Summary
为了净化受精卵
Abstract
合子是必不可少的中间体单倍体和二倍体国家之间在许多生物的生命周期，包括酵母（ 图1）1。S. 酵母合子从不同的交配型的单倍体细胞（MATa的，MATalpha）的融合的结果，并产生相应的稳定的二倍体，依次产生多达20二倍体后代作为结果惊人地不对称的有丝分裂2。 Zygote的形成是由一个复杂的事件序列策划：在这个过程中，可溶性交配因子结合到同源受体，触发受体介导的信号转导通路的有利于在细胞 - 细胞融合的细胞周期和达到高潮中断。受精卵可考虑的祖代细胞或干细胞的功能的模型。
虽然已经了解到的形成受精卵，受精卵已用于研究细胞分子的问题，一般显“接力，几乎所有的研究都使用的交配混合物，其中的受精卵混合与人口占多数的单倍体细胞3-8。合子形成的生物化学的研究的许多方面和合子继续寿命，因此，仍然得不到澄清。
报告的纯化酵母受精卵的描述协议根据其沉降性，但是，这种沉淀为基础的程序没有取得近90％的纯度在我们手中。此外，它具有的缺点，即细胞暴露于高渗山梨糖醇。因此，我们已经开发出一种通用的纯化方法。为了这个目的，双单倍体细胞表达红色或绿色荧光蛋白共同孵育，以允许合子形成，在不同时间收获的，和所得到的受精卵进行纯化，使用流式细胞仪基于排序协议。这种技术提供了一个方便的可视化评估的纯度和成熟。平均纯度的馏分，是约90％。根据收获的时间，受精卵的成熟程度不一，可以恢复。纯化的样品提供了一个方便的“组学”研究的出发点，为恢复初始后代，这个祖细胞，并进行系统的调查。
Protocol
1。单倍体细胞生长
- 成长S.从的S288C背景（BY4741）的酵母细胞在标准条件下10。
- 变换单倍体两个显眼的荧光标记物10的任一表达。给出的标记物是在细胞质中表达的可溶性的GFP（pEG220，URA3/YIp，11用BglII线性化）和一个单一的核糖体蛋白，RPL25 mCherry（pAJ1661，URA3/CEN，从A约翰斯顿）融合。我们预计，相当于两色的纯化方法可以利用其他明亮的荧光蛋白质合成的单倍体亲本细胞。可替代地，细胞壁可以标记用荧光的外源凝集素。
- 前一天受精卵净化，接种5毫升的文化，不同的细胞类型和成长振荡培养过夜，在23°C，达到A600不超过1.0。成长GFP的的转化（ATY4442）完整的合成培养基中，包括2％葡萄糖（CSM-葡萄糖）ND RPL25-mCherry的转化（ATY4552）的合成选择性培养基中缺乏尿嘧啶10。保持平行每种类型的细胞的培养物，在室温下振荡。
2。开展跨
- 于新鲜培养基中，调整每个样品的光密度（A600）为1.0。 [1光密度单位〜3×10 7个细胞/ ml]
- 混合等量的两种文化，涡简要的3倍，其次是一个较长的漩涡，持续10秒。
- 准备CSM-葡萄糖板。该板用于常规生长的那些是相同的，并已被干燥45分钟后，浇注和凝固琼脂10。
- 分发多达二十40毫升的混合物1厘米从CSM-葡萄糖板的表面的边缘的液滴。当液滴首先被施加到表面的启动的定时器，以测量经过的时间。一旦液体被吸收（大约30分钟），覆盖板，让他们不受干扰地在州m温度。
3。收获的准备工作
- 收获1.75-2.5小时后，在23°C的样品落盘使用150毫升冷CSM-葡萄糖，保持板置于冰上，通过反复洗涤个人干的液滴。反复冲洗液滴面积的10-20倍，具有相同的介质，以最大限度地恢复。收集在15ml Falcon管中，在冰上。
- 探头的Fisher FB120（120Watt，120Volt，频率20KHZ）超声波仪，冰超声处理10倍的样本，在60％的幅度。
- 在相差显微镜验证，很少或根本没有聚集。 15-50％的细胞被预期在这一点上已经形成的受精卵。
- 离开该管的细胞不受干扰在冰上10分钟作为一个进一步的预防措施（允许聚集定居）在垂直位置。
- 恢复最顶端的90％的体积和筛选，通过尼龙网（BD的猎鹰聚丙烯管滤网盖（编号352235））。在一个典型的实验中，10 7个细胞从一个板回收4毫升CSM-葡萄糖稀释成在这一点上。
4。流式细胞仪
- 排序细胞与一个100微米的小费使用索尼iCyt反射模型流式细胞仪（高度自动化的并行排序）HAPS1的。 GFP激发，使用蓝色的氩离子电池，250毫瓦的激光波长为488 nm。 mCherry激励，使用100毫瓦的激光波长561 nm。虽然我们没有与其他机器的经验，我们预计，Becton Dickinson公司的FACSAria，，贝克顿迪克森的流入或Beckman Coulter公司MoFlo XDP时，将被罚款配备正确的激光器。
- 底座排序参数上的前进与后退的散点图，以门上的活细胞。建立一个排放情节为615 + / - 30 nm的带通滤波器（mCherry）与525 + / - 25 nm的带通滤波器（GFP），以划分为四个象限的事件，“红+绿的”，“红+绿+”，“红 - 绿色“和”红-绿+“（ 图S2）。使用无荧光的细胞作为一个标准的F或确定的“红 - 绿 - ”象限。
- 排序细胞的鞘21.5 psi的压力，液滴43,400滴/秒的频率，和一个样本20.5 psi的压力。
- 初始排序（“恢复模式”）：收集样品放入冷冻Eppendorf管中含有250毫升的冷CSM-葡萄糖。沉积物10秒在顶端在冷藏的离心速度之间（Tomy MRX-150，15,000 rpm下）和吸液的流动溶液（流式细胞仪鞘液（PBS，用1mM EDTA）BioSure产品目录号：1027）。重悬在500毫升冷CSM-葡萄糖。
- 第二类（“纯模式”）：初始排序进行排序，使用“纯度模式”选项。沉积物的纯化的细胞，并重新悬浮在500毫升1.0毫升CSM-葡萄糖的粒料。在23℃振摇15分钟，在24孔板中以允许代谢恢复。
5。 DeltaVision的显微镜
- 如下：准备琼脂糖凝胶垫带悬挂的1.5％琼脂糖（超纯琼脂糖，Invitrogen公司，产品编号15510-07）CSM-葡萄糖的水烧开，旋涡震荡，然后申请的琼脂糖溶液0.3毫升样品水平标准玻片的表面，覆盖在一次与第二个幻灯片（不施加压力）。
- 冷却10分钟后，轻轻地取下上滑动，水平滑动，照顾，留下一个光滑的表面，而不是扰乱琼脂糖层。 （当已被移除的上部滑动时，细胞的样品应在1-2分钟之内施加当不除去上滑动的情况下保持在室温下在潮湿的腔室时，焊盘可以被存储为使用前一天）。
- 沉积物样品和存款1ml等分的粒料在琼脂糖焊盘（不接触该表面的情况下）。立即用正方形的1号盖玻片覆盖样品。修剪掉多余的琼脂糖与单刃的剃胡刀。用凡士林密封准备从注射器分配。
- 图片使用DeltaVision的（应用实现了n）的100倍油浸物镜没有的分级（奥林巴斯UPlanApo 100x/1.40;∞/ 0.17/FN26.5），。
- 反卷积Z-的堆栈使用softWoRx 5.0.0的的程序（ http://www.api.com/softworx.asp ）和处理微创。通常收集在0.2-0.4微米的间隔连续的Z平面。
6。代表性的成果
在转化的单倍体细胞：在单倍体的荧光水平的荧光强度水平示出在图S1。在十字架上，落射荧光检查显示，基本上所有的GFP转化为绿色和mCherry转化，虽然往往是微弱的，是红色的。 ，以确保所有细胞用于交叉确实荧光，我们使用了亚群与亮的荧光信号。
产量：初始排序后，红色+绿色+样品（ 图S2）典型地包括8-20％的输入的细胞数和过多数量的单倍体细胞，也许是由于持久性的细胞-细胞粘连。由于高富集与单一排序，还没有实现的部分纯化的样品应该是探头超声处理两次在60％的振幅，然后通过重新排序。 （恢复各种通常持续1-2小时之间，而第二类需要15分钟。）的细胞受到的第二类，红+绿+样本包括输入单元格的23-52％。
相镜检：考试相差显微镜显示，21岁以上的准备（从86％到91％不等），平均约90％的纯度的最终受精卵准备。的这些污染物的绿色或红色的单倍体，或双单倍体，在彼此接触的， 图3列出了％的受精卵具有无芽，内侧芽集团（Med），的侧芽（纬度）或顶芽（定期），成对的相同的颜色的单倍体（“2Same”）或不同的颜色（的“2Hap”）的数目，以及个别单倍体（厦门）。 1.75小时后，收获细胞，当超过50％是unbudded和其他亚类（内侧，外侧，或顶芽）同样表示。 2.5小时后，有大约相同数目的受精卵在四类（unbudded，内侧，外侧或顶芽）。
显微观察（图4）：
受精卵的结构出现在纯化过程中保持不变。根据十字架的持续时间，人口有不同的的比例unbudded和发芽受精卵，如上所述。因为两者的绿色和红色的单倍体荧光信号强度表现出相当大的变化，一些受精卵主要是红色，而另一些则主要是绿色，因为是由开始比较观察g为在图4中的合成图像的单色图像。还请注意，绿色荧光蛋白（分子量26kDa）进入细胞核，并且可以发现即使当细胞核没有融合在细胞核中。液泡站出来为黑色非荧光球。
最终产品的纯化，在不同的发展阶段会产生不同的人口。合子标记为A没有经历融合。 B型受精卵unbudded。 C型有一个小芽。 D型有较大的萌芽状态，E型受精卵进行细胞分裂。还请注意，许多早期的受精卵仍然表现出了非荧光内侧分割线（*），并在液泡中的“继承结构”（I）12，经常可以看到从受精卵到芽延长。在某些情况下，绿信号已到伙伴重新分配到更大的程度，加上红色信号。这反映了传输延迟，那是典型的多聚核糖体（Tartakoff，在准备中）。
6个的受精卵，这是足够的许多免疫印迹，使用化学发光的检测程序。使用苯酚 - 氯仿隔离协议我们从这个数目的细胞中提取的RNA约1.5毫克。
由于纯化的受精卵已被冷却，进一步的分析之前，我们建议在23℃下在生长培养基中培养。
图1。受精卵的形成。合子单倍体与二倍体之间的中间年表 。此图显示了单倍体经典激活（shmooing），他们的融合，而形成的最初的萌芽。芽可以内侧（M），横向（L）或终端（T）。
图3。合子纯组分交配混合物品种收获后1.75或2.5小时恢复在比较早的与比较成熟的受精卵丰富的分数。八个独立的实验中，所指定的不同的颜色，进行每个时间点。图表显示的相对数量受精卵公顷VE空间芽形成不同的模式。鉴于在培养的短暂持续时间（小于2.5小时，在室温下）观察到的所有芽初始合子出芽事件。
图4。 DeltaVision的检查丰富的分数。一个典型的领域进行了检查，Deltavision显微镜。该图显示红色和绿色的或单一的颜色。加上红色对应的多聚核糖体的标签（Rpl25p-mCherry）和胞浆GFP绿色。注意：高浓缩的受精卵，并在指定的亚细胞功能的空泡（V），花蕾（B），核（N），空泡“的继承结构”（我），分区（*）出现分离的父母域处于比较初级的受精卵。他们的变量的整体颜色反映的单倍体融合的相对强度。在案件中，两亲本域保留不同的颜色，平衡的标记（细胞质GFP，mCherry标签的多聚核糖体）是不完整的。时间的推移正在进行中的研究表明，可溶性GFP重新分配之前，多聚核糖体。 点击此处查看大图 。
补充传奇
图S1。荧光的单倍体细胞。左：表达mCherry标签核糖体的细胞进行检查，以检测一个绿色的信号。矩形窗口被设置为避免阴性细胞。中图：胞内GFP的表达进行了分析，积极的显着明亮的重大人口。最右边的表达mCherry标记核糖体进行了分析。的矩形（在最左边的相同）包括最亮的细胞，并允许所有要避免的底片。指定“R2”表示所指示的矩形内回收的细胞的百分比。
图S2。细胞分布在第一和第二分拣。这些两色图表明在右上象限（R 5）绿+红+细胞的比例。在第二个排序，这个比例上升到52％。水平轴：绿色信号。垂直轴：红色信号。
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Discussion
获得纯化的受精卵应包括转录组学，蛋白质组学和脂类组学，以及调查机制，促进生化研究的受精卵进行重新进入细胞周期，细胞壁重塑，萌芽和继承的特点，另外，受精卵可以开始生成与承载特性突变株在父母一方或双方。此外，纯化的受精卵，为单倍体或二倍体细胞，也被冻结在含15％甘油的培养基和购买解冻监察方面经常出芽。
使用其他适合微观目的的荧光标记物（ 例如，的标签组蛋白或线粒体蛋白质）的初步实验已经不允许受精卵的可靠恢复，但是，它可比纯化开始单倍体细胞的细胞壁，可以实现很可能已经联接到红色或绿色荧光团。我们避免小号UCH程序，因为它们可能会施加额外的压力，并影响受精卵形成的早期阶段。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢R.迈克尔Sramkoski博士的帮助，流式细胞仪，主任Purnima Jaiswal博士和博士翟武以前的输入和伊利亚·Aylyarov插图的帮助。支持的由NIH资助R01GM089872的和流式细胞术和显微成像技术的核心设施的案例综合癌症中心（P30 CA43703）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
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References
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