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Biology

의 흐름 세포 계측법 기반 정화 Published: September 21, 2012 doi: 10.3791/4197
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Department of Pathology, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Cell Biology Program, Case Western Reserve University School of Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

의 zygotes을 정화하려면

Abstract

Zygotes는 효모 등 여러 생물의 수명주기의 haploid와 diploid 상태 사이의 중요한 중간체, (그림 1) 1. S. 아르 cerevisiae는 별개의 결합 유형 (마타, MATalpha)의 haploid 세포의 융합에서 결과를 zygotes과 연속의 놀랍도록 비대칭 mitotic 부문이의 결과로 많은 20로 diploid의 자손을 생성하는 해당 안정 diploids에 상승을 제공합니다. 접합자 형성은 사건의 복잡한 순서에 의해 조율되어 있습니다 :이 과정에서 용해 결합 요소는 세포 세포 융합에 세포주기와 절정에 달하다 중단을 촉진 수용체 - 매개 신호 폭포를 게재하고, 수용체 기원하기 위해 바인딩합니다. Zygotes는 전구 또는 줄기 세포 기능의 모델로 간주 될 수 있습니다.

대부분 zygotes의 형성에 대해 알게되었지만 및 zygotes는 일반 signif의 휴대 분자 질문을 조사하는 데 사용되었습니다 있지만,icance는 거의 모든 연구 zygotes가 3-8 haploid 세포의 과반수 인구 함유되어있는 결합 혼합물의 사용을 만들었습니다. 접합자 형성 생화학의 여러 측면과 접합자의 지속적인 삶을 따라서 uninvestigated 남아있다.

효모 zygotes의 정화의 보고서는 침강 특성 9 일 기준으로 프로토콜을 설명하지만,이 침전 기반 절차는 우리의 손에 약 90 % 순도를 얻을 수 없습니다. 또한,이 세포는 hypertonic sorbitol에 노출되는 단점이 있습니다. 따라서 우리는 다양한 정화 절차를 개발했습니다. 이러한 목적을 위해, 빨간색 또는 녹색 형광 단백질을 표현 ha​​ploid 세포의 쌍 접합자 형성, 다양한 시간에 수확하고, 결과 zygotes이 흐름 세포 계측법 기반 정렬 프로토콜을 사용하여 정제 된 수 있도록 공동 incubated했다. 이 기술은 결함과 성숙의 편리한 시각적 평가를 제공합니다. 평균 순도분수의 약 90 %이다. 수확의 타이밍에 따르면, 성숙의 학위를 변화의 zygotes은 복구 할 수 있습니다. 정화 샘플 초기 자손의 복구를 위해,이 전구 세포의 체계적 조사에 대해 "omic"연구에 대한 출발의 편리한 점을 제공합니다.

Protocol

1. Haploid 세포의 성장

  1. S. 성장 표준 조건 10 세 미만 S288C 배경 (BY4741)에서 cerevisiae 세포.
  2. 두 눈에 형광 마커 10 중 하나를 표현하는 haploids을 변환 할 수 있습니다. 선택의 마커 mCherry (A. 존스턴에서 pAJ1661, URA3/CEN)과 융합 세포질로 표현 가용성 GFP (BglII 11 선형화 pEG220, URA3/YIp)와 하나의 ribosomal 단백질, RPL25입니다. 우리는 동등한 두 컬러 정화 프로토콜은 haploid 부모의 세포에 의해 합성 된 다른 밝은 형광 단백질의 사용을 만들 수 기대하고 있습니다. 또한, 세포 벽은 형광 lectins으로 표시 될 수 있습니다.
  3. 하루 앞 접합자 정화에서 각 셀 타입의 5 ML 문화의 예방과 ° C가 1.0을 초과하지 A600에 도달 할 23 박 흔들림과 함께 성장. 2 %의 포도당 (CSM-포도당)를 포함한 완전한 합성 중간에 GFP의 transformants (ATY4442)을 성장uracil 10 부족 합성 선택적 중간에 차 RPL25 - mCherry의 transformants (ATY4552). 실온에서 흔들림 각 세포 유형의 병렬 문화를 유지하고 있습니다.

2. 크로스를 수행

  1. 신선한 매체에 1.0으로 각 샘플의 광학 밀도 (A600)를 조정합니다. [1 광학 밀도 단위 ~ 3 X 10 7 세포 / ML]
  2. 10 초에 대한 하나 이상 소용돌이 다음 간단히 두 문화, 소용돌이 3 회,의 동등한 볼륨을 섞는다.
  3. CSM-포도당 접시를 준비합니다. 번호판은 일상적인 성장에 사용되는 것과 동일 45 쏟아져 이후 분, 한천 10 응고를 건조되었습니다.
  4. CSM-포도당 플레이트의 표면의 가장자리에서 혼합 1cm의 많은 스무으로 40 ML 방울를 배포합니다. 작은 물방울이 처음 표면에 적용하는 경우는 시간이 경과 측정 할 수있는 타이머를 시작합니다. 액체 (약 30 분) 흡수되면, 접시를 커버하고 타나로 오에 그대로 남겨둔다는m 온도.

3. 수확 준비

  1. 수확 샘플 23 1.75-2.5 시간 후에 ° C 반복적으로 얼음 접시를 유지, 150 ML 추위 CSM-포도당을 사용하여 접시에서 개인 말린 물방울을 닦고하여. 반복적으로 복구를 극대화 할 수있는 동일한 매체 비말 지역에게 평균의 10 배에서 20 배를 씻는다. 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 수집합니다.
  2. 얼음에 피셔 FB120의 sonicator (120Volt 120Watt, 주파수 20KHz)로 60 % 진폭에서 샘플 10 배 sonicate 조사.
  3. 몇 또는 전혀 집계가 유지 위상 현미경으로 확인합니다. 셀의 15-50%이 시점에서 zygotes을 형성 할 것으로 예상됩니다.
  4. 더 예방책 (집계가 정착 할 수 있도록하기 위해)로 10 분을위한 얼음에 방해받지 수직 위치에있는 셀의 관을 둡니다.
  5. 볼륨의 최상위 90 %를 복구하고 나일론 메쉬 (BD 매의 폴리 프로필렌 관 스트레이너 캡 (참조 352,235) 포함)를 통해 필터링합니다. 전형적인 실험, 10 7 세포에서한 접시에서 복구는 CSM-포도당 4 ML에 희석이 시점에서 있었다.

4. 유동 세포 계측법

  1. 100 마이크론 팁과 소니 iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer, (고도의 자​​동화 병렬 정렬) HAPS1를 사용하여 정렬 셀. GFP의 여기 들어, 블루 아르곤 이온, 488 nm의 250 milliwatt 레이저를 사용합니다. mCherry에 여기 들어, 561 nm의에서 100 milliwatt 레이저를 사용합니다. 우리가 다른 기계와 경험이 있지 않지만, 우리는 올바른 레이저가 장착 때 Becton 디킨슨 FACSAria, Becton 딕슨의 유입 또는 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 MoFlo XDP 잘 될 것이라고 기대합니다.
  2. 베이스 가능한 세포에 게이트 위해 앞으로 대 다시 분산 형 플롯에 매개 변수를 정렬. 615의 방출 계획을 수립 + / - 30 nm의 대역 통과 필터 (mCherry) 대 525 + / - 25 nm의 대역 통과 필터 (GFP) 4 당장 자리로 이벤트를 나눌 수있는, "레드 + 그린 -", "레드 + 그린 +", "적목 녹색 '및'레드 - 그린 + "(그림 S2). 표준 F로 nonfluorescent 세포를 사용하여또는 "적목 그린 -"사분면의 결정.
  3. 21.5 psi의 피복 압력, 43,400 물방울 / 초의 비말 주파수, 그리고 20.5 PSI의 샘플 압력 정렬 세포.
  4. 초기 정렬 ( "복구 모드") : CSM-포도당 찬 250 ML를 포함하는 차가운 Eppendorf 튜브에 샘플을 수집합니다. 냉장 microfuge의 최고 속도 (Tomy MRX-150, 15,000 RPM)에서 침전 10 초와 흐름 솔루션 (유동 세포 계측법의 피복 솔루션 (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS) BioSure 카탈로그 번호 1027)를 대기음. 500 ML 추위 CSM-포도당을 Resuspend.
  5. 둘째 정렬 ( "순도 모드") : "순결 모드"옵션을 사용하여 초기 정렬에 대한로 정렬을 실시한다. 침전 세포를 정화 500 ML-1.0 ML의 CSM-포도당의 알약을 resuspend. 신진 대사 복구 할 수 있도록 23 ° C에서 24 잘 플레이트에서 15 분 동안 흔들어.

5. DeltaVision의 현미경

  1. 다음과 같은 아가로 오스 패드를 준비 : (UltraPure 1.5 % 아가로 오스의 정지 가져아가로 오스, Invitrogen 다음 종기에 CSM-포도당의 카탈로그 # 15510-07), 와류 짧게, 그리고 수평 표준 유리 슬라이드의 표면에 아가로 오스 솔루션의 0.3 ML 샘플을 적용하고 두 번째 슬라이드를 한 번에 커버 (없이 ) 압력을 가해.
  2. 10 분 동안 냉각 후, 부드럽게, 수평 슬라이딩하여 상단 슬라이드를 제거 부드러운 표면을 떠날 돌봐하고 아가로 오스 레이어를 방해하지. (상단 슬라이드가 제거되면, 세포의 샘플은 1-2 분 내에 적용해야합니다. 위의 슬라이드를 제거하지 않고 실온에서 습한 챔버에 보관하면 패드는 사용하기 전에 하루에에 저장할 수 있습니다.)
  3. 침전 샘플 및 보증금 아가로 오스 패드에있는 펠릿의 1 ML의 aliquots (표면을 만지지 않고). 즉시 정사각형 제 1 coverslip으로 샘플을 다룹니다. 단일 깨끗 razorblade을 초과 아가로 오스를 멀리 트림. 주사기에서 투여 바세린과 준비를 밀봉합니다.
  4. Deltavision (응용 Precisio를 사용하여 이미지∞ / 0.17/FN26.5), binning없이 100x 기름 침지 목표 (올림푸스 UPlanApo 100x/1.40과 n)이.
  5. softWoRx 5.0.0 프로그램 사용 (Z-스택 Deconvolve http://www.api.com/softworx.asp을 )를 최소한 처리 할 수 있습니다. 연속 Z-비행기는 일반적으로 0.2-0.4 미크론 간격에서 수집되었다.

6. 대표 결과

변환 haploid 세포의 형광 강도 수준은 : haploids에 형광의 수준은 그림 S1에 도시된다. 십자가, epifluorescent 시험은 본질적으로 모든 GFP의 transformants가 녹색이었고 모든 mCherry의 transformants은 종종 희미하지만, 붉은 색 있다는 것을 보여 주었다 전에. 십자가에 사용 된 모든 세포가 실제로 형광 있다는 보장하기 위해, 우리는 가장 밝은 형광 신호 subpopulation를 사용했습니다.

완성 된 요리 :fter은 초기 정렬, 레드 + 그린 + 샘플 (그림 S2) 일반적으로 8-20 셀의 입력 번호의 %와 지속적인 세포 세포 접착으로 인해 아마도 haploid 세포의 과도한 숫자가 포함되어 있습니다. 높은 농축이 하나의 정렬을 달성되지 않기 때문에, 부분적으로 정화 예제는 탐사선이 다시 정렬에 이어 60 %의 진폭에 두 번 sonicated해야합니다. 세포의 두 번째 종류의 대상 (두 번째 종류는 불과 15 분. 필요 동안 1-2 시간 사이에 일반적으로 마지막으로 복구 정렬), 레드 + 그린 + 샘플은 입력 셀의 23-52%이 포함되어 있습니다.

단계 현미경 검사 : 검사 상 대비 현미경으로는 최종 접합자 준비의 순도는 21 준비 (86 %에서 91%에 이르기까지)을 통해 약 90 %를 평균 것으로 나타났다. 오염 물질은 서로 연락을했다 haploids의 녹색 또는 빨간색 haploids, 또는 쌍 중이었다. 그림 3은이 zygotes의 비율을 tabulates노 새싹, 중간 꽃 봉오리 (메드), 측면 봉오리 (LAT) 또는 터미널 꽃 봉오리 (기간), 같은 색의 짝을 haploids 수 ( "2Same") 또는 다른 색 ( "2Hap")뿐만 아니라, 개인 haploids ( 누군가에게). 세포가 1.75 시간 이후에 수확 때, 50 % 이상이 unbudded되었으며 다른 하위 카테고리가 (중간, 옆, 또는 터미널 꽃 봉오리 포함) 동등하게 표현되었다. 2.5 시간 후에는 4 가지 범주의 각 (unbudded, 안쪽, 옆 또는 터미널 꽃 봉오리 포함)에 zygotes의 약 같은 숫자가있었습니다.

현미경 관찰 (그림 4) :

zygotes의 구조는 정화 동안 변함에 나타납니다. 십자가의 기간에 따르면, 인구는 위에서 설명한 unbudded 및 budded zygotes의 다른 비율을했다. 녹색과 붉은 haploids 모두 형광 신호 강도에 상당한 차이를 보여 주었다 때문에 comparin에 의해 관찰되기 때문에 다른 사람들이, 주로 녹색있을 때, 일부 zygotes는 주로 붉은 색이었다g 그림 4에 결합 된 이미지의 단일 컬러 이미지. GFP (MW 26kDa)은 핵을 입력하고 핵이 융합하지 않아도 핵에서 발견 할 수도 있습니다. 액포는 검은 색이 아닌 형광 분야로 눈에 띄는.

정화의 최종 제품 개발의 여러 단계에서 다양한 인구를 산출. Zygotes은 공사를하지 않은 퓨전이라는. B 형 zygotes는 unbudded 있습니다. C 형은 작은 꽃 봉오리가 있습니다. 형식은 큰 꽃 봉오리가 D 및 타입 E의 zygotes는 cytokinesis를 받아야하려고합니다. 이전 zygotes의 많은 여전히 비 형광 중간 부 라인 (*)를 전시하고, vacuolar "상속 구조"(I) 12 종종 꽃 봉오리에 접합자에서 확장 할 볼 수 있다는 것 또한 있습니다. 어떤 경우에는 녹색 신호가 빨간색 신호 그 훨씬 더 범위 파트너로 배포하고 있습니다. 이 (Tartakoff, 준비) polysom​​es의 특징 전송의 지연을 반영합니다.

6 zygotes를 복구합니다. 우리가 세포의 수와 RNA의 약 1.5 밀리그램의 압축을 풉니 다 페놀 - 클로로포름 절연 프로토콜을 사용합니다.

정화 zygotes은 사전에 자세한 분석, 냉각 된 이후 우리는 ° C 성장 매체 23에서 부화하는 것이 좋습니다.

그림 1
1 그림. 접합자 형성 연혁. haploids와 diploids 사이의 중간으로 Zygotes. 이 다이어그램은 고전 haploids의 활성화 (shmooing)의 융합, 그리고 초기 꽃 봉오리의 형성을 보여줍니다. 봉오리가 (T)하거나, (M) 안쪽 측면 (L) 또는 터미널 될 수 있습니다.

그림 2. 접합자 정화 프로토콜의 개략도. 포도당을 갖춘 중간에 한천 플레이트의 표면에 부화 후, 세포 혼합물은 세척에 의해 복구 된 후 "순도 모드에서 두 번째 종류의 다음"복구 모드 "의 초기 정렬을 받게. " 노란 색은 mCherry와 GFP 신호 모두 zygotes에서 볼 수 있다는 의미합니다.

그림 3
그림 3. 분수를 정화. 짝짓기 혼합물의 zygotes의 종류는 1.75 또는 상대적으로 초기 대 상대적으로 더 성숙 zygotes에 풍부한 분수를 복구 2.5 시간 후에 수확했다. 독특한 색상이 지정 여덟 독립적 인 실험은, 때마다 포인트를 수행했다. 그래프 zygotes의 상대적인 숫자를 나타내는 헥타르꽃 봉오리 형성 spatially 독특한 패턴이 있어요. 부화의 간단한 기간을 감안할 때 (상온에서 이하 2.5 시간) 관찰 모든 버드는 초기 접합자의 신진 행사입니다.

그림 4
4 그림. 풍부한 분수의 DeltaVision 시험. 일반적인 필드가 Deltavision 현미경으로 조사되었다. 그림도 붉은 색과 녹색 또는 하나의 두 색상을 보여줍니다. 빨간색은 polysom​​al 라벨 (Rpl25p - mCherry)과 cytosolic GFP의 녹색에 해당합니다. 액포 (V), 꽃 봉오리 (B), 핵 (n)이, vacuolar "상속 구조"은 (i), 그리고 부모를 구분하기 위해 나타나는 파티션 (*) : zygotes의 높은 농축하고, 지정된 subcellular 기능을합니다 비교적 초기 zygotes의 도메인. 이들의 변수 전체 색상이 융합 haploids의 상대 강도를 반영합니다. 두 부모 도메인이 유지되는 경우독특한 색상은 마커 (세포질 GFP, mCherry 태그 polysom​​es)의 평균은 불완전했다. 진행 시간 경과 연구 전에 polysomes에 용해 GFP를 redistributes는.을 보여 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

보충 전설

그림 S1
그림 S1. haploid 세포의 형광 맨 왼쪽 :. mCherry 태그 polysomes을 표현 셀은 녹색 신호를 감지하기 위해 조사되었다. 직사각형 창은 부정적인 세포를 피하기 위해 설정되었습니다. 중앙 그래프 : cytosolic GFP를 표현 세포가 분석 탐지의 분명한 밝은 주요 인구를 보여주는되었습니다. 맨 오른쪽 : mCherry 태그 polysom​​es을 표현 세포를 분석 하였다. 직사각형은 (맨 왼쪽에있는 것과 동일) 밝은 세포를 포함하고 모든 수네거티브는 피해야합니다. 지정 "R2"는 지정된 사각형 안에 회수 세포의 비율을 나타냅니다.

S2 그림
S2 그림. 첫 번째와 두 번째 정렬에서 셀 유통.이 두 색상의 플롯은 오른쪽 상단의 구역 (R5)에 그린 + 레드 + 세포의 비율을 나타냅니다. 이 비율은 두 번째 종류에서 52 %로 증가한다. 가로 축 : 녹색 신호. 수직 축 : 적색 신호.

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Discussion

정화 zygotes의 가용성 zygotes는 또한 세포주기 재입국, 세포 벽 개조, 신진 및 상속 특성 등을 받아야하는가 transcriptomics, 단백질 체학 및 lipidomics뿐만 아니라, 메커니즘에 대한 조사를 포함 생화학 연구를 촉진해야 zygotes가 시작 생성 할 수 하나 또는 둘 모두 부모의 특성 변이를 들고 긴장을 갖추고 있습니다. 또한, 정화 zygotes은 haploid 또는 diploid 세포로, 중간 15 % 글리세롤을 포함하는 동안 얼어있을 수 있으며, 나중에 재발 신진의 측면을 모니터링 할 해동.

미세한 목적에 적합한 다른 형광 마커 (예를 들면 태그 histones 또는 mitochondrial 단백질)를 사용하여 예비 실험 zygotes의 신뢰성 회복을 허용하지 않은,하지만, 비교 정화는 누구의 세포벽 haploid 세포로 시작하는 달성 할 수있을 것입니다 또는 빨간색에 연결되었습니다 녹색 fluorophores. 우리는 S 피할 수 있었을uch 절차가 추가 스트레스를 강요하고 접합자 형성 초기 단계에 영향을 미칠 수 있기 때문에.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 그림과 도움을 이전 입력 및 일리아 Aylyarov에 대한 유동 세포 계측법, 박사 뿌르 니마 Jaiswal 박사 디 우와 관련하여 도움이 박사 R. 마이클 Sramkoski 감사드립니다. NIH 그랜트 R01GM089872과 세포 계측법 및 사례 종합 암 센터 (P30 CA43703)의 이미징 현미경 핵심 설비의 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry A. Johnston
Fisher FB120 sonicator Fisher Scientific
Polypropylene tube with strainer cap BD Falcon Ref 352235
Refrigerated microfuge Tomy MRX-150
Flow cytometry sheath solution Biosure 1027
iCyt Reflection Model Flow Cytometer Sony
DeltaVision deconvolution microscope Applied Precision
Upright epifluorescence microscope Leica
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-07
CSM glucose formulation
Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco)		 10

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References

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Zapanta Rinonos, S., Saks, J., Toska, J., Ni, C. L., Tartakoff, A. M. Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes. J. Vis. Exp. (67), e4197, doi:10.3791/4197 (2012).

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