Summary
거미 실크 옷의 뛰어난 기계적 및 생화 학적 특성에도 불구하고,이 재료는 종래의 방법으로 대량 수확 할 수 없습니다. 여기 차세대 biomaterials 같은 거미 실크의 생산과 사용을 공부 수사관을위한 중요한 과정입니다 인공 거미 실크 섬유를 스핀하는 효율적인 전략을 설명합니다.
Abstract
사회가 진행하고 자원 scarcer되기 때문에, 새로운 기술을 육성하는 것이 점차 중요 해지고 고성능 특성을 가진 엔지니어 차세대 biomaterials니다. 이러한 새로운 구조 재료의 개발 비용 효율, 빠른이어야하며 처리 방법과 환경 친화적이고 지속 가능한 제품을 포함해야합니다. 거미는 biomimicry 그 라이벌 최고의 인조 및 천연 재료를위한 차세대 엔지니어링 재료의 풍부한 소스를 제공하고, 다양한 기계적 특성과 서로 다른 파이버 유형의 수많은 스핀. 자연 거미 실크의 대량의 컬렉션 허무이기 때문에, 합성 실크 생산이 스레드의 무제한 공급에 대한 액세스와 과학자를 제공할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 스피닝 프로세스가 간편하고 완벽하게 될 수 있습니다 따라서, 인공 거미 섬유 갑옷에서부터 애플 리케이션의 광범위한, 수술 봉합에 대한 잠재적인 사용을초, 로프 및 케이블, 타이어, 악기를위한 문자열, 그리고 항공 및 우주 항공 기술에 대한 복합 재료. 합성 실크 생산 과정을 진행하고 회전하는 스핀에서 그들의 물질적 속성에서 낮은 편차를 표시할 수 섬유를 양보하기 위해, 우리는 박테리아, 정화 및 단백질의 농도에서 재조합 거미 실크 단백질의 표현을 통합 젖어도 회전하는 프로토콜을 개발 , 섬유 압출 및 기계적 이후 스핀 치료로 따라갔다. 이것은 실험실 규모의 인조 실크 섬유를 돌려서 분석 단계별 프로세스를 보여 최초의 시각적 표현이다. 또한 동일한 회전 마약에서 냈지 섬유 간의 다양성의 도입을 최소화하기 위해 세부 사항을 제공합니다. 이하 이러한 방법은 자연 거미 실크 옷을 능가하는 높은 품질의 섬유로 이어지는, 인조 실크 생산의 공정을 추진합니다.
Introduction
거미 실크는 고장력 강판, 방탄과 나일론을 포함한 밖으로 몇 가지 인공 물질을 수행 놀라운 기계적 성질을 가지고 있습니다. 1 거미들은 다양한 기계적 특성을 표시하는 적어도 6-7 가지 섬유 종류, 인장 강도와 확장성의 다양한 양의 설계된 각 스핀 특정 생물 학적 작업을 수행합니다.이 연구 과학자들은 급속하게 때문에 식인의 3,4. 때문에 그들의 뛰어난 기계적 특성, 그들의 biocompatibility, 그들의 무독성과 녹색 - 재료 자연의 차세대 biomaterials 같은 거미 실크 옷의 사용을 추구하고있다 그의 거미들도 악의에 찬 성격은 농업을 통해 거미 실크 옷을 수확하는 것은 산업 규모의 제조에 필요한 요구 사항을 충족하기위한 실용적인 전략이 아닙니다. 따라서 과학자들은로부터 합성 섬유의 방적 체외에서 결합 유전자 변형 생물체에 재조합 실크 단백질의 생산으로 향했다했습니다SE 정화 단백질이 있습니다. 전체 길이 재조합 거미 실크 단백질의 5-8 표현들은 고도로 반복적인 자연과 물리적 길이를 (> 15킬로바이트) 등이 자신의 유전자 시퀀스의 본질적인 속성, GC 풍부한 컨텐츠 주어진 기술적으로 곤란했던과 편견되었습니다 알라닌과 글리신 코돈 사용. 날짜 9-11, 대부분의 실험실 부분 cDNA 시퀀스 또는 합성 유전자를 사용하여 주요 ampullate 실크 단백질 MaSp1 또는 MaSp2의 잘린 형태의 표현에 주력했습니다. 12-15 스피닝 합성 거미 실크 옷이 필요 도전적인 과정이다 여러 과학 분야, 그리고 방적 공정의 복잡한에 숙달과 지식 완전히 영상 표현하여 일반 대중에게 공개되지 않았습니다. 사실, 전세계 실험실만이는 거미 실크 cDNAs을 표현 실크 단백질 정화, 합성 섬유를 돌려서 후 스핀 추첨을 수행할 수있는 전문 지식을 가지고, 그리고 마지막으로 그들의 biomaterial 속성을 테스트합니다. 8,방적 합성 섬유에 대한 16,17 다른 접근 방식은 습식 및 건식 방사뿐만 아니라 electrospinning 방법을 포함하고있다 16,18,19 모든 절차는 공통점이 한 가지 목표가 -. 기계적 성질과 합성 거미 실크를 생산 프로토콜의 개발을 그 라이벌 천연 스레드 대규모 상업 생산 공정입니다.
여기 젖어도 회전하는 방법을 사용하여 실험실 규모의 인공 거미 실크 옷을 생성하는 절차를 설명합니다. 다른 방적 방법에 대한 상대, 젖은 지어내는 섬유 분석을위한 가장 일관성있는 결과를 생산하고있다. 우리는 그들의 정화이어서 박테리아 재조합 실크 단백질의 표현으로이 절차를 시작하는을 요약한 다음으로 스레드를 얻을 "로-잣고"섬유에 적용된 이후의 스핀 추첨 방법론을 포함하여, 방적 용 단백질 준비 단계를 설명 자연 거미 실크 옷의 품질을 접근 재료의 특성. 우리 methodologY가 밀접 실크 섬유의 자연적인 회전 과정을 모방하도록 설계하고 건축과 더 나아가 구를 및 COB-직조 거미. 20-22에서 비단 생산 땀샘의 기능은 우리의 전문 기술에 따라 크게 그리는되고, 우리는 필요로 결론 수사관은 궁극적인 강도, 궁극적인 변형, 그리고 섬유의 인성을 계산할 수 응력 - 변형 곡선을, 모략하는 tensometer를 사용하여 합성 섬유의 재료 특성을 결정하는 단계. 마지막으로,하지만 중요한 가치 때문에, 스풀 링 방적 및 그리기 apparatuses 오히려 정교하고 값비싼 맞춤형 장비를 구입하는 것보다 상용 부품을 사용하여 가정에서 만들 수 있습니다.
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Protocol
그래픽 개요 : 방적 공정 Biomimicry
자연 거미 실크 생산 경로의 Biomimicry :. 합성 실크를 생산하는 경로는이 이미지는 골든 오브 위버, Nephila clavipes, 천연 실크 생산 (흰색 텍스트) 활용 구성 요소에서 주요 ampullate 글랜드를 보여줍니다. 꼬리 지방은 ampulla, 스피닝 마약에 대한 저장 영역으로 수송되는 실크 단백질의 대량 합성. 이 농축 마약이 솔루션은 이전에 섬유 압출에 이온 교환 및 탈수가 발생하는 회전 덕트를 통해 압출입니다. 저희 연구실에서 사용 biomimetic 프로세스는 빨간색 텍스트로 표시됩니다. 재조합 실크 생산은 크로마 토그래피를 이용한 단백질 정제 이어 유전자 변형 박테리아를 사용하여 생성됩니다. 그 다음 정제 단백질은 하위이다자료를 집중할 lyophilization에 ject. 마지막으로, 단백질은 HFIP에 다시 용해 및 이소프로판올 욕조에 주사기 바늘로부터 압출한다.
1. 플라스미드 건설 및 세균성 세포 배양 준비
- 원하는 거미 실크 cDNA 및 특정 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행합니다. 젤 - 추출과 prokaryotic 발현 벡터 예 pBAD / TOPO ThioFusion (그림 1A)로 증폭된 cDNA를 ligate. 이 벡터는 실크 단백질 solubilization 및 단백질 정제를위한 자신의 태그에 C-단자 6x를 촉진하는 N-터미널 thioredoxin 태그를 가지고 있습니다. 관할 E.으로 내고 제품을 변환 대장균 세포.
- 재조합 복제 벡터를 포함하고 암피실린 (그림의 1B)로 보완 멸균 LB 200 ML의 예방 한 식민지를 사용하여 식민지를 선택합니다. 37 궤도 인큐베이터 200 rpm으로 흔들어에 의해 포화로 하룻밤이 문화를 성장 ° C.
- saturat의 200 ML을 결합신선한 LB 문화 800 ML과 에드 문화. 0.2 % arabinose (W / V)를 추가하여 4 시간 동안은 거미 실크 단백질 표현을 유도. 항생제 선택하에 문화를 유지하는 것이 좋습니다.
- 4 ° C (그림 1C)에서 10 분 16,000 XG의 펠렛은 세포. 라는 용기의 단순함에 들어, 펠렛은 전체 볼륨. 여러 개의 원심 분리 단계는 원심 분리 튜브의 볼륨 용량에 따라 필요할 수 있습니다. 필요한 경우, 회전하고 다시 펠렛 추가 재료 펠렛 하나의 컨테이너에 전체 세포를 보장하기 위해 뒤에 가만히 따르다 액체 볼륨. 필요한 ° C까지 셀 알약은 -80에 저장할 수 있습니다.
- 소비 문화 미디어를 처분하기 전에, 표백제를 추가하거나 멸균을 위해 압력솥.
2. 세포 용해
- 1 패 세포 펠렛으로 1X 용해 완충액 (그림 2A)의 20 ML을 추가합니다. 완전히 세포 펠렛을 resuspend해야합니다.
- 더욱 촉진하는 데 1 밀리그램 / ML의 농도에 라이 소 자임 추가세포 용해. DNase 또한 솔루션의 점도를 줄일 수 있도록 염색체 DNA를 소화하기 위해이 단계에서 추가할 수 있습니다. 궤도 흔드는에서 샘플을 놓고 부드럽게 20 분 동안 신난다.
- 1 분 최대의 솔루션을 Sonicate.
- 4에서 10 분 동안 16,000 XG에서 솔루션 원심을 분명히 ° C (그림 2B).
3. 단백질 정제 : 니켈-NTA 동질 칼럼 크로마 토그래피
- 표면에 뜨는를 제거하고 깨끗한 25 ML 크로마 토그래피 칼럼에 그 파일을 전송합니다. 뜨는 비 점성하고 명확해야합니다. 솔루션은 점성과 흐린 경우보다 DNase 또는 sonicate 및 / 또는 다시 펠렛 뜨는 (단계를 반복 2.3-2.4)을 추가합니다.
- 열에 니켈 NTA 슬러리 (0.5 ML 비즈) 1 ML을 추가합니다. 단단히 뚜껑과 꼭지를 확보하고있는 NI-NTA 비즈 (그림 3A)에 자신의 태그 6x의 바인딩을 허용하도록 1 시간 평형하는 로커를 설정합니다.
- 에 수직으로 열을 설정서서 니켈-NTA 비즈가 약 2 분 동안 정착하실 수 있습니다. 구슬이 완전히 정착되면 밝은 파란색 레이어는 하단에 볼 수 있습니다.
- 뚜껑을 제거하고 솔루션은 꼭지를 통해 흐를 수 있습니다. 자세한 분석 (그림 3B)에 대한이 솔루션을 수집합니다.
- 1X 세척 버퍼 20 ML을 추가하고 비즈가 정착하실 수 있습니다. 꼭지를 열고 솔루션을 통해 흐를 수 있습니다. 자세한 분석을 네 번 다섯 ML의 aliquots에이 솔루션을 모아서 참고 : 추가 세척 볼륨이 훼손 단백질을 줄이기 위해 사용될 수 있으나, 최종 단백질 수율의 감소의 가능성이 있습니다..
- 1X 용출 버퍼 20 ML을 넣고 수지를 안정 수 있습니다. 꼭지를 열고 솔루션을 통해 흐를 수 있습니다. 자세한 분석을 네 번 다섯 ML aliquots에이 솔루션을 모아서 참고 :. 용리가 완료되지 않은 경우 추가 용출 볼륨이있는 NI-NTA 수지에서 수집한 수 있습니다.
- 샘플은 4에 저장될 수° C 또는 -80 ° C에서 단기 또는 장기 보관, 각각입니다.
- SDS-PAGE 분석을 사용하여 크기 - 분류 샘플. 은색 또는 Coomassie 브릴리언트 블루 R-250 (그림 3C)와 단백질을 시각화. 오직 순수한 분수는 다음 단계에 사용해야합니다. 참고 : 서양 얼룩 분석은 정제된 단백질의 신원을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
4. 투석과 Lyophilization
- 2 일 이상 100x 샘플 볼륨 (탈이온수 사용)에 대한 샘플을 Dialyze. 모든 염분을 제거하기 위해 물에 솔루션마다 6 시간 변경 참고 :. 투석 튜브의 분자량 크기 컷 오프는 재조합 실크 단백질의 크기에 따라 달라집니다.
- 여섯 1.5 ML 빈 microfuge 튜브를 저울질하고 대중을 기록합니다. 그것은 전에 (그림 4A) lyophilization을 촉진하기 위하여 건조 동결을위한 무게로 튜브의 뚜껑에 작은 구멍 뚫기 또는 가늘고 길게 찢어진에게 유용할 수 있습니다.
- AFter 투석, 6 미리 무게 microfuge 튜브 (그림 4B) 각각에 dialyzed 샘플의 양도 1 ML. 플래시는 액체 질소를 사용하여 동결 및 동결 건조기 (그림 4C)를 사용하여 아래 샘플을 건조.
- 일단 건조, 여섯 튜브의 각으로 투석 샘플의 또 다른 한 ML을 전송. 전체 투석 샘플 microfuge 튜브 속에 건조 때까지 반복합니다.
- 고정 건조 시료는 -80 ° C에서 장기 저장을 위해 저장할 수 있습니다.
5. 볼때마다 준비를 스피닝
- 마른 단백질 분말을 포함하는 microfuge 튜브 각각의 무게. 총 건조 단백질 질량을 얻기 위해 빈 튜브의 초기 질량을 빼지 참고 :. 단백질 수율에 따라, 당신은 방적 공정에 대한 추가 자료를 정화해야 할 수도 있습니다.
- 200 MG / ML 500 밀리그램 / ML, 또는 20 % 50 % 볼륨 당 무게를 얻기 위해 각각의 튜브에 추가 Hexafluoroisopropanol (HFIP)의 볼륨을 계산합니다. appropri 추가각 튜브 (그림 4D)로 HFIP의 양을 먹었다. 참고 : HFIP 신중하게, 피펫 높은 휘발성과 독성이며, 가능한 빨리 튜브를 쏠. HFIP는 안전 후드 아래에 다루어 져야합니다.
- 단백질을 solubilize하는 로커에 튜브와 장소를 Parafilm. 와동과 원심 가끔 solubilization을 촉진합니다. 이것은 2 일 소요될 수 있습니다.
6. 주사기 준비 및 장치 설치
- 주사기로 solubilized 스피닝 마약의 최소 25 μL를로드합니다. . 그것이 주사기를 방해할 수 있으므로 아무런 집계도 제시하지 참고가 있는지 확인 : pipetting하면이 예제는 매우 점성이므로주의를 기울입니다.
- 모든 기포 (그림의 5A) 제거, 세로 주사기 앞에 마약 밀어 주 :. 공기 거품이 섬유의 불일치를 만듭니다.
- 펌프에 주사기를 잠급니다. 95% 이소프로판올까지 가득 400 ML의 비커를 올리기 때문에 주사기의 팁단지 알코올의 표면 (그림의 5B)을 깨고있다.
- 15 μL / 분에 주사기 펌프를 설정하고 프로그램을 시작합니다. . 20 분 이소프로판올에 앉을 수있는 만큼은 잣고 섬유를 충분히 참고 평형 허용 :이 섬유는 여전히 섬유에 단백질의 신원을 확인하는 MS / MS 분석에 의해 사용될 수 있습니다.
7. 포스트 스핀 그리기 및 샘플 모음
- 스풀 링 장치 빗 양쪽에 양면 테이프를 적용합니다. 스풀 링 장치가 gluing 금속 빗에서 디지털 캘리퍼스 (그림 6A)로 만들었습니다. (그림 6B) 모터로 스풀 링 장치를 부착합니다. 우리는 2 rpm으로 스레드를 풀링하는 것이 좋습니다 참고 :. 섬유 품질과 재현성의 변화 대량의 빠른 스풀 링 속도 결과.
- 집게를 사용하면 부드럽게 섬유의 한쪽 끝을 잡고 천천히 스풀에 빗 무기 중 하나의 가장자리에 부착, 이소프로판올 밖으로 당겨 (그림. 6C). 다음 몇 단계는 밖으로 건조로부터 섬유를 막기 위해 파업없이 완료되어야합니다.
- 모터의 전원을 켜고 천천히 스풀 링 장치 참고로 섬유를 안내 :. 스풀 링하는 동안 섬유가 배로 서로의 위에 쌓아 놓는 것을 허용하지 않습니다.
- 일단 전체 섬유가 spooled되며, 모터에서 스풀을 분리하고 이중 양면 테이프의 각 실크 섬유의 가장자리 (그림 6D)에 접착제를 적용합니다. 이것은 장치에 거미 실크를 fastens 참고 :. 사전 사후 스핀 도면에 양면 테이프 접착제를 적용함으로써, 미끄러지고에서 전체 섬유질을 방지하고 캘리퍼스 내에서 섬유의 내부 세그먼트의 스트레칭 선택을 허용 팔.
- 선형 액추에이터 (그림 7A)에 스풀을 첨부합니다. 캘리퍼스를 사용하여 섬유의 초기 길이를 기록이 섬유의 내부 길이는 것에주의하라;. 그것은 접착 길이를 포함 AR 포장하지 않습니다스풀을 ound.
- 75% 이소프로판올 목욕탕에 스풀을 낮춥니다. . 섬유, 10 분 주 동안 평형을 허용 : 기타 dehydrating 솔루션은 이러한 메탄올, 아세톤 및 암모늄 황산염으로, 방적 공정에 사용될 수 있습니다.
- 1.5 mm / 초로 선형 액추에이터의 속도를 설정합니다. 초기 길이를 바탕으로 원하는 포스트 스핀 추첨 비율에 대한 최종 길이를 계산합니다. 뻗어 금액은 최대 세트에 따라 속도 또는 길이를 기반으로 제어할 수 있습니다. 예를 들어, 15mm와 배 중 원하는 이후 스핀 추첨 비율의 초기 길이로, 최종 길이는 45mm이어야합니다. 이것은 또한 1.5 mm / 초의 속도로 20 초 동안 선형 액추에이터를 가동으로 계산 할 수 있습니다.
- 원하는 게시물 스핀 추첨이 완료되면 서서히 이소프로판올의 스풀을 올립니다. 이소프로판올의 방울은 1 분 건조하도록 허용하고 샘플 (그림의 7B)를 수집합니다. 샘플은 pur 테스트를 위해 cardstock 또는 호일 프레임에 장착되어야합니다포즈.
- 추가 포스트 스핀 추첨 비율이 원하는 경우, 75% 이소프로판올 목욕탕에 스풀 다시 낮아집니다. 섬유는 10 분 동안 평형하고 다음 게시물 스핀 추첨 비율로 진행하도록 허용합니다.
8. 인장 시험
- 수집된 샘플 기계적 시험하기 전에 최소한 1 시간 동안 표준 실험실 환경 평형하도록 허용합니다. 그들은 섬유의 기계적 특성에 영향을 미칠 수 있으므로 습도와 온도가 기록되어야한다. 표준 습도 및 온도 조건은 각각 약 40 %와 25 ° C이어야합니다.
- 접착제는 cardstock 또는 호일의 가장자리가 프레임에서 섬유질을 보호하고 있습니다. 프레임의 개통의 크기의 노트를 가져가라. 이렇게하면 테스트 섬유의 초기 길이입니다. 1 인치 (25.4 ㎜) 오픈 프레임 (그림 8A) 여기에 표시됩니다.
- 100x 이상의 배율과 가벼운 현미경을 사용하여 세로 섬유 축을 따라 직경 측정.최소 3 측정이 기록되어야한다. 높은 배율은 사용할수록 측정은 더 정확성을 촬영.
- tensometer 기계적 하중 프레임 (그림의 8B)에 프레임을 고정합니다. 장력만을 섬유를 통해 실행되고 있으므로 양쪽의 프레임을 잘라요. 포장 재료의 중량은 tensometer와 데이터를 수집합니다. 초당 2 %의 표준 스트레인 율을 권장합니다.
- 수집된 데이터와 평균 직경을 사용하여 응력 변형 곡선을 꾸몄다 수 있습니다.
- 깨진 섬유는 현재 형태학의 분석 및 브레이크 포인트 직경 측정을위한 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 스텁에 설치할 수 있습니다. 거리에 브레이크 포인트에서 섬유 부문은 불빛 현미경으로 측정한 초기 직경을 추정하고 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
9. 대표 결과
3 단계에서 서로 다른 분수는 SDS-PAGE 분석에 의해 분석되어야하며 단백질은 은색과 시각또는 Coomassie 브릴리언트 블루 R-250. 표준 니켈-NTA 컬럼 조건에서> 90 % 순도로 용출 분수는 (그림 9)를 얻을 수 있습니다. 작은 오염 단백질은 더욱 광범위한 투석에 의해 제거 할 수 있습니다. 20% (W / V)에서 마약을 회전의 25 μL를 사용하여 최소 30 별도의 섬유 샘플은 스풀 (최초 13mm의 길이를 사용하는 가정)에 대한 지속적인 상처 섬유에서 수집한 수 있습니다. 기계적 성질은 tensometer 검사 (그림 10)에 의해 분석할 수 있습니다. 스피닝 공정에 사용되는 재조합 실크 단백질에 따라 최대 게시물 스핀 추첨 비율은 경험적으로 판단해야합니다. 일반적으로 스핀이 4.0x의 비율을 그릴 게시 섬유 장애 (그림 10)하지 않고 얻을 수 있습니다. 냈지 섬유는 게시물 스핀 추첨 전후, ultrastructure을 시각화하기위한 스캐닝 전자 현미경 (그림 11A, B)로 분석할 수 있습니다. 냈지 섬유는 또한 결과를 표시, 기계 테스트에 사용될 수 있습니다해당 게시물 스핀 추첨 비율 샘플 그룹 내에서 낮은 편차 (그림 10)과.
그림 1. 세균의 cDNA 거미 실크의 표현. ) 관심있는 cDNA 거미 실크를 포함 pBAD TOPO / Thio 벡터는 관할 E.으로 변화됩니다 대장균 세포. B)를 하나의 식민지가 LB 200 ML에 주사하고 하룻밤 포화로 성장하고 있습니다. 접종 후, 신선한 LB 800 ML이 추가되고 문화 arabinose를 사용하여 표현 시달릴 수 있습니다. C) 유도의 결론에서는 문화 원심 분리에 의해 pelleted입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 2. 거미 실크 단백질 유도 후 세균성 세포의 용해. ) 스물 millili1X 용해 버퍼와 DNase의 ters는 세포 펠렛에 추가하고 궤도 흔드는에 위치하고 세포를 lyse하는 sonicated됩니다. B) 세포 lysate는 세포 파편의 표면에 뜨는을 취소한 원심 분리기에 소용되며, 표면에 뜨는가 수집됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 3. 친화 크로마 토그래피를 사용하여 거미 실크 재조합 단백질의 정제. ) 세포 lysate 뜨는 및 니켈-NTA 비즈는 크로마 토그래피 칼럼에 추가하고 1 시간 동안 incubated됩니다. flowthrough가 수집되면 B) 세탁 버퍼와 용리 완충액 20 ML 20 ML은 순서대로 사용 및 5 ML 분수에 수집됩니다. C) 다른 분수는 SDS-PAGE에 의해 분석되며, 대상 단백질을 포함하는 순수한 샘플은 투석 백에게 양도 및 DI 워터에 대해 dialyzed있다완성. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 4. 젖어도 회전을위한 정화의 거미 실크 단백질의 작성. ) dialyzed 제품은 1 ML의 aliquots에 미리 무게 원심 튜브로 전송됩니다. B) 한 ML의 aliquots가 액체 질소로 냉동 깜박일 수 있습니다. C) 냉동 샘플은 동결 건조된되고 더 많은 투석 샘플이 추가됩니다. D) 건조 질량이 계산되고 HFIP은 20 % (W / V) 방적 마약을 생산하기 위해 건조 분말에 추가됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
그림 5. 젖어도 회전을위한 유리 주사기로 회전 마약로드 중입니다. ) syrin를 누른 상태에서GE 세로는 방적 마약은 공기 방울을 제거, 주사기 칼럼의 맨 위로 밀려있다. B)로드 주사기는 주사기 펌프에 부착된과 팁 방금 목욕의 표면을 깨는되도록 95% 이소프로판올 욕조로 인하된다.
그림 6. 사용자 정의 낚시 장치 진입 합성 거미 실크 섬유의 스풀 링. ) 스풀 링 장치가 부착된 금속 빗과 디지털 캘리퍼스로 구성되어 있습니다. 더블 양면 테이프는 섬유 끝이 첨부 빗의 양쪽에 적용됩니다. B) 스풀은 악어 클립을 사용하여 느린 속도 모터에 붙어있다. C) 섬유는 천천히 알코올 목욕탕에서 가져온 및 스풀 주위에 상처 있습니다. D) 접착제는 그 자리 잡고 각 섬유 세그먼트의 가장자리에 적용됩니다. 표시 다른 단백질에서 돌다가 두 개의 서로 다른 섬유입니다.
그림 7. 포스트 스핀 수제 장치를 사용하여 합성 섬유로 그립니다. ) 스풀 링 장치가 악어 클립을 사용하여 선형 액추에이터 설정에 첨부되어 있습니다. B) 포스트 스핀 추첨 단계 후 스풀은 목욕탕에서 해제됩니다. 이소프로판올 방울은 섬유 수집하기 전에 증발 수있게됩니다.
그림 8. 기계 연구 cardstock 진입 합성 실크 섬유의 부착. ) 임시 섬유는 1 "X 1"컷아웃로 cardstock 프레임에 탑재하고 있습니다. 섬유는 초기 이중 양면 테이프가있는 장소에서 개최하고 접착제로 고정되어 있습니다. B) cardstock 프레임 tensometer에 고정됩니다. 장력만을 섬유 불구하고 실행되도록 양쪽 그런 다음자를 수 있습니다.
그림 9. 크기 분별화 재조합 MaSp1 protei 투석을 중N SDS-PAGE 분석을 사용하여 분수는 실버 염색법과 시각화하여 따라갔다. 단백질 사다리는 kDa으로 그려져 있습니다. 용출 샘플은 총 단백질 복구를 보장하기 위해 6 컬렉션에 대한 필요성을 공개하면서 두 세차 샘플은 구슬로가 아닌 특정 바인딩을 보여줍니다.
섬유의 그림 10. 스트레스 변형 곡선은 재조합 단백질 TuSp1에서 불러 냈어요. 8 색상 2.5x에서 6x에 이르기까지 다양한 포스트 스핀 추첨 비율에 적용했다 섬유를 보여줍니다. 섬유는 비율은 그룹 내에서 낮은 편차를 보여, 확장성이 감소되는 동안 포스트 스핀 추첨 비율 증가로 섬유의 강도가 증가됩니다.
그림 11. 재조합 단백질 TuSp1에서 냈지 섬유의 전자 현미경 이미지를 스캔. ) 500x 배율에서, 매끄러운 외부표면은 볼 수있다. B) 5000x에서는 울창한 내부 코어는 섬유의 자연 휴식에서 볼 수 있습니다.
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Discussion
이 방법론에서 냈지 합성 섬유는 천연 섬유에 비해 크기의 순서에 기계식입니다. 스풀 링 및 게시물 스핀 추첨 프로세스를 mechanizing하여 인간의 오류의 양을 줄임으로써, 샘플 간의 실험 유사 콘텐츠를 더 많은 제어와 획기적으로 줄일 수 있습니다.
우리의 방법론은 거미 유전자 가족의 다른 구성원의 cDNAs에서 인코딩 재조합 단백질에서 돌다가있는 다른 섬유의 기계적 특성을 조사하기위한 가능성을 제공합니다. 잠재적으로, 그것은 피브로인 내에서, 또는 다른 피브로인 유형 간의 서로 다른 단백질 모듈의 기계적 역할을 결정할 수 있습니다. 23 개 이상의 실크 단백질이나 다른 분자가 결합하거나 추가할 수있는대로 또한, 복합 재료 등의 실크 섬유의 시험을 허용 와 단백질 혼합물로 불러 냈어요.
이 방적 방법론 appa으로 쉽게 따라 확장할 수있는 다른 실험실을위한 플랫폼입니다ratuses는 손쉬운 방식으로 건설 수 있습니다. 이것은 독특한 기계적 성질과 특정 섬유의 디자인을 최적화하거나 사용자 정의하는 각 단계를 따라 매개 변수를 조정할 수 있도록합니다. 향후 증가를위한 녹색 biomaterials에 대한 필요성으로이 방법론은 차세대 애플 리케이션의 호스트를 제공 섬유를 생성하기 위해 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 각각 NSF 루이 보조금 MCB-0950372와 DMR-1105310받을 권리를 가진다 "블랙 위도우 거미의 실크와 거미의 실크 접착제의 기계적 동작의 분자 특성화"에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
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