Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Akış Sitometri tabanlı Arıtma Published: September 21, 2012 doi: 10.3791/4197
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Department of Pathology, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Cell Biology Program, Case Western Reserve University School of Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

Arasında zigot arındırmak için

Abstract

Zigot maya dahil birçok organizmanın yaşam döngüsü içinde haploid ve diploid devletler arasındaki temel ara ürünler, (Şekil 1) 1. S. vardır cerevisiae farklı çiftleşme tipi (mata, MATalpha) haploid hücre füzyon sonucu zigotlar ve birbirlerinin çarpıcı bir asimetrik mitotik bölünmeleri 2 bir sonucu olarak en çok 20 diploid soy oluşturmak uygun stabil diploid neden olmaktadır. Zigot oluşum olaylar kompleksi sekans tarafından yönetilir: Bu işlemde, çözünür çiftleşme faktör hücre-hücre füzyon hücre döngüsü ile sonuçlanan bir kesinti kolaylaştırmak reseptör-kaynaklı sinyalleme kaskadını tetikleme, aynı soydan gelen reseptörlere bağlanır. Zigot progenitör veya kök hücre fonksiyonu için bir model olarak kabul edilebilir.

Çok zigot oluşumu hakkında öğrendim olmasına rağmen ve zigot genel anlaml hücre-moleküler soruları araştırmak için kullanılmış olmasına rağmenicance, hemen hemen tüm çalışmalarda zigot 3-8 haploid hücrelerin bir çoğunluk nüfusu ile karışmış olduğu çiftleşme karışımların kullanımı yaptık. Zigot oluşumunun biyokimyasında pek çok yönü ve zigot devam ömrü böylelikle araştırılmamış kalır.

Maya zigot arıtma Raporları, çökelme özellikleri 9 dayanan protokolleri açıklar, ancak bu sedimantasyon tabanlı prosedürü elimizde yaklaşık% 90 saflıkta vermemiştir. Bundan başka, hücrelerin hipertonik sorbitol maruz kaldığı dezavantajı vardır. Bu nedenle çok yönlü bir arınma prosedürü geliştirdik. Bu amaç için, kırmızı veya yeşil floresan protein eksprese eden bir çift haploid hücrelerde zigot oluşumu, çeşitli zamanlarda toplanır ve sonuçta ortaya çıkan zigot bir akış sitometrisi tabanlı bir sıralama protokol kullanılarak saflaştırılmıştır izin vermek için birlikte inkübe edildi. Bu teknik, saflık ve olgunlaşma uygun bir görsel değerlendirme sağlar. Ortalama saflığıfraksiyonu yaklaşık% 90'dır. Hasat zamanlama göre, vadesi değişen derecelerde zigot telafi edilebilir. Saflaştırılmış örnekleri ilk döl kurtarma ve bu progenitör hücre sistematik olarak incelenmesi için, "-omic" çalışmaları için çıkış uygun bir nokta sağlar.

Protocol

1. Haploid Hücre Büyümesi

  1. S. büyütün standart koşullar altında 10 S288C plan (BY4741) den cerevisiae hücreleri.
  2. İki göze floresan işaretleri 10 ya ifade etmek haploidlerin Transform. Seçim marker mCherry (A. Johnston pAJ1661, URA3/CEN,) ile kaynaşmış sitoplazma içerisinde ifade edilen çözünür GFP (BgII 11 ile doğrusallaştırılmış pEG220, URA3/YIp,) ve tek bir ribozomal protein, RPL25 vardır. Biz eşdeğer iki renkli arıtma protokolü haploit ebeveyn hücreler tarafından sentezlenir diğer parlak floresan proteinleri yararlanabilece bekliyoruz. Alternatif olarak, hücre duvarı floresan ile etiketlenmiş lektinler olabilir.
  3. Günden önceki zigot arınma, her hücre tipi, 5 ml kültür aşılamak ve ° C 1.0 geçmeyen A600 ulaşmak için 23 gecede sallayarak onları büyümek. % 2 glukoz (CSM-glikoz) bir de dahil olmak üzere tam sentetik ortamda GFP transformantlar (ATY4442) büyümekurasil 10 eksik sentetik seçici ortamda nd RPL25-mCherry transformantlar (ATY4552). Oda sıcaklığında çalkalanarak her bir hücre tipinde paralel kültürleri koruyun.

2. Bir Çapraz İletken

  1. Taze ortamda 1,0 her numunenin optik yoğunluk (A600) ayarlayın. [1 Optik Yoğunluk Birim ~ 3 x 10 7 hücre / ml]
  2. 10 sn için bir uzun vorteks sonra kısaca iki kültür, vorteks 3 kez, eşit hacimleri karıştırın.
  3. CSM-glukoz tabak hazırlayın. Plakalar rutin büyüme için kullanılan ile aynıdır ve 45 dakika sonra dökme ve agar 10 katılaşma kurutuldu edilmiştir.
  4. CSM-glikoz levhaların yüzeyine kenarından karışım 1 cm kadar yirmi 40 ml damlacıkları dağıtın. Damlacıkları birinci yüzeye tatbik edildiğinde süresi geçtikten ölçmek için zamanlayıcı başlar. Sıvı (yaklaşık 30 dakika) absorbe edildikten sonra, plakaları kaplamak ve roo az rahatsız bırakınm sıcaklığı.

3. Hasat Hazırlıklar

  1. Hasat örnekleri 23 1,75-2,5 saat sonra ° C art arda buz üzerinde plaka tutarak, 150 ml soğuk CSM-glikoz kullanılarak plaka bireysel kurutulmuş damlacıkları yıkama. Defalarca kurtarma maksimize etmek için aynı orta damlacık alanı 10-20 kez yıkayın. Buz üzerinde 15 ml Falcon tüpleri içinde toplayın.
  2. Buz üzerinde bir Fisher FB120 sonikatör (120Volt 120Watt, Frekans 20KHz) ile% 60 genlikte örnekleri 10x sonikasyon kontrol edin.
  3. Az veya hiç agrega kalması bir faz mikroskop doğrulayın. Hücrelerin% 15-50 oranında bu noktada zigot oluşmuş bekleniyor.
  4. Diğer bir önlem (agrega yerleşmeye izin vermek için) ve 10 dakika süreyle buz üzerinde rahat bir dikey pozisyon içinde hücrelerin tüp bırakın.
  5. Hacim üstteki% 90 kurtarın ve bir naylon örgü (BD Falcon Polipropilen boru süzgeç başlığı (Ref 352235) ile) aracılığıyla filtre. Tipik bir deneme, 10 7 hücreleribir levha geri kazanılır CSM-glikoz 4 mL seyreltik bu noktada edildi.

4. Akış Sitometri

  1. 100 mikron ucu ile Sony iCyt Yansıma Modeli Akış Sitometresi, (Highly Otomatik Paralel Sıralama) HAPS1 göre sırala hücreleri. GFP uyarım için, mavi argon-iyon, 488 nm'de 250 milimetrelik lazer kullanmak. MCherry uyarma için, 561 nm'de 100 milimetrelik lazer kullanır. Biz diğer makineleri ile deneyimi yok, ancak biz doğru lazerler ile donatılmış olduğunda Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson akını ya Beckman Coulter MoFlo XDP iyi olacağını bekliyoruz.
  2. Baz canlı hücreler üzerinde kapısı için bir ileri vs geri scatter plot ilgili parametreleri sıralama. 615 bir emisyon arsa Kurmak + / - 30 nm bandpass (mCherry) karşı 525 + / - 25 nm bandpass (GFP) dört parçaya bölünür olayları bölmek için, "Kırmızı + Yeşil", "Kırmızı + Yeşil +", "Kızıl- Yeşil "ve" Kırmızı-Yeşil + "(Şekil S2). Standart bir f nonfluorescent hücreleri kullanınveya "Kırmızı-Yeşil-" kadranda belirlenmesi.
  3. 21.5 psi arasında bir basınç kılıf, 43.400 damla / sn bir damlacık sıklığı ve 20.5 psi arasında bir basınç ile örnek kriteri hücreleri.
  4. İlk sırala ("Kurtarma Modu"): CSM-glukoz soğuk 250 ml içeren soğutulmuş Eppendorf tüpleri içine numunelerini. Bir soğuk mikrofuge'de üst hızı (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) Sediment 10 sn ve akış çözümü (Flow sitometri kılıf çözümü (1 mM EDTA ile PBS) BioSure Katalog No 1027) aspire. 500 ml soğuk CSM-glukoz süspanse edin.
  5. İkinci sırala ("Saflık Modu"): "saflık modu" seçeneğini kullanarak, ilk sıralama için de sıralama yürütün. Tortu hücreler saflaştırılmış ve 500 ml 1.0 ml CSM-glikoz olarak pelet tekrar süspansiyon. Metabolik iyileşme sağlamak için 23 ° C'de 24 oyuklu plakalar içinde 15 dakika süreyle çalkalanır.

5. DeltaVision Mikroskopi

  1. Aşağıdaki gibi agaroz pedleri hazırlayın: (ultra saf% 1.5 agaroz bir süspansiyon getirmekAgaroz, Invitrogen, sonra kaynatın CSM-glikoz Katalog # 15510-07), vorteks kısa ve yatay standart cam slaytların yüzeyine agaroz çözüm 0.3 ml örnek uygulamak ve ikinci bir slayt seferde onlara kapak (olmadan ) basınç uygulayarak.
  2. 10 dakika süreyle soğutulduktan sonra, yavaşça, yatay kaydırarak üst slaytı kaldırmak pürüzsüz bir yüzey bırakmak bakımı ve Agaroz tabaka rahatsız değil. (Üst kayar kaldırıldı, hücreler ve örnek 1-2 dakika içinde uygulanabilir. Üst slaydı çıkarmadan, oda sıcaklığında bir nemli bir bölmede tutulur zaman, ped kullanım öncesi bir gün 'e kadar saklanabilir.)
  3. Tortu örnekleri ve mevduat agaroz pedleri üzerinde pelet 1 ml hacimde (yüzeyine dokunmadan). Hemen bir kare No 1 lamel ile örnek kapsar. Tek taraflı bir jilet ile aşırı agaroz uzak kesin. Bir şırınga kalmaması vazelin ile hazırlıklarını mühürleyin.
  4. Deltavision (Uygulamalı makines kullanarak Görüntü∞ / 0.17/FN26.5); binning olmadan 100x immersiyon yağı objektif (Olympus UPlanApo 100x/1.40 n).
  5. SoftWoRx 5.0.0 programını kullanarak (z-yığınlar Deconvolve http://www.api.com/softworx.asp ) ve minimal işleme. Ardışık z-düzlemleri genellikle 0.2-0.4 mikron aralıklarla toplanmıştır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Dönüştürülmüş haploid hücrelerde floresans şiddeti seviyesi: haploidlerin olarak floresans seviyesini Şekil S1 'de gösterilmiştir. Çapraz, epifluorescent inceleme esasen tüm transformantlar GFP yeşil ve tüm mCherry transformantlar, genellikle sönük rağmen, kırmızı olduğunu göstermiştir önce. Çapraz için kullanılan tüm hücreler gerçekten floresan olduğunu sağlamak için, parlak florasan sinyali ile subpopülasyonu kullanılır.

Verim: Aürkiye'de ilk sıralama, Kırmızı + Yeşil + örnek (Şekil S2) genellikle 8-20 hücrelerin giriş sayısının% ve kalıcı hücre-hücre adezyonu nedeniyle belki haploid hücrelerin aşırı sayıda içerir. Yüksek zenginleştirme bir tek tür ile elde edilemediği için, kısmen saflaştırılmış örnek sonda yeniden sıralama ve ardından% 60 genlik az iki sonike olmalıdır. Hücreler Of ikinci sıralama tabi (ikinci sıralama sadece 15 dk. Gerektirir iken, 1-2 saat arasında genellikle son Kurtarma türlü), Kırmızı + Yeşil + örnekleri girişi hücrelerin 23-52% dahildir.

Faz mikroskobik inceleme: Sınav faz kontrast mikroskobu ile nihai zigot hazırlık saflığı 21 preparatları (% 86% 91 arasında değişen) üzerinde yaklaşık% 90 ortalama gösterdi. Kirletici birbirleri ile iletişim içinde olan haploidlerin yeşil veya kırmızı haploidlerin veya çift ya da vardı. Şekil 3 sahip zigot yüzde tabulateshayır dostum, medial tomurcukları (Med), lateral tomurcukları (Lat) veya terminal tomurcukları (Dönem), aynı renk eşleştirilmiş haploidlerin numarası ("2Same") veya farklı renk ("2Hap"), yanı sıra bireysel haploidlerin ( Hap). Hücreler 1.75 saat sonra hasat edildiğinde,% 50'den fazla unbudded edildi ve diğer alt kategoriler (medial, lateral veya terminal tomurcukları) ile eşit temsil edilmiştir. 2.5 saat sonra her dört kategori (unbudded, medial, lateral veya terminal tomurcukları ile) zigot yaklaşık eşit sayıda vardı.

Mikroskobik Gözlemler (Şekil 4):

Zigotların yapı saflaştırılması sırasında değişmeden kalmasını görünür. Çapraz süresine göre, nüfusu, yukarıda açıklandığı gibi unbudded ve aşılı zigot farklı oranlarda vardı. Yeşil ve kırmızı haploidlerin hem floresan sinyal yoğunluğunda önemli farklılıklar göstermiştir beri Comparin tarafından gözlendiği gibi, diğerleri, ağırlıklı olarak yeşil iken, bazı zigot ağırlıklı olarak kırmızı idig Şekil 4 içinde birleştirilmiş görüntü için tek renkli görüntüler. GFP (MW 26kDa) çekirdeğine girer ve çekirdekleri erimiş olsanız çekirdeğinde bulunabilir unutmayın. Vakuoller siyah floresan olmayan küreler olarak göze çarpıyor.

Arıtma sonunda ürün geliştirme çeşitli aşamalarında farklı bir nüfus verir. Zigot Bir uğramadıklarına füzyon etiketli. Tip B zigotlar unbudded edilir. Tip C küçük bir tomurcuk var. Tür büyük bir tomurcuk D ve E Tipi zigot sitokinez geçmesi üzeresiniz. Önceki zigot çoğu hala bir floresan olmayan medial bölümü hattı (*) sergilemek ve vakuoler "devralma yapısı" (I) 12 sıklıkla tomurcuk içine zigottan uzatmak için görülebilir olduğunu da unutmayın. Bazı durumlarda, yeşil sinyal kırmızı sinyali çok daha büyük bir ölçüde ortak içine dağıttı. Bu (Tartakoff, hazırlık olarak) polysomes karakteristik özelliği transfer gecikme göstermektedir.

6 zigot, kurtarabilirsiniz. Biz bu hücre sayısı RNA yaklaşık 1.5 mg ayıklamak fenol-kloroform izolasyon protokolleri kullanarak.

Saflaştırılmış zigot öncesinde daha fazla analiz için, soğutulmuş beri biz ° C büyüme ortamında 23 inkübasyon önerilir.

Şekil 1
Şekil 1. Zigot oluşumu Kronoloji. Haploidlerin ve diploid arasında bir ara ürün olarak zigotlar. Bu şema, klasik haploidlerin aktivasyonu (shmooing), bunların füzyon ve ilk tomurcuk oluşumunu göstermektedir. Tomurcuklar (T) ya da, (M) yanal orta (M) veya terminal olabilir.

Şekil 2. Zigot arıtma protokolü şematik. Glikoz ile tam bir ortam içinde agar plakalarının yüzeyinde inkübasyondan sonra, hücre karışım yıkama ile geri kazanıldı ve sonra, "saflık kipinde ikinci tür takip" kurtarma modunda "bir ilk tür tabi tutulmuştur. " Sarı renk mCherry ve GFP sinyalleri hem zigot görünür olduğunu belirtir.

Şekil 3
Şekil 3,. Kesirler saflaştırılmış. Çiftleşme karışımlarında zigot Çeşitleri 1.75 veya nispeten erken vs nispeten daha olgun zigot zenginleştirilmiş kesirler kurtarmak için 2,5 saat sonra hasat edilmiştir. Ayrı renk tarafından belirlenmiş sekiz bağımsız deneyler, her bir zaman noktası için yapılmıştır. Grafikler zigot göreli sayıları gösterir bu hatomurcuğu mekansal farklı desenler ettik. Inkübasyon kısa süre göz önüne alındığında (oda sıcaklığında en az 2,5 saat) gözlenen tüm tomurcuklar başlangıç ​​zigotik tomurcuklanan olaylardır.

Şekil 4,
Şekil 4. Zenginleştirilmiş kesirler DeltaVision incelenmesi. Tipik bir alan Deltavision mikroskobu ile incelenmiştir. Çizimler ya kırmızı ve yeşil ya da tek hem renkleri göstermektedir. Kırmızı polysomal etiketi (Rpl25p-mCherry) ve sitosolik GFP ile yeşil karşılık gelir. Boşlukları (v), tomurcukları (b), çekirdek (n), vaküoler "miras yapı", (i) ve ebeveyn ayırmak için görünür bölme (*): zigotların yüksek zenginleştirme ve belirli bir hücre içi özellikleri not edin nispeten erken zigot etki alanları. Onların değişken genel renk erimiş haploidlerin göreli yoğunluğunu yansıtır. Iki parental etki muhafaza edildiği durumlardaayrı bir renk, belirteçleri (sitoplazmik GFP, mCherry etiketli polysomes) arasında dengelenme eksik oldu. Devam Time-lapse çalışmaları öncesinde polysomes çözünür GFP dağıtır. Göstermek büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Tamamlayıcı Efsaneleri

Şekil S1
Şekil S1. Haploid hücrelerin floresans Uzak bıraktı:. MCherry etiketli polysomes ifade Hücreler yeşil bir sinyali tespit etmek için incelenmiştir. Dikdörtgen pencere negatif hücreleri önlemek için kurulmuştur. Orta Grafiği: sitozolik GFP ifade Hücreler, analiz pozitiflerin belirgin parlak büyük nüfus gösteren edildi. Uzak Sağ: mCherry etiketli polysomes ifade Hücreleri analiz edildi. Dikdörtgen (uzak solda aynıdır) parlak hücreleri içerir ve tüm verirnegatifler kaçınılmalıdır. Atama "R2" Belirtilen dikdörtgenin içindeki edilen hücrelerin yüzdesini gösterir.

S2 Şekil
S2 Şekil. Birinci ve ikinci sıralamaya Hücre dağılımı. Bu iki-renkli araziler sağ üst kadranda (R5) Yeşil + Kırmızı + hücrelerinin oranını göstermektedir. Bu oran ikinci çeşit% 52 artar. Yatay eksen: yeşil sinyal. Dikey eksen: kırmızı sinyal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Saflaştırılmış zigotların durumu zigotlar Alternatif olarak hücre döngüsü yeniden giriş, hücre duvarı yeniden şekillenme, filizlenen ve kalıtım özellikleri, vs uğrayan göre transkriptomiks, proteomikler ve lipidomics yanı sıra, mekanizmalarının incelenmesi içeren biyokimyasal çalışmalar kolaylaştırması, zigotlar başlangıç ​​elde edilebilir Bir veya iki ebeveyn karakteristik mutasyonlar taşıyan suşlar ile. Bundan başka, arıtılmış zigotlar, haploid veya diploid hücrelerde için olduğu gibi, orta% 15 gliserol içeren içinde dondurulmuş ve daha sonra tekrarlayan tomurcuklanma yönlerini izlemek için çözülmüş.

Mikroskopik amaçlar için uygun diğer floresan belirteçleri (örn. tagged histon veya mitokondriyal protein) kullanılarak ön deneyler zigot güvenilir kurtarma izin vermedi, ancak karşılaştırılabilir arınma olan hücre duvarı haploid hücre ile başlayarak elde edilebilir olması muhtemeldir veya kırmızı akuple edilmiştir yeşil floroforlar. Biz ler kaçınılmasıuch prosedürleri ek stres empoze ve zigot oluşumu erken aşamalarında etkileyebilir yana.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz çizimler ile yardım için erken giriş ve Ilya Aylyarov için flow sitometri, Dr Purnima Jaiswal ve Dr Di Wu ile yardım Dr R. Michael Sramkoski ederim. NIH hibe R01GM089872 ve Sitometri & Vaka Kapsamlı Kanser Merkezi (P30 CA43703) görüntülenmesi Mikroskopi Çekirdek Tesisi tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry A. Johnston
Fisher FB120 sonicator Fisher Scientific
Polypropylene tube with strainer cap BD Falcon Ref 352235
Refrigerated microfuge Tomy MRX-150
Flow cytometry sheath solution Biosure 1027
iCyt Reflection Model Flow Cytometer Sony
DeltaVision deconvolution microscope Applied Precision
Upright epifluorescence microscope Leica
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-07
CSM glucose formulation
Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco)		 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
  2. Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
  3. Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
  4. Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
  5. Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
  6. Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
  7. Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
  8. Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
  9. Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
  10. Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
  11. Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
  12. Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 67 Hücresel Biyoloji Genetik Moleküler Biyoloji maya zigot akış sıralama çiftleşme akım sitometri,
Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zapanta Rinonos, S., Saks, J.,… More

Zapanta Rinonos, S., Saks, J., Toska, J., Ni, C. L., Tartakoff, A. M. Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes. J. Vis. Exp. (67), e4197, doi:10.3791/4197 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter