이식 : BLT 마우스의 세대는 3 부분으로 나누어 져 있습니다. 모든 프로토콜의 경우, 우리는 시약 정보를 표 1를 제공합니다.
1. CD34 인간 조혈 줄기 세포의 조직 재생 및 절연
다양한 장기 조달 기관에서 얼음에 박 출하 신선한 태아 조직이나 조직 사용할 수 있습니다. 매체 주변의 밀리리터 당 혈액 한천에 1,000 세균 콜로니의 생산에 의해 입증으로 종종 태아 조직은 멸균되지 않습니다. 우리는 정기적으로 살균 PBS의 40 ML에 두 번 조직을 씻는다. 이 모든 박테리아를 제거하지 않지만, 그것은에있는 박테리아에있는받는 마우스 대부분의 굴복을 성공적으로 이식 시리즈와 결과 사이의 차이를 만들 수 있습니다fection. 추가 단계로서, 상기 항생제의 존재에 우리가 문화 세포 현탁액을 조직을 소독합니다.
태아 Thymic 조직 1.1 가공
- 표백제의 비커에 매체를 주입하고 표백제로 슬라이딩에서 조직을 방지하기 위해 메스를 사용하여 thymus을 씻는다. PBS로 관을 입력합니다. 캡과 thymus을 씻어 몇 번 반전. 표백제에 가만히 따르다 표면에 뜨는. 반복합니다.
- RPMI 8 ML의 thymus 조직 +이 메스와 1.5-2 밀리미터 조각에 60 mm 요리와 전단에서 10 % 소 태아 혈청를 놓습니다. 메스와 전단은 찢어과 조직 비트를 손상 최소화합니다. 손상된 조직은 주입 바늘로 그릴, 붓 끈적하고, 어려워 질하는 경향이있다. 획득 비트의 수는 transplantable 마우스의 첫 상한입니다.
- T25 플라스크에 25 ML의 pipet (조직의 손상을 최소화하기 위해)와 정지 비트를 전송합니다. 밤새 술병과 문화에 piptazo (Zosyn)의 70 μl를 추가
태아 간 조직 1.2 가공
- 단계 1.1.1에서와 같이 간을 씻으십시오.
- 100mm 페트리 접시에 Iscove의 매체와 가만히 따르다 모든 10 ML을 추가합니다.
- 이 메스로 작은 (~ 3 ㎜) 조각으로 간을 세분화. 당신이 백인 결합 조직으로 실행하는 경우, 그것으로부터 간을 긁어 표백제에 폐기하십시오.
- 16 게이지 무딘 바늘 3 ~ 4 시간, 50 ML 튜브에 전송을 갖추고 12 ML의 주사기로 빨아하여 조직을 균질화.
- 다음과 같이 조직 소화의 효소를 준비 : collagenase 유형 IV (1 MG / ML), hyaluronidase (1 MG / ML), DNase I (2 U / : Iscove의 50 ML 튜브에 10 ML에게 각 200 μl를 추가합니다 ML).
- 12 ML의 주사기에 효소를 그려와 0.22 μ 필터로 적합. enzy를 필터링저 / 세포 현탁액에 직접 매체입니다.
- 캡과 Parafilm으로 셀을 밀봉. 90 분에 37 ° C에서 회전합니다.
- 100 μ 셀 스트레이너와 함께 50 ML 튜브를 설정합니다. Pipet 셀이 여과기를 통해 소화.
- 최대 50 ML에 볼륨을 가져 셀에 PBS를 추가합니다. 25 ML의 두 튜브로이 분할.
- Ficoll의 10 ML로 세포를 밑받침. 브레이크없이 20 분에 2,400 rpm으로 회전.
- 인터페이스는 두께해야합니다. 5 ML의 pipet과 다른 튜브로 전송로를 빨아. 당신은 인터페이스의 두 튜브가 있어야합니다. 10 분에 1,200 rpm으로 각각의 스핀에 PBS의 50 ML을 추가합니다.
- 한 튜브로 알약을 결합하고 PBS는 2 %의 FCS를 포함하는 더 많은 세 번 씻는다.
- 마지막으로 RPMI + 10% FCS와 trypan 파랑을 사용하여 카운트 세포의 50 ML에 일시 중지됩니다. 조직의 크기에 따라 10 8 ~ 10 9 총 간세포로 이동할 수 있습니다.
- T150 플라스크에 세포를 전송하고 RPMI + 10% FCS의 30 ML과 0.8 m를 추가piptazo의 리터.
- 37 1-1.5 시간에 품다 ° C 자기편 세포를 제거 할 수 있습니다.
1.3 정렬 및 CD34 조혈 줄기 세포의 형질 도입
- 단계 1.2.15에서 세포의 첨부 파일 후, 느슨한 세포를 제거하기 위해 잠시 동안 부드럽게 앞뒤로 휴대용 술병을 선동. 섬유 아세포와 표면에 이러한 건방진 많이있을 것입니다.
- 1-20 희석을 사용하여 다시 계산하고 세포의 총 수를 기록합니다. 나중에 얼룩에 대한 ML의 몇 에바를 저장합니다. 귀하의 초기 세포 카운트 (단계 1.2.13)에서 약 30 % 이하의 세포가 있어야합니다.
- 스핀 다운 및 Mac 버퍼의 40 ML로 두 번 씻어.
- CD34 세포는 Miltenyi 생명 공학의 CD34 직접 키트를 사용하여 정렬됩니다. 우리는 분명 같은 회사에서 제공하는 LS 열을 사용하여 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 복구 된 세포는 5 ML에있을 것입니다. 센 총 셀을 계산합니다. CD34 + 세포의 수율은 총 세포 수가 3 ~ 5 %가됩니다. 이 일에 따라 달라집니다태아 간 전자 시대. 젊은 태아 간은 CD34 + 세포의 높은 수율을 제공하는 경향이 있습니다.
- 1x10 6 세포의 수를 나눕니다. 이 transplantable 마우스의 두 번째 상한을 제공합니다.
- CD34-분율 (를 통해 흐름과 세차)와 예약 여섯 마우스 당 X 10 6 이식 할 세어보세요. RPMI + 10% 태아 송아지 혈청 50-80 ML의 밤 문화 셀 + 1 % piptazo.
- 귀하의 lentiviral 벡터와 밤새 CD34 + 세포를 Transduce. 우리는 분명 제조업체의 지침에 따라 다카라하여 retronectin을 사용합니다.
- 다음 날, 추수 CD34-세포, transfected CD34 + 세포와 수.
- 반으로 CD34 + 세포를 분할 : 제 A와 파트 B.
- 부에게 CD34 + transduced 세포를 스핀 다운 및 냉동 중간 4 ~ 6 ML (RPMI는 + 10% FCS는 0.22 μ 살균 + 10% DMSO, 필터링)에 일시 중지됩니다. "huFetalCD34"병에 세포의 수, 날짜 및 이니셜로 동결 튜브 및 라벨에 한 ML aliquots 놔.
- 각 마우스가 0.5x10 6 부 조합 B CD34 +는 세포와 4.5x10 살균 나사 캡 microfuge 튜브 6 CD34-세포 펠렛과 얼음 계속을 transduced. 또한 얼음에 Matrigel (BD Biosciences)의 관을 해동. (단계 2.10로 이동)를 사용 할 때까지 모든 관은 얼음에 보관해야합니다.
2. 조직 이식
이 단계의 목표는 NSG 마우스 신장 캡슐에서 인간의 태아 thymus / 간 organoid를 이식하는 것입니다. 인간의 조혈 줄기 세포는 다른 T 세포 및 기타 림프 lineages에 자신의 차별화를위한 사이트로 인간의 thymus이 아닌 마우스를 사용하므로이 organoid 더 나은 인간 T 세포의 선택과 성숙 프로세스의 과정을 모방 한 것이 었지요. 이식 과정에서 CD34-세포의 사용은 다시 생성 태아 간 기질과 임플란트의 더 나은 이식과 성장을 허용하는 것입니다. 사용 NSG 마우스의 시대가 6-8주 오래된 것입니다.
- 스와에 대한 약물의 준비rgery :
- Isoflurane : 2 인치 거즈 패드를 걷어하고 15 ML의 screwcap의 원심 분리기 튜브에 다 쑤셔. 직접 병에서 isoflurane의 약 1 ML에 넣어.
- 케타민 / zylazine : 분사에 대한 생리의 20 ML의 유리 병에 케타민 (Ketaset) (100 MG / ML)의 0.52 ML과 xylazine (Anased) (100 MG / ML)의 0.52 ML을 추가합니다. 필요한 때까지 최초의 만기 구성 요소의 유효 기간이있는 레이블을 유지는 -20 ° C에서 냉동.
- Carprofen (Rimadyl). 단지 수술하기 전에이 작업을 희석. 1 ML의 주사기와 25g까지 바늘로 유리 병에서 0.1 또는 0.2 ML을 인출하여 1:100을 희석. 주입을위한 생리의 10 또는 20 ML에 주입. 라벨 및 날짜. 만 하루 동안 냉장고에 보관. 25g까지 바늘을 갖춘 3 ML 주사기로로드합니다.
- 수술에 대한 테이블을 설정합니다. 멸균 블루 패드, 각 외과 의사에 대한 살균 수건으로 다룹니다. 4 "가위, 곡선 무딘 집게 필요 : 각 외과 의사가 소독 장비 자신의 상자에서 도착르 코 집게, hemostat, 16G 지내냐 trochar, 그리고 상처 클립 작은 주걱. 또한, 그들은 곡선 바늘 Vicryl의 봉합, 이소프로판올의 스택 패킷을 닦아, PBS의 35mm 페트리 접시, 그리고 PBS로 가득 1 ML의 주사기가 필요합니다.
- 표 Betadine의 2cm, 2 면봉과 유리 Coplin 병의 중간에 설정합니다. 60mm 페트리 접시에 thymus 비트를 넣어.
- 마취는 별도의 테이블 또는 멸균 블루 패드로 덮여 후드에서 수행됩니다. 두 개의 작은 선반과 쥐를 개최 할 수있는 비커와 전자 밸런스를 설정합니다. carprofen의 3 ML의 주사기를 개최 할 케타민 / xylazine 및 기타와 함께로드 0.5 ML X 28G 인슐린 주사기를 개최 한 랙을 사용합니다. 또한 면도 털을 보유 근처의 생물학적 폐기물 컨테이너를 이동합니다.
- 케타민 / xylazine의 15 μl / g의 용량으로 평균 무게와로드 주사기를 얻을 새장에있는 모든 쥐 (이전 6~8주)를 무게. 새장에있는 모든 쥐를 주사.
- 쥐가 느린 받고 나면 자신의 lef 면도엉덩이에서 다시의 중심과 제 40 블레이드와 Oster 깎기와 배 사이의 어깨에 t면. 자신의 체중을 기록하고, 번호에 대한 자신의 귀를 뚫어 요.
- 어깨 너머로 피하 0.3 ML carprofen를 삽입.
- 손을 쥐어하여 마우스의 마취 수준을 확인합니다. 마우스 flinches 경우, 12 초 동안 튜브에서 isoflurane을 관리 할 수 있습니다. 다시의 개발 짜를 사용해보십시오. 앞발로 땅을 차다 반사가 사라질 때까지 isoflurane의 짧은 샷을 제공 할. 왼쪽을 향해 그 오른쪽에 마우스를 놓는다.
- 팁 제기 라운드 16 게이지 암 주입 바늘은 조직을 삽입하는 데 사용됩니다. trochar에게 PBS의 접시에 몇 번을 플러시. 그냥 팁 내부의로드와는 수평 있죠. needlenose 포셉과 thymus의 조각을 추가하고 밀어 넣어
- 도우미는 Eppendorf 긍정적 인 변위 pipet과 세포 중 하나가 관 (단계 1.3.12)에 추위 Matrigel의 5 μl를 추가하고, 부드러운 감동이 조화를 이루고 있습니다. 의사 홀리도우미 trochar에 Matrigel 믹스를 pipets로 DS trochar는 수평으로 천천히 다시로드를 가져옵니다. 믹스는 상온에서 젤.
- Betadine으로 노출 된 피부를 채취. 그런 다음 이소프로판올이 닦아와 함께 닦아. 반복합니다.
- 피부 아래의 비장를 찾습니다. 그것은 어두운 장소입니다. 마우스의 신장은 면도 피부를 통해 볼 수있는 비장 등쪽 5mm에 대해 위치해 있습니다.
- 무딘 집게와 함께이 곳을 통해 피부를 들고 약 15 mm 길이 비장에 절단 선을합니다. 아래 복막의 근육 층에서 비슷한 상처를합니다. 남성에서, 신장에 직접 표시해야합니다 그리고 당신은 간단히만으로는 복부를 당겨해야합니다. 여성에서는 hemostat과 난소을 선택하고 신장을 드래그 할 수 있습니다. 이 몸의 외부 신장을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 남성의 경우 신장이 노출 유지하기 위해 왼쪽 손으로 복부에 압력을 유지해야합니다.
- posterio에 작은 구멍을 따신장 캡슐의 연구 끝. 그게 좀 피 할 수 있습니다.
- trochar의 구멍이 완전히 신장 캡슐이 적용 될 때까지이 구멍에와 신장 따라 trochar을 슬라이드. 그런 다음 오른쪽의 작은 손가락을 사용하여 조직을 주입.
- 폐쇄 hemostat와 함께 다시 부드럽게의 신장을 밀어 넣습니다. 더블 아는와 연결된 복막에 한 바늘을 넣는다. 지갑처럼 피부를 당겨와 두 개의 상처 클립에 넣어.
- 각 눈에 PBS의 방울을 넣고 케이지 침구에 옆으로 마우스를 놓여 있었다. 모든 쥐가를 떠나기 전에 자신의 배에 누워으로 돌아했는지 확인하십시오.
- 다음 날, 각 마우스에게 carprofen의 또 다른 기회를 제공합니다.
3. 차 이식
BLT 마우스의 생성이 단계의 목표는 인간의 조혈 줄기 세포와 moue 골수를 작성하는 것입니다. 절차 (2)에서 이식 된 임플란트는 일의 전체 reconstitution을 지원하기에 충분하지 않습니다이 마우스의 전자 인간의 면역 시스템입니다. 보조 이식 동안, 우리는 하위 lethally 따라서 인간의 CD34 + 세포의 주입을위한 "공간"을 생성 손쥐 골수 세포를 고갈하는 쥐를 비추다.
- 4 ~ 6 주 후에 2.7 GY으로 쥐를 비추다. 쥐들이 부 CD34 + transduced 세포와 같은 날 주입됩니다. 기간은 2 단계에서 이식 네 / 리브 보형물의 설립과 성장에 기반을두고 있습니다. 일반적으로이 기간 동안 임플란트는 우리가 다음 단계로 진행 할 수 있도록 크게 성장했습니다.
- 부에게 CD34 + transduced 세포를 해동, 씻고 5x10 6 / ML의 농도에 중간에 일시 중지됩니다.
- 마우스 중 하나 케이지 (각 케이지 5 마우스의 최대를 포함)에 대한 세포의 0.1 ML (10 5 마우스 당 0.1 ML 당 5x10 5 세포)와 0.5 ML X 28G 인슐린 주사기를로드하고 거리에 마주 랙에 눕기.
- 를 scruffing과를 개최하여 isoflurane 관과 마우스를 마취20 초 동안 튜브의 코. 시간을 추적 할 계산합니다.
- 그런 다음 오른쪽으로 직면하고, 엄지 손가락과 왼손의 집게 손가락으로 단단히의 목에 피부를 당긴다. 그 오른쪽 눈 아웃 bulges 수 있도록 셋째 찾기와의 턱 아래에 누르십시오. 마우스의 머리의 긴 축에 평행 주사기 들고 눈 뒤에 바늘을 살짝하고 멈출 때까지 부드럽게 밀어 넣습니다. 추가를 누르하지만, 약 2 초 이상 부하를 삽입하지 마십시오.
- 2 ~ 3 개월 후에 마우스는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 유리 피펫을 사용하여 retroorbitally 출혈이 있습니다. 귀하는 마우스 당 한달에 혈액 200 μl의 최대를 취할 수 있습니다. 피 50-100 μl는 FACS 분석을위한 충분해야합니다. 다른 출혈이 전략은 얼굴 정맥 흘러요와 꼬리 정맥 흘러요이 포함되어 있습니다. 후자는 당신에게 여러 assays에 충분하지 않을 수 있습니다 혈액의 아주 작은 볼륨을 제공 할 것입니다.
- 혈액 샘플은 reconstitution을 평가하는 인간 림프구 마커 CD45의 표현에 얼룩이 있습니다. Blood 샘플은 1 ML 적혈구 용해 버퍼 (160 MM NH 4 망할 CIA, 100 MM KHCO 3, 0.01 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 추가하고 실온에서 5 분 동안 incubated 수 있습니다.
- 용해 버퍼, 1,200 rpm으로 5 분, 그리고 반복 필요한 경우에 세포를 씻으십시오.
- 3.8에서와 같이 세포를 원심 분리기와 3퍼센트 태아 송아지 혈청 (FACS-PBS)으로 보충 PBS에 씻는다.
- 표면에 뜨는 제거 및 100 μl FACS-PBS에 다시 일시 중지 알약.
- 인간 림프구 reconstitution을 평가하기 위해 항체를 추가합니다. 우리는 일반적으로 다음과 CD45 (인간 림프구 마커), CD8, CD4, CD14와 대 식세포와 단핵 세포에 CD16, B 세포에 CD19와 NK 세포에 대한 CD56이 포함되어 있습니다.
- 30 분에 4 ° C에서 알을 품다.
- 단계 3.9에서와 같이 세탁 및 FACS 분석을위한 2 % paraformaldehyde에서 셀을 다시 일시 중지합니다.
- 마우스를 재구성하는 경우, 우리는 종양 주사를 진행합니다. 인간 림프구의 Reconstitution 수준은 1 % 미만에서 총 혈액 세포의 40 %까지 다양합니다. lymphoc의 수준과 종류yte lineages 한 건강 인간의 혈액 기증자에서 기대할 수있는 무엇에 비교할 수 있습니다. 그러나, 그렇게는 비-T 세포 lineages의 수가 변동을 기대합니다. 숫자가 12 주 기간 내에 허용되지 않습니다 경우 단계 3.1에서 보조 이식 절차를 반복 수 있습니다.
- 종양 세포 라인은 제조업체의 또는 실험실의 추천에 따라 배양하고 있습니다. 셀은 1:1 비율 (50 μl cells/50 μl matrigel)에서 수확 세척 및 matrigel에 resuspended 있습니다. 샘플은 항상 얼음에 보관됩니다.
- 마우스 anesthetized, 사출 분야에서 면도 있습니다. 지역은 이소프로판올 패드를 사용하여 소독하고 있습니다. 사전에 도우미로드 셀 정지는 23G 1 ML의 주사기를 냉각. 종양 세포는 피하 주사합니다. 항생제 연고와 주사의 사이트를 취급합니다. 종양 수립과 4 주 동안 성장을 시작해야합니다.
생체 양전자 방출 단층 촬영 (PET)에 B.
우리의 연구에 대한 우리 시험오프라인 포도당 통풍 관 ([18 F]-fluorodeoxyglucose ([18 F] FDG) 따라서 마우스는 사전 영상. MicroPET / CT 검사에 4-6 시간을 금식하는 microPET Inveon 스캐너 (지멘스 잠복기 솔루션)와 MicroCATII 중부 표준시 스캐너를 사용 (완료 지멘스 PreclinicalSolutions). 이미지 분석 OsiriX (Pixmeo, 스위스) 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 목표는 종양의 대사 활동을 측정하고, 궁극적으로 물리적으로 종양 회귀을 측정의 대안으로 PET 영상을 사용하는 것입니다. 그림 2에서와 같이 우리 실제 모양과 크기를 기반으로 종양 발생했습니다 것은 대상이지만 라이브 PET 영상은 광범위한 조직 괴사를 공개하지 않습니다.이 방법은 종양 회귀의 더 민감하고 정확한 지표 역할을 할 수 있습니다.
- anesthetizing (2 % isofluorane) 쥐 한 챔버, 그리고 PET 스캔 ( "챔버 대기") 전에 FDG의 60 분의 통풍 관으로 하나 챔버를 지정합니다. 두 방에 파란색 패드를 놓습니다.
- 동물 anesth 있으므로오랜 기간 동안 etized, 그것들은 전자 레인지에 데워와 열 패드에 새장을 배치 아르 물 가득 장갑의 사용을 통해 30 ° C에서 따뜻한 보관해야합니다.
- 이 방을위한 isoflurane 흐름을 켜십시오. isoflurane은 챔버에 쥐를 걸기 전에 약 5-10 분에 대한 anesthetizing 방을 작성 할 수 있습니다. 뚜껑이 isoflurane 누출 방지하기 위해 긴밀하게 고정하고 폐쇄되어 있는지 확인하십시오.
- anesthetizing 챔버에 처음으로 마우스를 놓고 단단히 뚜껑을 잠글. 5-10 분 허용하거나 마우스 의식이 될 때까지.
- anesthetizing 챔버, 라벨 마우스의 꼬리 (케이지 당 다른 색깔)에서 마우스를 제거하고 함께 intraperitoneally 마우스를 주입 [18 F] FDG (80 μCi). 마우스가 주입 된 시간의 노트를보세요. 마우스가 10 분 PET 스캔에 설정을 허용, 다시 timepoint에서 50 분 anesthetized 될 것입니다 (60 분 총 [18 F] PET 스캔하기 전에 FDG의 이해).
- 수 있도록 대기 챔버에 주입 마우스를 놓고 [18 F] PET 스캔하기 전에 1 시간을위한 FDG의 이해. 뚜껑을 잠글하지 마십시오. 공기 흐름을 허용 뚜껑 힘을 둡니다.
- 즉시 anesthetizing 챔버에 FDG 분사에 대해 다음 마우스를 놓습니다. PET 스캔의 과정이 10 분이기 때문에 후속 마우스 주사는 10 분 이격해야합니다. 하나의 마우스가 스캔 후 즉시, 스캔 할 다음 마우스에 대한 60 분 FDG의 이해는 서로 정확히 10 분 준비 될 것입니다.
- anesthetizing과 단계 7-9에 명시된 쥐를 주입 계속합니다.
- (여전히 마취와 쥐를 주입 계속하면서) 처음으로 마우스 분사 timepoint에서 50 분 후, 다시 anesthetizing 챔버에 처음 주입 마우스를 놓습니다.
- 산소와 isoflurane 줄에 마우스 침대를 연결하고 침대에에 isoflurane 흐름을 켜십시오. 침대에 파란색 패드를 놓습니다.
- , 침대에 PET 스캔 할 준비가 마우스를 놓고 팔을 스트레칭하고다리와 테이프로이 위치를 개최. 눈으로 윤활제를 배치합니다. 동물의 위치가 영상의 질에 영향을 미칠 수 있기 때문에이 단계가 가장 중요합니다.
- isoflurane과 산소 라인을 분리하고, 빠르게 PET 스캐닝 시스템에 침대를 탑재합니다. isoflurane과 산소 줄을 놓습니다. isoflurane 흐름이 PET 검사 기계에 있는지 확인하십시오. PET 스캔 케이블을 연결하고 스캔을 시작합니다.
- PET 스캔이 완료되면 다음 중부 표준시 스캐너로 동물을 이동합니다. 이 검사는 각각의 케이지에 동물 이동에 따라.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이식 프로세스의 플로우 차트는 그림 1A에 표시됩니다. 네 / 리브 임플란트의 그림은 그림 1B에 표시됩니다. thymic 조직은 일반적으로 개발 및 인간 CD4와 CD8 T 세포의 생리 배포가 있습니다. reconstitution 따라, 동물 CD4, CD8 T 세포와 다른 면역 세포 lineages의 정규 분포와 인간의 면역 체계를 가지고 다니십시오.
종양 크기와 라이브 조직 사이의 차이는 그림 2에 표시됩니다. CT 촬영 (회색 영역) 생체 PET 영상에 큰 종양의 성장을 지적하면서이 대부분 괴사 및 (그림 2) 조직 흉터 것으로 확인되었습니다. 이 종양 회귀와 등급을 평가하는 더 민감하고 정확한 방법으로 PET 영상의 유틸리티를 강조하고 있습니다.
그림 1. 마트-1 특정 T 세포를 들고 키메라 마우스의 생성에 대한 이러한 연구에 사용 된 수정 BLT 모델에 (A) A 개략도. transduced과 autologous 태아 간 격리 CD34 세포를 비 transduced에서 축복 / 리브 임플란트가 복원되었습니다. transduced 세포의 일부가 4-6주 나중에 방사능 마우스로 냉동 및 주입된다. (B) 인간화 마우스에 네 / 리브 임플란트의 대표 이미지입니다. 임플란트는 생리적 조직을 배포하고 IHC 및 유동 세포 계측법 수치에 의해 그림과 같이 CD4/CD8 비율을 갖추고 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 흑색 증 종양을 가진 마우스의 PET와 중부 표준시 이미지입니다.붉은 색이 매우 제한되어 종양의 신진 대사 활동을 나타내며 회색 영역은 종양의 물리적 크기를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
생체 PET 영상에서와 커플 링 수정 BLT 인간화 마우스 모델은 만성 인간의 질병을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 시스템은 BLT 마우스 모델과 HIV 연구에 대한 제한된 범위 이외의 발전을 걸립니다. 또한, 그들은 임상 설정에 도달하기 전에 우리가 다양한 유전자 치료 프로토콜뿐만 아니라 진단 기법을 검토 할 수있는 좋은 시스템입니다. 마우스 대 영장류을 사용하는 저렴한 비용과 결합 후자는 매우 유용한 모델을합니다.
PET 영상 기술은 우리가 접근의 효능을 평가하기 위해 수있었습니다. 우리가 종양의 물리적 측정에만 의존하는 경우, 우리는 유전자 변형 T 세포에 의해 생성 antitumor 응답의 효력을 과소 평가 한 것입니다. 광범위한 흉터와 괴사 조직이 실제로 죽은 조직했다 큰 종양의 모양을했다.
결론적으로, 수정 BLT 마우스 m의 유틸리티odel은 다른 질병 모델로 확장 할 수 있습니다. 어떤 단점이 여전히 이러한 마우스의 짧은 수명으로 유지하지만,이 생체에 인간 면역, 테스트의 여러 측면을 평가하고 새로운 치료 개입을 개발하는 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 위해 앨빈 웰치와 래리 팡 감사드립니다. CIRM 새로운 교수 상 RN2 - 00902-1,이 작품은 국립 보건원 (NIH) 수상 P50 CA086306, 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 보조금 RC1 - 00149-1 및 RS1 - 00203-1에 의해 부분적으로 추진하는 사업 , 병진 의학의 칼 테크 - UCLA 공동 센터, AIDS 연구 UCLA 센터 (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA 에이즈 연구소, CIRM 도구와 기술 상 RT1-01126, 그리고 UC의 Multicampus 연구 프로그램과 캘리포니아에서 전략 바이러스 약물 디스커버리 센터 (번호 MRPI-143226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Invitrogen | 10010049 | |
| RPMI 1640 | A1049101 | ||
| Iscove's | 12440061 | ||
| Fetal Calf Serum | 16000085 | ||
| Collagenase type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Hyaluronidase | H3506 | ||
| DNAse I | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Piptazo (Zosyn) | Pfizer | Piperacillin/tazobactam combination | |
| Ficoll (Ficoll-Paque Plus) | Ge Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | |
| MACS Buffer | Miltenyi Biotech | See comments | MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A |
| CD34 Microbead Kit | 130-046-702 | ||
| LS Columns | 130-042-401 | ||
| Retronectin | Takara | T100A | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354263 | |
| Isofluorane | Baxter | http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer Animal Health | https://www.rimadyl.com/default.aspx |
References
- McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
- Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
- Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
- Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
- Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
- Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
- Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).
