Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Проточной цитометрии на основе очистки Published: September 21, 2012 doi: 10.3791/4197
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Department of Pathology, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Cell Biology Program, Case Western Reserve University School of Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

Summary

Для очистки от зиготы

Abstract

Зиготы необходимы промежуточные между гаплоидных и диплоидных государства в жизненном цикле многих организмов, включая дрожжи (рис. 1) 1. С. CEREVISIAE зигот в результате слияния гаплоидных клеток различных типов спаривания (Мата, MATalpha) и вызывает соответствующие стабильным диплоиды, последовательно генерировать целых 20 диплоидного потомства в результате их поразительно асимметричная митотических делений 2. Зигота формирование организованных сложную последовательность событий: в этом процессе, растворимых факторов спаривания связывают родственные рецепторы, вызывая рецептор-опосредованных сигнальных каскадов, которые способствуют прекращение клеточного цикла и завершится в межклеточных синтеза. Зиготы может рассматриваться как модель для предшественников или функцию стволовых клеток.

Хотя многое узнали о формировании зиготы и, хотя зиготы были использованы для исследования клеточного молекулярного вопросы общей значиicance, почти все исследования использовались спаривания смесей, в которых зиготы перемешаны с большинством населения гаплоидных клеток 3-8. Многие аспекты биохимии образование зиготы и продолжения жизни зиготы, следовательно, остаются неизученными.

Доклады очистки дрожжей зиготы описывают протоколы, основанные на их осаждения свойства 9, однако это осаждения на основе процедуры не дали почти 90% чистоты в наших руках. Кроме того, он имеет тот недостаток, что клетки подвергаются воздействию гипертонический сорбит. Поэтому мы разработали универсальную процедуру очистки. Для этой цели пар гаплоидных клеток, экспрессирующих красного или зеленого флуоресцентного белка был инкубируют, чтобы образование зиготы, собранных в разное время, и в результате зиготы очищали с использованием проточной цитометрии сортировка на основе протокола. Эта технология обеспечивает удобную визуальную оценку чистоты и созревания. Средняя чистотафракции составляет около 90%. По времени сбора урожая, зигот различной степени зрелости могут быть восстановлены. Очищенные образцы обеспечивают удобную отправную точку для "-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ" исследования, для восстановления начальной потомства, так и для систематического исследования этой клеток-предшественников.

Protocol

1. Гаплоидное роста клеток

  1. Расти С. CEREVISIAE клеток из S288C фона (BY4741) в стандартных условиях 10.
  2. Преобразование гаплоидов, чтобы выразить любую из двух заметных флуоресцентные маркеры 10. Маркеры выбора являются растворимыми GFP выражается в цитоплазме (pEG220, URA3/YIp, линеаризованная BglII 11) и одного рибосомных белков, RPL25, сливается с mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, от A. Johnston). Мы ожидаем, что эквивалентные двухцветный протоколы очистки могли бы использовать другие яркие флуоресцентные белки, которые синтезируются в гаплоидных родительских клеток. Кроме того, клеточная стенка может быть помечены флуоресцентным лектинов.
  3. За день до зиготы очистки, привить 5 мл культуры каждого типа клеток и выращивать их при встряхивании в течение ночи при 23 ° C для достижения A600 не превышает 1,0. Расти GFP трансформантов (ATY4442) в полной синтетической среде, включая 2% глюкозы (CSM-глюкозы)RPL25-й mCherry трансформантов (ATY4552) в синтетических селективной среде отсутствует урацил 10. Ведение параллельных культур каждого типа клеток при встряхивании при комнатной температуре.

2. Проведение Креста

  1. Регулировка оптической плотности (A600) каждого образца до 1,0 в свежей среде. [1 оптический единичной плотностью ~ 3 х 10 7 клеток / мл]
  2. Смешать в равных объемах двух культур, вихрь кратко 3 раза, затем один длинный вихрь в течение 10 сек.
  3. Подготовка CSM-глюкозы пластин. Пластины идентичны тем, которые используются для обычных рост и были сушат 45 мин после заливки и затвердевания агара 10.
  4. Распределить по двадцать 40-мл капель смеси 1 см от края поверхности CSM-глюкозы пластин. Когда капли сначала наносится на поверхность запустить таймер для измерения времени прошло. Как только жидкость не впитается (около 30 мин), покрытие пластин и оставить их нетронутыми на кенгурум температура.

3. Уборочная подготовка

  1. Урожай образцов после 1.75-2.5 ч при 23 ° C, неоднократно стиральная отдельных высушенных капель от пластины с использованием 150 мл холодной CSM-глюкоза, сохраняя пластин на льду. Повторно промыть капли области 10-20 раз с той же средой для максимального восстановления. Сбор в 15 мл труб Сокол на льду.
  2. Зонд разрушать ультразвуком образцов 10x на 60% амплитуды ультразвукового Fisher FB120 (120Watt, 120Volt, частота 20 кГц) на льду.
  3. Убедитесь в фазе микроскоп, который мало или совсем нет агрегаты остаются. 15-50% клеток, как ожидается, образуются зиготы в этой точке.
  4. Оставьте трубку клеток в вертикальном положении спокойно на льду в течение 10 мин в качестве дополнительной меры предосторожности (чтобы урегулировать агрегатов).
  5. Восстановление верхних 90% от объема и фильтруют через нейлоновую сетку (BD Falcon полипропиленовая труба с фильтром крышкой (Ref 352235)). В типичном эксперименте, 10 7 клетокоправились от одной пластины были в этот момент разводили в 4 мл CSM-глюкоза.

4. Проточной цитометрии

  1. Сортировка ячеек с помощью отражения Sony iCyt модели Цитометр проточный, (высокая степень автоматизации параллельного Сортировка) HAPS1 с 100 микрон чаевых. Для возбуждения GFP, используйте синие аргон-ионный, 250 мВт лазер на 488 нм. Для возбуждения mCherry, используйте 100 мВт лазер на 561 нм. Хотя у нас нет опыта с другими машинами, мы ожидаем, что Becton Dickinson FACSAria, Becton Диксон приток или Beckman Coulter MoFlo XDP было бы прекрасно, если оборудовано с правильным лазеров.
  2. База параметры сортировки на переднем против обратного рассеяния участок для того, чтобы ворота на жизнеспособных клеток. Создание выбросов участка 615 + / - 30 нм полосовой фильтр (mCherry) по сравнению с 525 + / - 25 нм полосовой фильтр (GFP), чтобы разделить события на четыре квадранта, "Красный + зеленый-", "Красный + Зеленый +", "Red- Green-"и" Red-Green + "(рис. S2). Используйте nonfluorescent клеток в качестве стандартного Fили определение "красный-зеленый-" квадрант.
  3. Сортировать клетки с оболочкой давление на 21,5 фунтов на квадратный дюйм, капля частота 43400 капель / сек, давление пробы на 20,5 фунтов на квадратный дюйм.
  4. Начальная Sort ("Recovery Mode"): Сбор образцов в охлажденные пробирки Eppendorf, содержащей 250 мл холодной CSM-глюкоза. Отложения 10 секунд при максимальной скорости в охлажденном микроцентрифуге (Tomy MRX-150, 15000 оборотов в минуту) и аспирации потока раствора (проточной цитометрии оболочки раствором (PBS с 1 мМ EDTA) BioSure № по каталогу 1027). Ресуспендируют в 500 мл холодной CSM-глюкоза.
  5. Второй вид ("чистота Mode"): ведут свой ​​род, как и для начального рода, используя "чистоты режиме». Отложения очищенные клетки и ресуспендируют гранулы в 500 мл 1,0 мл CSM-глюкоза. Встряхивают в течение 15 мин в 24-луночных планшетах при 23 ° C, чтобы метаболического восстановления.

5. DeltaVision микроскопии

  1. Подготовить агарозный прокладки следующим образом: Возьмите с собой суспензию 1,5% агарозы (UltraPureАгарозы, Invitrogen, каталог # 15510-07) в CSM-глюкозы до кипения, вихрь кратко, а затем применить 0,3 мл образцов решение агарозы на поверхности горизонтального стандартные предметные стекла и покрыть их сразу со второй слайд (без применение давления).
  2. После охлаждения в течение 10 мин, осторожно удалите верхние салазки, сдвинув его по горизонтали, стараясь, чтобы оставить гладкой поверхности и, чтобы не нарушить слой агарозы. (При верхнем слайде была удалена, образец клеток следует применять в течение 1-2 мин. При хранении во влажной камере при комнатной температуре, не снимая верхней направляющей, колодки могут храниться до одного дня перед употреблением.)
  3. Пробы отложений и депозитные 1 мл аликвоты осадок на площадках агарозы (не касаясь поверхности). Сразу покрытия образца с квадратными № 1 покровное. Обрежьте излишки агарозы с однолезвийный лезвие бритвы. Печать препаратов с вазелином освобождается от шприца.
  4. Изображение использованием DeltaVision (Applied PRECISIOп) с целью погружения 100x масло без биннинга (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
  5. Deconvolve Z-стеки помощью softWoRx 5.0.0 программы ( http://www.api.com/softworx.asp ) и процесс минимально. Последовательное г-плоскости, как правило, собираются на 0.2-0.4 микрона интервалами.

6. Представитель Результаты

Флуоресценция уровней интенсивности в трансформированных клеток гаплоидным: уровень флуоресценции в гаплоидов показано на рисунке S1. Перед крестом, epifluorescent исследование показало, что практически все трансформантов GFP были зеленые, и что все трансформантов mCherry, хотя зачастую слабее, были красными. Чтобы убедиться, что все клетки, используемые для поперечного действительно были люминесцентные, мы использовали субпопуляции с ярким флуоресцентного сигнала.

Выход:осле начального рода, красный + зеленый + образца (рис. S2) обычно включает в себя 8-20% от входного числа клеток и чрезмерное количество гаплоидных клеток, возможно, из-за постоянных межклеточной адгезии. С высокого обогащения не достигается с помощью одного рода, частично очищенный образец должен быть Зонд ультразвука в два раза при 60% амплитуды с последующим повторным сортировки. (Восстановление видов обычно длятся от 1-2 часов, в то время как второй сорт требуется только 15 мин.) Клеток подвергается второго рода, Красный + Зеленый + образцы включены 23-52% входной клеток.

Фаза микроскопического исследования: изучение фазово-контрастной микроскопии показали, что чистота окончательной подготовки зиготы среднем примерно на 90% более 21 препаратов (от 86% до 91%). Загрязнителей были зеленые или красные гаплоидов, или пары гаплоидов, которые были в контакте друг с другом. Рис. 3 подсчитывает процент зигот, которые имеютне бутон, медиальной почек (Med), боковые почки (лат) или верхушечные почки (срок), количество парных гаплоидов одного и того же цвета ("2Same") или другой цвет ("2Hap"), а также отдельные гаплоидов ( Hap). Когда клетки были собраны после 1,75 ч, более чем на 50% были unbudded и других подкатегорий (с медиальным, боковые, или верхушечные почки) были в равной степени представлены. Через 2,5 часа было примерно равное число зигот в каждой из четырех категорий (unbudded, с медиальным, боковые или верхушечные почки).

Микроскопические наблюдения (рис. 4):

Структура зиготы кажется, остаются неизменными во время очистки. По продолжительности крест, у населения различных пропорциях unbudded и расцветший зиготы, как описано выше. Так как зеленый и красный гаплоидов показали значительные различия в интенсивности флуоресценции сигнала, некоторые зиготы были в основном красные, а другие были в основном зеленые, как это наблюдается на comparinг одноцветные изображения в комбинированном изображения на рисунке 4. Отметим также, что GFP (MW 26kDa) проникает в ядро ​​и могут быть найдены в ядре, даже если ядра не сливаются. Вакуоли выделяются как черная нефлуоресцентного сферах.

Конечным продуктом очистки приводит к разнообразным населением на различных стадиях развития. Зиготы помечены не претерпели слияние. Тип B зиготы которые unbudded. Тип C есть небольшой бутон. Тип D имеют большую почки, и зиготы Type E собираетесь пройти цитокинеза. Отметим также, что многие из ранее зиготы до сих пор проявляют нефлуоресцентного средней линии разделения (*), и что вакуоли "структуры наследования" (I) 12 часто можно увидеть простирается от зиготы в зародыше. В некоторых случаях, зеленый сигнал перераспределяется в партнерах в гораздо большей степени, что красный сигнал. Это отражает задержку передачи, что характерно полисом (Tartakoff, в стадии подготовки).

6 зиготы, которая является достаточной для многих иммуноблотах, используя хемилюминесцентный процедуры обнаружения. Использование фенол-хлороформ протоколов изоляции мы добываем примерно 1,5 мг РНК из этого числа клеток.

С очищенной зиготы были охлажденными до дальнейшего анализа мы рекомендуем инкубации при 23 ° С в питательной среде.

Рисунок 1
Рисунок 1. Хронология образование зиготы. Зиготы в качестве посредника между гаплоидов и диплоидов. Эта диаграмма показывает классические активации (shmooing) гаплоидов, их слияние и формирование начальных зародыше. Почки могут быть как медиальная (M), боковой (L) или терминал (T).

Рисунок 2. Схема зиготы протокол очистки. После инкубации на поверхности агара в полной среде с глюкозой, смесь клеток выделяют мытья и затем подвергают начальной сортировки в "режиме восстановления", затем второго сорта в «чистоте режиме. " Желтый цвет означает, что обе mCherry и GFP сигналы были видны в зиготы.

Рисунок 3
Рисунок 3. Многообразие зигот в очищенной фракции. Смесей спаривания были собраны после того, как 1,75 или 2,5 часа для восстановления фракции обогащенного относительно раннем по сравнению с относительно более зрелой зиготы. Восемь независимых экспериментов, обозначенных различными цветами, были выполнены для каждого момента времени. Графики показывают относительное количество зигот, что гаве пространственно различных моделей формирования бутона. Учитывая краткий срок инкубационного (менее 2,5 часа при комнатной температуре) все почки наблюдается являются начальными зиготических начинающим событий.

Рисунок 4
Рисунок 4. DeltaVision экспертизы обогащенные фракции. Типичные поля был рассмотрен DeltaVision микроскопии. Иллюстрации показывают, как красный и зеленый или одного цвета. Красный соответствует polysomal метки (Rpl25p-mCherry) и зеленый цитозольного GFP. Обратите внимание на высокое обогащение зиготы, и назначенный субклеточных особенности: вакуолей (V), почки (б), ядро ​​(п), вакуоли "структуры наследования" (я), а также разделов (*), которая появляется разделить родительские доменов в относительно раннем зиготы. Их общая переменная цвет отражает относительную интенсивность гаплоидов, что предохранитель. В тех случаях, в которых два родительских областей сохраняютразличных цветов, выравнивание маркеров (цитоплазматическая GFP, mCherry с метками полисом) была неполной. Покадровый исследования в ходе показали, что растворимый перераспределяет GFP до полисом. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Дополнительный Legends

Рисунок S1
Рисунок S1. Флуоресценция гаплоидных клеток крайнем левом. Клетки, экспрессирующие mCherry с метками полисом были рассмотрены с целью выявления зеленого сигнала. Прямоугольное окно было создано с целью избежания негативных клеток. Ближний графике: Клетки, экспрессирующие GFP цитозольного были проанализированы, показывая отчетливо яркой большинство населения срабатываний. Крайний справа: Клетки, экспрессирующие mCherry с метками полисом были проанализированы. Прямоугольника (идентичные тем, что на крайнем левом) включает в себя самые яркие клеток и позволяет всемнегативов, которых следует избегать. Обозначение "R2" указывает на процент клеток восстанавливается в течение указанного прямоугольника.

Рисунок S2
Рисунок S2. Сотовые распределения в первом и втором сортировки. Эти два цвета участков указывать долю зеленый + красный + клеток в правом верхнем квадранте (R5). Эта доля возрастает до 52% во втором роде. Горизонтальная ось: зеленый сигнал. Вертикальная ось: красный сигнал.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наличие очищают зиготы должно способствовать биохимических исследований, включая транскриптомику, протеомики и lipidomics, а также исследование механизмов, с помощью которых зиготы проходят клеточный цикл повторного входа, реконструкции клеточной стенки, начинающие и наследования характеристик и т.д. Кроме того, зиготы может быть создан, начиная с штаммы, несущие характерные мутации в одном или обоих родителей. Кроме того, очищенная зиготы, как и для гаплоидных или диплоидных клеток, могут быть заморожены в среде, содержащей 15% глицерина, а затем талые для мониторинга аспектов периодически почкованием.

Предварительные эксперименты с использованием других флуоресцентных маркеров пригодных для микроскопического целей (например, отмеченных гистонов или митохондриальных белков) не дали надежного восстановления зигот, однако, вполне вероятно, что сопоставимо очистки может быть достигнута, начиная с гаплоидные клетки, клеточная стенка была связана с красной или зеленого флуорофоров. Мы избегали суч процедур, поскольку они могут наложить дополнительный стресс и влияет на ранней стадии зиготы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Р. Майкл Sramkoski за помощью проточной цитометрии, д-р Пурнима Jaiswal и д-р Di Wu для более ранних вход и Илья Aylyarov за помощь с иллюстрациями. Поддерживается NIH Грант R01GM089872 и цитометрии и изображений микроскопии Основной фонд на случай Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry A. Johnston
Fisher FB120 sonicator Fisher Scientific
Polypropylene tube with strainer cap BD Falcon Ref 352235
Refrigerated microfuge Tomy MRX-150
Flow cytometry sheath solution Biosure 1027
iCyt Reflection Model Flow Cytometer Sony
DeltaVision deconvolution microscope Applied Precision
Upright epifluorescence microscope Leica
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-07
CSM glucose formulation
Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco)		 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
  2. Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
  3. Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
  4. Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
  5. Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
  6. Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
  7. Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
  8. Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
  9. Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
  10. Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
  11. Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
  12. Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).

Tags

Биология развития выпуск 67 клеточной биологии генетики молекулярной биологии дрожжи зиготы поток сортировки спаривания проточной цитометрии,
Проточной цитометрии на основе очистки<em&gt; S. CEREVISIAE</em&gt; Зиготы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zapanta Rinonos, S., Saks, J.,… More

Zapanta Rinonos, S., Saks, J., Toska, J., Ni, C. L., Tartakoff, A. M. Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes. J. Vis. Exp. (67), e4197, doi:10.3791/4197 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter