Summary
A pesar de las excelentes propiedades mecánicas y bioquímicas de las sedas de araña, este material no pueden ser cosechadas en grandes cantidades por medios convencionales. A continuación se describe una estrategia eficiente para hacer girar las fibras artificiales de seda de araña, que es un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de seda de araña y su uso como la próxima generación de biomateriales.
Abstract
Mientras la sociedad avanza y los recursos se vuelven escasos, cada vez es más importante cultivar las nuevas tecnologías que los biomateriales de ingeniería de última generación con propiedades de alto rendimiento. El desarrollo de estos nuevos materiales estructurales debe ser rápida, rentable y hacer participar a las metodologías de procesamiento y productos respetuosos con el medio ambiente y sostenible. Las arañas tejen una multitud de diferentes tipos de fibras con diversas propiedades mecánicas, que ofrece una rica fuente de material próximos generación de ingeniería para el biomimetismo que rivalizan con los mejores materiales naturales y artificiales. Desde la recogida de grandes cantidades de seda de araña natural es poco práctico, la producción de seda sintética tiene la capacidad de proporcionar a los científicos el acceso a un suministro ilimitado de temas. Por lo tanto, si el proceso de hilatura puede ser simplificado y perfeccionado, fibras artificiales araña tiene el uso potencial de una amplia gama de aplicaciones que van desde chalecos antibalas, sutura quirúrgicas, cuerdas y cordajes, neumáticos, cuerdas para instrumentos musicales, y materiales compuestos para la aviación y la tecnología aeroespacial. Con el fin de avanzar en el proceso de producción de seda sintética y para producir fibras que muestran poca variación en sus propiedades materiales de la vuelta a girar, se desarrolló un protocolo de hilatura en húmedo que se integra la expresión de proteínas recombinantes de seda de araña en las bacterias, la purificación y concentración de las proteínas , seguido por extrusión de fibra y un tratamiento mecánico posterior giro. Esta es la primera representación visual que revela un proceso paso a paso para hacer girar y analizar fibras de seda artificial a escala de laboratorio. También proporciona detalles para minimizar la introducción de variabilidad entre las fibras hiladas a partir de la mezcla de hilatura mismo. En conjunto, estos métodos impulsará el proceso de producción de seda artificial, lo que lleva a las fibras de mayor calidad que superan las sedas de araña naturales.
Introduction
La seda de araña tiene extraordinarias propiedades mecánicas que lleva a cabo a cabo varios materiales hechos por el hombre, incluyendo acero de alta resistencia, kevlar y nylon. 1 Las arañas tejen por lo menos 6-7 diferentes tipos de fibras que presentan diversas propiedades mecánicas, cada uno diseñado con cantidades variables de resistencia a la tracción y capacidad de ampliación para llevar a cabo tareas específicas de biológicos. 2 Los investigadores científicos están buscando rápidamente el uso de sedas de araña como biomateriales de próxima generación, debido a sus excelentes propiedades mecánicas, de su biocompatibilidad, y su carácter no tóxico y material verde. 3,4 Debido a la caníbal y la naturaleza venenosa de los arácnidos, la cosecha sedas de araña a través de la agricultura no es una estrategia práctica para satisfacer las demandas necesarias para la fabricación a escala industrial. Por lo tanto, los científicos han recurrido a la producción de proteínas recombinantes en seda organismos transgénicos, junto con in vitro hilado de fibras sintéticas de lasE proteínas purificadas. 8.5 Expresión de larga duración en proteínas recombinantes de seda de araña ha sido técnicamente difícil, dadas las propiedades intrínsecas de sus secuencias genéticas, que incluyen su naturaleza altamente repetitivo y longitudes físicas (> 15 kb), GC-rica de contenido y parcial alanina y glicina uso de codones. 9.11 Hasta la fecha, la mayoría de los laboratorios se han centrado en la expresión de formas truncadas de las principales proteínas de la seda ampullate MaSp1 o MASP2 usando secuencias parciales de ADNc o genes sintéticos. 12-15 Spinning sintética las sedas de araña es un proceso difícil que requiere el dominio y el conocimiento en varias disciplinas científicas, y las complejidades del proceso de hilado no se han revelado al público en general por la representación de vídeo. De hecho, sólo un puñado de laboratorios en todo el mundo tienen la experiencia para expresar el ADNc de seda de araña, purificar las proteínas de la seda, hacer girar las fibras sintéticas y llevar a cabo después de la vuelta empate, y, finalmente, probar sus propiedades de biomateriales. 8,16,17 Diferentes enfoques para la hilatura de fibras sintéticas han abarcado hilado en húmedo y seco, así como los métodos de electrospinning 16,18,19 Todos los procedimientos tienen una meta en común -. El desarrollo de un protocolo que produce la seda de araña sintética con propiedades mecánicas que rivalizan con hilos naturales a gran escala los procesos de fabricación comerciales.
A continuación se describe el procedimiento para generar las sedas de araña artificiales a escala de laboratorio utilizando una metodología de hilatura en húmedo. En comparación con otros métodos de hilado, hilado en húmedo ha producido los resultados más consistentes para el análisis de fibra. Se describen este procedimiento comenzando con la expresión de las proteínas recombinantes en bacterias de seda, seguido por la purificación de ellos y, a continuación se describen los pasos de preparación de proteínas para el hilado, incluyendo una metodología sorteo posterior giro aplicado a "como" fibras hiladas en que los rendimientos de hilos con propiedades de los materiales que se acercan a la calidad de las sedas de araña naturales. Nuestro METODOLOGÍy está diseñado para imitar el proceso natural de hilado de fibras de seda y se basa en gran medida nuestra experiencia de la arquitectura y el funcionamiento de las glándulas productoras de seda de la orbe-y mazorca de tejido de las arañas. 20-22 Además, se concluye con la necesaria pasos para determinar las propiedades del material de las fibras sintéticas utilizando un tensiómetro para trazar curvas tensión-deformación, que permiten a los investigadores a calcular la resistencia última, deformación última, y la tenacidad de las fibras. Por último, pero de gran valor, los aparatos de hilatura, cola, y el dibujo puede estar en casa-construida con piezas disponibles en el mercado, en lugar de la compra de equipos a medida elaborado y costoso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gráfica Descripción: Biomimética del proceso de hilatura
El biomimetismo de la vía de la producción de seda natural de araña:. Una ruta para la fabricación de seda sintética Esta imagen muestra la glándula ampullate importante de la tejedora dorada orbe, Nephila clavipes, y los componentes utilizados para la producción de seda natural (texto blanco). La región de la cola sintetiza grandes cantidades de proteínas de seda que se transportan a la ampolla, una región de almacenamiento para la mezcla de hilatura. Esta droga concentrada se extruye a través del conducto hilatura donde la solución experimenta el intercambio de iones y la deshidratación antes de la extrusión de fibras. Los procesos biomiméticos utilizados en nuestro laboratorio se indican con el texto de color rojo. La producción recombinante de seda se genera utilizando bacterias transgénicas, seguido por la purificación de proteínas mediante cromatografía. A continuación, la proteína purificada es subsujeto a liofilización para concentrar el material. Por último, la proteína se vuelve a disolver en HFIP y se extruye a partir de una aguja de la jeringa en un baño de isopropanol.
1. Construcción de plásmidos y Preparación bacteriana Cultivo Celular
- Realizar PCR utilizando los deseados de seda de araña juegos de cebadores de cDNA y específicos. Gel-extraer y ligar el ADNc amplificado en un vector de expresión procariótico por ejemplo pBAD / TOPO ThioFusion (fig. 1A). Este vector tiene una etiqueta de tiorredoxina N-terminal para facilitar la solubilización de seda proteína y un 6x C-terminal de su-etiqueta para la purificación de proteínas. Transformar los productos de la unión en la competencia E. células de E..
- Seleccione colonias que contienen el vector de clonación recombinante y utilizar una colonia para inocular 200 ml de LB suplementado con ampicilina estéril (Fig. 1B). Cultivar este cultivo durante la noche a la saturación por agitación a 200 rpm en un incubador orbital a 37 ° C.
- Combine los 200 ml de saturated cultivo con 800 mL de cultivo LB fresco. Inducir seda de araña expresión de la proteína durante 4 horas mediante la adición de 0,2% arabinosa (w / v). Asegúrese de mantener la cultura en la selección de antibióticos.
- Sedimentar las células a 16.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C (Fig. 1C). Por simplicidad, pellets todo el volumen en un recipiente. Múltiples pasos de centrifugación puede ser necesario dependiendo de la capacidad de volumen de los tubos de centrifugación. Si es necesario, se decanta el volumen de líquido después de girar y de re-sedimento material adicional para asegurar toda la celda es precipitado en un recipiente. Los sedimentos celulares se pueden almacenar a -80 ° C hasta que se necesite.
- Antes de desechar el medio de cultivo gastado, añadir lejía o autoclave para esterilizar.
2. Lisis de la célula
- Añadir 20 ml de tampón de lisis 1x para el sedimento celular 1 L (Fig. 2A). Asegúrese de volver a suspender el pellet de células completamente.
- Añadir lisozima a una concentración de 1 mg / ml para promover aún máslisis celular. DNasa también se puede añadir en este paso para digerir el ADN cromosómico para ayudar a reducir la viscosidad de la solución. Colocar la muestra en un agitador orbital y suavemente durante 20 minutos.
- Soníquelos la solución a un máximo de 1 minuto.
- Para clarificar la solución, se centrifuga a 16.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C (Fig. 2B).
3. Purificación de Proteínas: Ni-NTA columna de afinidad Cromatografía
- Eliminar el sobrenadante y la transfiere en una columna de cromatografía de limpieza 25 ml. Asegúrese de que el sobrenadante no es viscosa y clara. Si la solución es viscosa y turbia, agregue más DNasa o someter a ultrasonidos y / o re-pellet del sobrenadante (2,3-2,4 repita los pasos).
- Añadir 1 ml de suspensión de Ni-NTA (0,5 perlas mL) en la columna. Apriete con seguridad la tapa y llave de paso y, a continuación situado en un eje de balancín en reposo durante 1 hora para permitir la unión de la 6x su-etiqueta a las perlas de Ni-NTA (fig. 3A).
- Ajuste de la columna en posición vertical sobre unaponerse de pie y permitir que las cuentas de Ni-NTA que conformarse con aproximadamente 2 minutos. Una capa de color azul claro se puede ver en la parte inferior cuando las cuentas están completamente resuelto.
- Quitar la tapa y permitir que la solución fluya a través de la llave de paso. Recoger esta solución para su posterior análisis (Fig. 3B).
- Añadir 20 ml de tampón de lavado 1X y permitir que las cuentas a un acuerdo. Abra la llave y dejar que la solución fluya a través de. Recoger esta solución en cuatro alícuotas de 5 ml para su posterior análisis Nota: volúmenes adicionales de lavado se puede usar para reducir las proteínas contaminantes, sin embargo, existe la posibilidad de una disminución en el rendimiento de proteína final..
- Añadir 20 ml de tampón de elución 1x y permitir que la resina se asiente. Abra la llave y dejar que la solución fluya a través de. Recoger esta solución en cuatro partes alícuotas de 5 ml para su posterior análisis. Nota: volúmenes adicionales de elución puede ser obtenida de la resina de Ni-NTA si la elución no se ha completado.
- Las muestras pueden ser almacenadas en 4° C o -80 ° C para el almacenamiento a corto plazo o largo, respectivamente.
- Fraccionar el tamaño-las muestras usando análisis SDS-PAGE. Visualice las proteínas con plata o con Coomassie Brilliant Blue R-250 (fig. 3C). Sólo fracciones puras se debe utilizar para los pasos siguientes. Nota: el análisis Western blot se puede utilizar para confirmar la identidad de la proteína purificada.
4. La diálisis y liofilización
- Dializar las muestras contra al menos 100 veces el volumen de muestra (utilizar agua desionizada) durante 2 días. Cambiar la solución de agua cada 6 horas para eliminar todas las sales. Nota: El tamaño peso molecular de corte de la tubería de diálisis depende del tamaño de la proteína recombinante de seda.
- Pesar seis tubos de 1,5 mL vacías microfuga y registrar sus masas. Puede ser útil para pequeñas perforaciones o ranuras en los tapones de los tubos antes de pesaje para la liofilización para facilitar la liofilización (Fig. 4A).
- After diálisis, la transferencia de 1 ml de la muestra dializada en cada uno de los 6 previamente pesado tubos de microcentrífuga (fig. 4B). Flash congelar con nitrógeno líquido y secar las muestras hacia abajo utilizando un liofilizador (Fig. 4C).
- Una vez seco, transferir otro 1 ml de la muestra de diálisis en cada uno de los seis tubos. Repita hasta que la muestra recibe diálisis se ha secado en los tubos de microcentrífuga.
- Congelar las muestras secas se pueden almacenar a -80 ° C durante el almacenamiento a largo plazo.
5. Preparación de la hilatura Dope
- Pesar cada uno de los tubos de microcentrífuga que contienen la proteína en polvo seco. Reste la masa inicial de los tubos de vacío para obtener la masa total de proteínas en seco. Nota: Dependiendo de la producción de proteína, puede ser necesario para purificar el material adicional para el proceso de hilado.
- Calcular el volumen de hexafluoroisopropanol (HFIP) para añadir a cada tubo para obtener 200 mg / ml a 500 mg / ml, o 20% a 50% en peso por volumen. Agregue el aprocomía cantidad de HFIP en cada tubo (Fig. 4D). Nota: HFIP es altamente volátil y tóxica, pipeta con cuidado y tapar el tubo lo más pronto posible. HFIP debe ser manejado por debajo de una campana de seguridad.
- Parafilm los tubos y colocar en un eje de balancín para solubilizar la proteína. Vortex y centrifugar ocasionalmente para facilitar la solubilización. Este proceso puede tardar hasta 2 días.
6. Jeringa Preparación y aparatos de instalación
- Cargar al menos 25 l de la droga solubilizada hilatura en la jeringa. Asegúrese de que no hay agregados presentes, ya que pueden obstruir la jeringa. Nota: Este ejemplo es muy viscoso, así que tenga cuidado al pipetear.
- Empuje la droga a la parte delantera de la jeringa vertical, eliminando todas las burbujas de aire (Fig. 5A). Nota: Las burbujas de aire crear inconsistencias en la fibra.
- Bloqueo de la jeringa de la bomba. Elevar un vaso de precipitados de 400 ml lleno con 95% de isopropanol hasta que la punta de la jeringaSe acaba de romper la superficie del alcohol (Fig. 5B).
- Establecer la bomba de jeringa de 15 l / min e inicie el programa. Permitir la fibra hilada como para sentarse en el isopropanol durante 20 minutos para equilibrar completamente. Nota: Estas fibras todavía puede ser utilizado por MS / MS análisis para confirmar la identidad de las proteínas en las fibras.
7. Después de la vuelta Draw y Toma de Muestras
- Aplicar cinta de doble cara a ambos lados del peine en el dispositivo de enrollado. El dispositivo de cola fue creada a partir de encolado de metal peines para un calibrador digital (fig. 6A). Una el dispositivo de cola a un motor (fig. 6B). Se recomienda poner en cola los hilos en 2 rpm. Nota: más rápido resultado tasas de cola de impresión en grandes cantidades de variación de la calidad de la fibra y la reproducibilidad.
- El uso de pinzas suavemente agarrar un extremo de la fibra y lentamente tire del isopropanol, fijarlo al borde de uno de los brazos del peine en el carrete (Fig. 6C). Los siguientes pasos deben llevarse a cabo sin un paro para evitar que las fibras que se sequen.
- Encienda el motor y guiar la fibra en la Nota de cola de impresión del dispositivo:. En la cola, no permiten la fibra para doblar y apilar uno encima del otro.
- Una vez que la fibra está en cola, separar el carrete del motor y aplicar pegamento en el borde de cada fibra de seda sobre la cinta de doble cara (Fig. 6D). Esto sujeta la seda de araña en el aparato. Nota: Al aplicar el pegamento a la cinta de doble cara antes de dibujo post-espín, evita que la fibra entera se deslice y permite selectivo estiramiento de los segmentos interiores de las fibras dentro de la pinza los brazos.
- Coloque el carrete en el actuador lineal (Fig. 7A). Anotar la longitud inicial de las fibras utilizando la pinza Nótese que esta es la longitud interna de la fibra;. Que no incluye la longitud de pegado y envuelto around el carrete.
- Bajar el carrete en un baño de 75% de isopropanol. Permitir que las fibras se equilibre durante 10 minutos. Nota: Otras soluciones deshidratantes pueden ser utilizados para el proceso de hilatura, tales como sulfato de metanol, acetona y amonio.
- Ajuste la velocidad del actuador lineal a 1,5 mm / seg. En base a la longitud inicial, calcular la longitud final de la relación de estiramiento deseado posterior giro. La cantidad estirada puede ser controlado basado en la velocidad o la longitud, dependiendo de la configuración. Por ejemplo, con una longitud inicial de 15 mm y un deseado posterior giro relación de estiramiento de 3x, la longitud final debe ser 45 mm. Esto también se puede calcular como alimentar el actuador lineal durante 20 segundos a una velocidad de 1,5 mm / seg.
- Una vez que el empate después de centrifugado deseada es completo, levante lentamente el carrete del isopropanol. Permitir las gotitas de isopropanol para secar durante 1 minuto, y luego recoger muestras (Fig. 7B). Las muestras deben ser montadas en marcos de cartulina o papel de aluminio para probar complantea.
- Si más de correos relaciones de estiraje centrifugado se desea, bajar la parte posterior del carrete en el baño de 75% de isopropanol. Permitir que las fibras se equilibre durante 10 minutos, y luego proceder a la relación de estiramiento mensaje siguiente giro.
8. Prueba de tracción
- Permitir las muestras recogidas se equilibre con el medio ambiente de laboratorio estándar para al menos 1 hora antes de la prueba mecánica. La humedad y la temperatura debe ser registrada, ya que pueden afectar a las propiedades mecánicas de la fibra. Humedad estándar y las condiciones de temperatura debe ser de aproximadamente 40% y 25 ° C, respectivamente.
- Pegar los bordes de la cartulina o papel de aluminio para asegurar la fibra en el marco. Tomar nota del tamaño de la abertura del marco. Esta es la longitud inicial de la fibra de prueba. Un marco de apertura 1 pulgada (25,4 mm) se muestra aquí (Fig. 8A).
- Utilizando un microscopio de luz con un aumento de 100X o más, tomar mediciones de diámetro a lo largo del eje longitudinal de la fibra.Por lo menos 3 mediciones deben ser registrados. Cuanto mayor es el aumento utilizados y las mediciones tomadas más, mejor será la precisión.
- Fijar el marco a un marco tensiómetro carga mecánica (Fig. 8B). Cortar el marco en ambos lados por lo que la tensión sólo se ejecuta a través de la fibra. Tara la muñequera y recoger los datos. Un tipo de cepa estándar del 2% por segundo se recomienda.
- Utilizando los datos recogidos y el diámetro promedio, una curva de tensión-deformación se pueden trazar.
- La fibra rota ahora se puede montar en un microscopio electrónico de barrido (SEM) trozo de análisis morfológicos y mediciones quiebre diámetro. El segmento de fibra de distancia desde el punto de rotura se puede utilizar para estimar y comprobar el diámetro inicial medido por el microscopio de luz.
9. Los resultados representativos
Desde el paso 3, las diferentes fracciones se analizaron por análisis SDS-PAGE y las proteínas se visualizaron con platao Coomassie Brilliant Blue R-250. De unas condiciones de columna estándar de Ni-NTA, fracciones de elución con pureza> 90% se puede obtener (fig. 9). Pequeñas proteínas contaminantes pueden ser aún más eliminado por diálisis extensiva. Utilizando 25 l de hilatura droga a 20% (w / v), por lo menos 30 muestras de fibras separadas se pueden recoger de la fibra continua de la herida en el carrete (asume una longitud inicial de 13 mm se utiliza). Las propiedades mecánicas pueden ser analizados mediante pruebas tensiómetro (Fig. 10). Dependiendo de la proteína de seda recombinante utilizado para el proceso de hilatura, los máximos de correos relaciones de estiraje espín tendrá que ser determinado empíricamente. En general, enviar giro dibujar proporciones de 4,0 x se puede lograr sin fallo de la fibra (fig. 10). Fibras hiladas, antes o después de sorteo posterior giro, puede ser analizada con un microscopio electrónico de barrido para visualizar la ultraestructura (Fig. 11A, B). Fibras hiladas también puede ser utilizado para los ensayos mecánicos, mostrando los resultadosque con una variación mínima dentro de un giro posterior grupo muestra la relación de estiraje (fig. 10).
Figura 1. Expresión de la seda de araña ADNc en bacterias. A) El pBAD TOPO / Tio vector que contiene la seda de araña cDNA de interés se transforma en competencia E. células de E.. B) Una sola colonia se inoculó en 200 ml de LB y crecido hasta saturación durante la noche. Después de la inoculación, 800 ml de LB fresco y se añade el cultivo se indujo la expresión utilizando arabinosa. C) Al final de la inducción, la cultura es un sedimento por centrifugación. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Lisis de las células bacterianas después de la inducción araña proteína de seda. A) El veinte por mililitrotros de tampón de lisis 1x y DNasa se añade a la pastilla de células y se coloca en un agitador orbital y se sonicaron para lisar las células. B) El lisado celular se hace girar en una centrífuga para eliminar el sobrenadante de los desechos celulares y el sobrenadante se recoge. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Purificación de proteínas de la seda de araña recombinantes utilizando cromatografía de afinidad. A) La célula lisado sobrenadante y perlas de Ni-NTA se añaden a una columna de cromatografía y se incubaron durante 1 hora. B) Después de la caudal contínuo se recoge, 20 ml de tampón de lavado y 20 ml de tampón de elución se utilizan en secuencia y se recogió en fracciones de 5 ml. C) Las diferentes fracciones se analizan por SDS-PAGE; las muestras puras que contienen la proteína diana se transfieren a una bolsa de diálisis y se dializó contra agua DI aterminación. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 4. Preparación de la proteína purificada de seda de araña para hilatura en húmedo. A) El producto dializado se transfiere a tubos de centrífuga pesadas previamente en alícuotas de 1 mL. B) Los alícuotas de 1 mL se parpadeará congelado con nitrógeno líquido. C) Las muestras congeladas se liofilizan y más muestra diálisis se añade. D) masa seca se calcula y HFIP se añade al polvo seco para producir una droga 20% (w / v) de hilatura. Haga clic aquí para ampliar la figura .
Figura 5. Carga de la mezcla de hilatura en la jeringa de vidrio de hilatura en húmedo. A) Si bien la celebración de la syrinGE verticalmente, la mezcla de hilatura es empujado a la parte superior de la columna de jeringa, la eliminación de burbujas de aire. B) La jeringuilla cargada está unido a la bomba de jeringa y baja en el baño 95% de isopropanol para que la punta se acaba de romper la superficie del baño.
Figura 6. Enrolladores de las fibras de seda de araña sintética en un dispositivo personalizado tambaleándose. A) El dispositivo de cola se construye a partir de una pinza digital con adjunto peines de metal. Cinta de doble cara se aplica a ambos lados del peine para unir los extremos de las fibras. B) El carrete está conectado al motor a baja velocidad utilizando una pinza de cocodrilo. C) La fibra se retiró lentamente del baño de alcohol y enrolla alrededor del carrete. D) se aplica cola al borde de cada segmento de fibra para mantenerlos en su lugar. Se muestran dos fibras diferentes hiladas a partir de diferentes proteínas.
Figura 7. Post-espín extraer de las fibras sintéticas que utilizan un aparato de fabricación casera. A) El dispositivo de cola de impresión se adjunta a la configuración del actuador lineal con pinzas de cocodrilo. B) Después de un paso posterior sorteo de centrifugado, el carrete se levanta de la bañera. Gotitas Isopropanol se dejó evaporar antes de la recogida de la fibra.
Figura 8. De montaje de las fibras de seda sintéticos sobre una cartulina para estudios mecánicos. A) fibras recogidas se montan en los marcos de cartulina con un 1 "x 1" del recorte. Las fibras están inicialmente en su lugar con cinta de doble cara, y luego se fija con pegamento. B) El marco cartulina se fija sobre un tensiómetro. Los lados se cortan por lo que la tensión se ejecuta sólo cuando la fibra.
Figura 9. Tamaño de fraccionamiento de recombinante purificada proteinuria MaSp1n fracciones usando análisis SDS-PAGE seguida por la visualización con tinción con plata. Escalera proteína se representa en kDa. Las dos muestras de lavado de mostrar la no-unión específica a las cuentas, mientras que las muestras de elución revelan la necesidad de 6 colecciones para garantizar la recuperación total de proteínas.
Figura 10. Curvas de tensión de las fibras de hilado a partir de recombinantes TuSp1 proteínas. 8 colores muestran las fibras que estaban sujetas a diferentes relaciones de puestos de dibujo de giro, que van desde 2,5 x a 6x. Las fibras muestran una variación mínima dentro de su grupo proporción; como giro posterior sorteo proporciones aumento, la resistencia de la fibra se incrementa mientras que se disminuye la extensibilidad.
Figura 11. Digitalización de imágenes de microscopía electrónica de fibras hiladas a partir de recombinantes TuSp1 proteínas. A) En la ampliación de 500x, la externa lisasuperficie puede ser visto. B) En 5000X, el núcleo interior denso puede observarse a partir de un corte natural de la fibra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las fibras sintéticas hiladas a partir de esta metodología son mecánicamente en el mismo orden de magnitud en comparación con las fibras naturales. Al disminuir la cantidad de errores humanos mediante la mecanización de la cola de impresión y los procesos posteriores de giro del sorteo, la variación entre muestras experimentales son más controlado y reducido en gran medida.
Nuestra metodología ofrece la posibilidad de investigar las propiedades mecánicas de las fibras de otros que se tejen a partir de proteínas recombinantes codificadas de los cDNAs de otros miembros de la familia de genes de araña. Potencialmente, podría determinar la función mecánica de los módulos de proteínas diferentes dentro de una fibroína, o entre los tipos fibroína diferentes. 23 También permite el ensayo de fibras de seda como materiales compuestos, como más de una proteína de seda u otras moléculas se pueden combinar o añadir y girar como una mezcla de proteínas.
Esta metodología es una plataforma giratoria para los otros laboratorios para ampliar fácilmente sobre, como la APPAratuses puede ser construido de una manera fácil. Esto también permite ajustar los parámetros a lo largo de cada paso para optimizar o personalizar el diseño de las fibras específicas poseen unas propiedades mecánicas. Como la necesidad de biomateriales verdes para los futuros incrementos, esta metodología puede ser adaptada para producir fibras que sirven a una gran cantidad de aplicaciones de próxima generación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la NSF RUI Becas MCB-0950372 y DMR-1105310 titulada "Caracterización molecular de Black Widow sedas de araña y comportamiento mecánico de araña Sedas pegamento", respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
