Summary
För att rena zygoter av
Abstract
Zygoter är viktiga intermediärer mellan haploida och anger diploida i livscykeln för många organismer, inklusive jäst (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat av fusionen av haploida celler av distinkt parning typ (MATa, MATalpha) och ger upphov till motsvarande stabila diploider som successivt genererar så många som 20 diploida avkomma som ett resultat av deras påfallande asymmetriska mitotiska divisioner 2. Zygot bildning iscensatt av en komplex sekvens av händelser: I denna process lösliga parning faktorer binder till besläktade receptorer, utlöser receptor-medierad signalering kaskader som underlättar avbrott av cellcykeln och avslutas i cell-cellfusion. Zygoter kan betraktas en modell för progenitorceller eller stamceller funktion.
Även om mycket har lärt sig om bildandet av zygoter och även zygoter har använts för att undersöka cell-molekylära frågor av allmänt betyicance nästan alla studier har använt sig av passande blandningar där zygoter är blandade med en majoritet population av haploida celler 3-8. Många aspekter av biokemi zygoten formation och den fortsatta livet av zygoten förblir därför outforskat.
Rapporter om rening av jäst zygoter beskriver protokoll baserat på deras sedimentering egenskaper 9, men har detta sedimentering-baserade förfarandet inte ger nästan 90% renhet i våra händer. Dessutom har den nackdelen att cellerna exponeras för hypertonisk sorbitol. Vi har därför utvecklat en mångsidig reningsprocedur. För detta ändamål, var par av haploida celler som uttrycker röda eller gröna fluorescerande proteiner saminkuberades att tillåta zygot bildas, skördades vid olika tidpunkter, och de resulterande zygoter renades med användning av en flödescytometri-baserad sortering protokoll. Denna teknik ger en bekväm visuell bedömning av renhet och mognad. Den genomsnittliga renhetsgradav fraktionen är ungefär 90%. Enligt tidpunkten för skörden, kan zygoter av varierande mognad återvinnas. De renade prover ger en bekväm utgångspunkt för "-miska" studier för återvinning av första avkomma och för systematisk undersökning av detta stamcellstransplantation.
Protocol
1. Haploid Celltillväxt
- Grow S. cerevisiae celler från S288C bakgrund (BY4741) under normala förhållanden 10.
- Förvandla haploider att uttrycka en av två iögonfallande fluorescerande markörer 10. Markörerna av val är lösliga GFP uttrycks i cytoplasman (pEG220, URA3/YIp, linjäriserad med Bglll 11) och en enda ribosomalt protein, RPL25, sammansmält med mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, från A. Johnston). Vi förväntar oss att motsvarande två färger reningsprotokoll kan använda andra ljust fluorescerande proteiner som syntetiseras av haploida moderceller. Alternativt, kan cellväggen märkas med fluorescerande lektiner.
- Dagen före zygoten rening, ympa 5 ml kulturer av varje celltyp och odla dem med skakning över natten vid 23 ° C för att nå A600 högst 1,0. Grow GFP transformanter (ATY4442) i fullständigt syntetiskt medium innefattande 2% glukos (CSM-glukos) ennd RPL25-mCherry transformanter (ATY4552) i syntetiskt selektivt medium utan uracil 10. Upprätthåll parallella kulturer av varje celltyp med skakning vid rumstemperatur.
2. Genomföra ett kors
- Justera den optiska densiteten (A600) av varje prov till 1,0 i färskt medium. [1 Optisk densitet Unit ~ 3 x 10 7 celler / ml]
- Blanda lika delar av de två kulturerna, skaka snabbt 3 gånger, följt av en längre virvel i 10 sekunder.
- Förbered CSM-glukos-plattor. Plattorna är identiska med de som används för rutinmässig tillväxt och har torkats 45 min efter gjutning och stelning av ägarn 10.
- Fördela så många som 20 40-ml droppar av blandningen 1 cm från kanten av ytan av CSM-glukos-plattor. När dropparna först appliceras på ytan starta timern för att mäta förfluten tid. När vätskan har absorberats (ca 30 min), täcker plattorna och lämna dem ostörda på room temperatur.
3. Skörd Förberedelser
- Harvest prover efter 1,75-2,5 timmar vid 23 ° C genom upprepad tvättning enskilda torkade dropparna från plattan med användning av 150 ml kall CSM-glukos, håller plattorna på is. Upprepat tvätta droppen området 10-20 gånger med samma medium för att maximera återvinningen. Samla in 15 ml Falcon-rör på is.
- Probe sonikera proverna 10x vid 60% amplitud med en Fisher FB120 sonikator (120Watt, 120Volt, Frekv 20KHz) på is.
- Verifiera i en fas mikroskop som få eller inga aggregat kvar. 15-50% av cellerna förväntas ha bildat zygoter vid denna punkt.
- Låt röret av celler i en vertikal position ostört på is under 10 minuter som en ytterligare försiktighetsåtgärd (för att tillåta aggregat att sedimentera).
- Återvinn översta 90% av volymen och filtrera den genom ett nylonnät (BD Falcon polypropylenrör med sil lock (Ref 352.235)). I ett typiskt experiment, 10 7-celleråtervunnits från en platta var vid denna tidpunkt späddes i 4 ml CSM-glukos.
4. Flödescytometri
- Sortera celler med Sony iCyt Reflection Cytometer Modell Flöde, (högautomatiserade Parallel Sortera) HAPS1 med 100 mikron spets. För GFP excitation, använd den blå argon-jon, 250 mW laser vid 488 nm. För mCherry excitation, använd 100 mW laser vid 561 nm. Även om vi inte har erfarenhet av andra maskiner, förväntar vi oss att Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson tillströmning eller Beckman Coulter MoFlo XDP skulle bli bra när de är utrustade med rätt laser.
- Bas sortering parametrar på en framåt mot rygg spridningsdiagram för att gate på levande celler. Upprätta ett utsläpp tomt på 615 + / - 30 nm bandpassfilter (mCherry) mot 525 + / - 25 nm bandpassfilter (GFP) för att dela upp händelserna i fyra kvadranter, "Röd + Grön-", "Röd + Grön +", "Red- Green-"och" röd-gröna + "(Figur S2). Använd icke-fluorescerande celler som standard feller bestämning av "Röd-Grön-" kvadranten.
- Sortera celler med en mantel tryck av 21,5 psi, en droppe frekvens av 43.400 droppar / sek, och ett prov tryck av 20,5 psi.
- Initial Sortera ("Recovery Mode"): Samla in prov i kylda Eppendorf-rör innehållande 250 ml kall CSM-glukos. Sediment 10 s vid topphastighet i en kyld mikrofug (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) och aspirera flödet lösningen (Flödescytometri mantel (PBS med 1 mM EDTA) BioSure katalog nr 1027). Återsuspendera i 500 ml kall CSM-glukos.
- Andra Sortera ("renhet Mode"): Genomför slag som för den ursprungliga sorten, med hjälp av "renhet läge" alternativet. Sediment det renade celler och återsuspendera pellets i 500 ml-1,0 ml CSM-glukos. Skaka under 15 min i 24-brunnars plattor vid 23 ° C för att tillåta metabolisk återhämtning.
5. DeltaVision Mikroskopi
- Förbered agaros kuddar så här: Ta en suspension av 1,5% agaros (UltraPureAgaros, Invitrogen, Catalog # 15.510-07) i CSM-glukos till en koka, skaka snabbt och sedan tillämpa 0,3 ml prover av agaroslösningen på ytan av horisontella standardapplikationer glasskivor och täck dem på en gång med en andra bild (utan applicera tryck).
- Efter kylning i 10 minuter, ta försiktigt bort den övre bilden genom att skjuta den horisontellt noga med att lämna en slät yta och inte störa Agarose lagret. (När den övre bilden har tagits bort, bör provet av celler appliceras inom 1-2 minuter. När förvaras i en fuktig kammare vid rumstemperatur utan att ta bort den övre bilden, kan kuddar lagras i upp till ett dygn före användning.)
- Sedimentprover och deposition 1 ml portioner av pelleten på agaros kuddar (utan att vidröra ytan). Omedelbart täcka provet med en fyrkantig nr 1 täckglas. Klipp bort överflödigt agaros med en enda kanter rakblad. Täta preparat med vaselin utmatas från en spruta.
- Bild med Deltavision (Applied Precision) med en 100x oljeimmersion mål utan binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40, ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve z-stackar som använder softWoRx 5.0.0 programmet ( http://www.api.com/softworx.asp ) och behandla minimalt. Successiva z-plan i allmänhet in vid 0,2-0,4 mikron mellanrum.
6. Representativa resultat
Fluorescensintensitet nivåer i transformerade haploida celler: Nivån av fluorescens i haploider illustreras i figur S1. Före korset, epifluorescent undersökning visade att i stort sett alla GFP transformanter var gröna och att alla mCherry transformanterna, även om de ofta svagare, var röda. För att säkerställa att alla celler som används för korset var verkligen fluorescerande, vi använde subpopulationen med den ljusaste fluorescerande signalen.
Utbyte: Enfter den första sortering, Röd + Grön + prov (figur S2) innefattar typiskt 8-20% av den ingående antalet celler och ett alltför stort antal haploida celler, kanske på grund ihållande cell-celladhesion. Eftersom hög anrikning inte uppnås med en enda sort, bör det partiellt renade provet vara prob sonikeras två gånger vid 60% amplitud följt av re-sortering. (Recovery sorterar vanligtvis varar mellan 1-2 timmar, medan den andra sortens kräver endast 15 min.) Av cellerna utsätts för den andra sortens omfattade röd + grön + prover 23-52% av de ingående cellerna.
Fas mikroskopisk undersökning: Undersökning av faskontrastmikroskopi visade att renheten hos den slutliga zygoten beredningen genomsnitt cirka 90% över 21 preparat (från 86% till 91%). Föroreningarna var antingen gröna eller röda haploider, eller par av haploider som var i kontakt med varandra. Figur 3 tabulerar procent av zygoter som haringen knopp, mediala knoppar (MED), laterala knoppar (Lat) eller knoppar terminal (Term), antalet parade haploider med samma färg ("2Same") eller olika färg ("2Hap"), samt enskilda haploider ( hap). När cellerna skördades efter 1,75 timmar, var mer än 50% unbudded och de andra underkategorier (med mediala, laterala eller terminal knoppar) var lika representerade. Efter 2,5 timmar var det ungefär lika många zygoter i varje fyra kategorier (unbudded med mediala, laterala eller terminal knoppar).
Mikroskopiska observationer (Figur 4):
Strukturen av zygoter verkar vara oförändrad under reningen. Enligt varaktighet korset hade befolkningen olika proportioner av unbudded och ympade zygoter, som förklarats ovan. Eftersom både de gröna och röda haploider visade stor variation i fluorescerande signal intensitet, var några zygoter övervägande rött medan andra var övervägande grönt, som följs av comparinG enfärgade bilder till de kombinerade bilderna i figur 4. Notera också att GFP (MW 26kDa) in i kärnan och kan hittas i kärnan även när kärnorna inte har smält. Vakuoler sticker ut som svarta icke-fluorescerande sfärer.
Slutprodukten av rening ger en blandad befolkning i olika stadier av utveckling. Zygoter märkta A har inte genomgått fusion. Typ B zygoter är unbudded. Typ C har en liten knopp. Typ D har en större knopp och typ E zygoter är på väg att genomgå cytokines. Notera också att många av de tidigare zygoter fortfarande uppvisar en icke-fluorescerande mediala delningslinjen (*), och att den vakuolära "arv struktur" (I) 12 kan ofta ses att sträcka sig från zygoten in knoppen. I vissa fall har den gröna signalen omfördelas till partnern i mycket högre grad att den röda signalen. Detta återspeglar försening av överlåtelsen som är karakteristisk för polysomer (Tartakoff, under utarbetande).
6 zygoter, vilket är tillräckligt för många immunoblottar, med kemiluminiscenta detektionsförfaranden. Användning av fenol-kloroform isolering protokoll vi utvinner ungefär 1,5 mg RNA från detta antal celler.
Eftersom de renade zygoter ha kylts före ytterligare analys vi rekommenderar inkubering vid 23 ° C i odlingsmedium.
Figur 1. Kronologi av zygot bildas. Zygoter som en intermediär mellan haploider och diploider. Detta diagram visar den klassiska aktivering (shmooing) i haploider, deras fusion och bildandet av den ursprungliga bud. Knoppar kan vara antingen mediala (M), laterala (L) eller terminal (T).
Figur 3. Sorter av zygoter i de renade fraktionerna. Parning blandningar skördades efter 1,75 eller 2,5 timmar att återhämta fraktioner anrikade på relativt tidiga kontra relativt mer mogen zygoter. Åtta oberoende experiment, som utsetts av distinkta färger, utfördes för varje tidpunkt. Graferna visar det relativa antalet zygoter som hektarve rumsligt distinkta mönster av knoppskottet. Med tanke på den korta varaktigheten av inkubationen (mindre än 2,5 h vid rumstemperatur) alla observerats knoppar är initiala zygotiska spirande händelser.
Figur 4. DeltaVision undersökning av berikade fraktioner. En typisk fält undersöktes genom Deltavision mikroskopi. Bilderna visar antingen båda röda och gröna eller enstaka färger. Den röda motsvarar polysomal etiketten (Rpl25p-mCherry) och den gröna till cytosoliskt GFP. Notera den höga anrikningen av zygoter, och de utsedda subcellulära funktioner: de vakuoler (v), knoppar (b), kärna (N), vakuolär "arv struktur" (i), och skiljeväggen (*) som verkar för att separera den parentala domäner i relativt tidiga zygoter. Deras rörliga allmänna färgen reflekterar den relativa intensiteten av de haploider som smält. I de fall i vilka de två parentala domänerna behålleren distinkt färg, var utjämning av markörerna (cytoplasmatisk GFP, mCherry-märkta polysomer) ofullständig. Time-lapse studier pågår visar att lösliga GFP omfördelar före polysomer. Klicka här för att se större bild .
Kompletterande Legends
Figur S1. Fluorescens av haploida celler längst till vänster:. Celler som uttrycker mCherry-märkta polysomer undersöktes för att detektera en grön signal. Den rektangulära fönstret in för att undvika de negativa cellerna. Middle graf: Celler som uttrycker cytosoliskt GFP analyserades, visar tydligt ljusa stora population av positiva. Längst till höger: Celler som uttrycker mCherry-märkta polysomer analyserades. Rektangeln (identisk med den längst till vänster) innehåller de ljusaste cellerna och gör allanegativ undvikas. Beteckningen "R2" anger procentantalet celler återvunna inom den angivna rektangeln.
Figur S2. Cell distribution i första och andra sortering. Dessa två färger tomter anger andelen grön + röd + celler i den övre högra kvadranten (R5). Denna andel ökar till 52% i den andra sorteringen. Horisontella axeln: grön signal. Vertikal axel: röd signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillgången på renade zygoter bör underlätta biokemiska studier med transkriptomik, proteomik och lipidomics samt undersökning av mekanismer genom vilka zygoter genomgår cellcykeln återinträde, cellvägg ombyggnad, spirande och arv egenskaper, etc. Alternativt kan zygoter genereras start med stammar som bär karakteristiska mutationer i en eller båda föräldrarna. Dessutom, de renade zygoter som för haploida eller diploida celler, kan frysas i medium innehållande 15% glycerol och senare tinas att övervaka aspekter av återkommande knoppning.
Preliminära experiment med användning av andra fluorescerande markörer som är lämpliga för mikroskopiska ändamål (t.ex. taggade histoner eller mitokondriella proteiner) har inte tillåtit pålitlig återvinning av zygoter, men det är troligt att jämförbar rening kan uppnås med början haploida celler vars cellvägg har kopplats till rött eller gröna fluoroforer. Vi har undvikit sådana förfaranden eftersom de kan medföra ytterligare stress och påverkar tidiga zygot bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr R. Michael Sramkoski för hjälp med flödescytometri, Dr Purnima Jaiswal och Dr Di Wu för tidigare inmatning och Ilya Aylyarov för hjälp med illustrationerna. Med stöd av NIH Grant R01GM089872 och Cytometry & Imaging Mikroskopi Core Facility för mål Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
