Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

doi: 10.3791/4213 Published: August 24, 2012

ERRATUM NOTICE

Summary

I denne protokollen, oppdaterer vi siste utviklingen i bildebehandling Ca

Abstract

Til tross for en enorm økning i kunnskap om mekanismene bak koding av informasjon i hjernen, en sentral spørsmål om de nøyaktige molekylære trinn samt aktivitet av spesifikke nerveceller i multi-funksjonelle kjerner av hjernen områder som hypothalamus forbli. Dette problemet omfatter identifikasjon av de molekylære komponentene som er involvert i reguleringen av ulike neurohormone signaltransduksjon kaskader. Forhøyninger av intracellulært Ca2 + spille en viktig rolle i regulering av følsomheten av nevroner, både på nivået av signaltransduksjon og på synaptiske områder.

Nye verktøy har kommet for å hjelpe med å identifisere nevroner i mylderet av hjernen neurons ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av en bestemt promoter. Å overvåke både romlig og tidsmessig stimulus-indusert Ca 2 + svar i GFP-merkede nevroner, en non-grønn fluorescerende Ca 2 + indikator dye needs skal brukes. I tillegg er konfokalmikroskopi en favoritt fremgangsmåte for avbildning individuelle nevroner i vev skiver på grunn av sin evne til å visualisere nevroner i distinkte plan av dybde i vevet, og å begrense ut-av-fokus fluorescens. Den Proporsjonal Ca 2 + indikator fura-2 har vært brukt i kombinasjon med GFP-merket nevroner 1. Imidlertid er fargestoffet opphisset av ultrafiolett (UV) lys. Kostnaden av laseren og den begrensede optiske inntrengningsdybde av UV-lys hindret bruken i mange laboratorier. Videre kan GFP fluorescens forstyrre fura-2 signaler 2. Derfor har vi besluttet å bruke en rød fluorescerende Ca 2 + indikator fargestoff. Den enorme Strokes forskyvning av fura-rød tillater flerfarget analyse av rød fluorescens i kombinasjon med GFP hjelp av en enkelt eksitasjonsbølgelengde. Vi hadde tidligere gode resultater ved bruk av fura-rød i kombinasjon med GFP-merket olfactory neurons 3. Protokollene for olfactory vev skiver syntes å fungere equally godt i hypothalamus nevroner 4. Fura-red basert Ca 2 + bildebehandling ble også vellykket kombinert med GFP-merket bukspyttkjertelen β-celler og GFP-merket reseptorer uttrykt i HEK celler 5,6. Litt innfall av fura-rødt er at dens fluorescens intensitet ved 650 nm avtar når indikatorlampen binder kalsium 7. Derfor har fluorescens av hvilende nevroner med lav Ca2 + konsentrasjon relativt høy intensitet. Det bør bemerkes at andre røde Ca 2 +-indikatoren fargestoffer eksisterer eller er under utvikling, som kan gi bedre eller forbedret resultat i ulike nerveceller og hjernen områder.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av løsning og agarosegel

  1. Forbered ekstracellulære løsningen ifølge tabellen med dobbelt-destillert vann. PH vil være ~ 7,3 etter 10 min lufting med CARBOGEN (95% O 2/5% CO2), osmolariteten 300 8 mOsm. Hvis en høyere osmolaritet er nødvendig, kan den justeres ved å tilsette mer glukose (1 mM tilsvarer 1 mOsm). Oppløsningen filtreres to ganger ved hjelp av et 0,2 um membranfilter for å eliminere støvpartikler og mulige bakterielle forurensninger.
Navn på reagens Forkortelse Mol. vekt Kons. Selskapet Kat. N °
Natriumklorid NaCl 58.44 g / mol 120 mM VWR 27810
Natriumhydrogenkarbonat </ Td> NaHCO 3 84,01 g / mol 25 mM Merck 106329
Potassium chloride KCl 74,55 g / mol 5 mM Merck 104936
BES * C 6 H 15 NO 5 S 213,25 g / mol 5 mM Sigma 14853
Magnesiumsulfat, vannfritt MgSo4 120,37 g / mol 1 mM Sigma M7506
Kalsiumkloriddihydrat CaCl * 2H 2 O 147,02 g / mol 1 mM Merck 102382
D (+)-glukosemonohydrat C 6 H 12 O 8 * H 2 O 198,17 g / mol 10 mM Merck 108342

*N, N-Bis (2-hydroksyetyl)-2-aminoethansulfonic syre

  1. Oppløsningen oppbevares ved 4 ° C, men bør luftes med CARBOGEN (95% O 2/5% CO 2) i 10 minutter før bruk.
  2. På denne tiden, forberede også 1 cm 3 blokker av agar gel å stabilisere hjernen under skjæring prosedyren (se trinn 3). Først oppløses 4% (w / v) agar (Sigma) i dobbelt-destillert vann ved oppvarming av løsningen til omtrent 60 ° C. Den oppvarmede oppløst agaroppløsningen helles inn i en firkantet petriskål til en høyde på 1 cm. Etter avkjøling og herding, er 4% agar gel skåret i blokker av en cm 3. Disse blokkene kan lagres i opp til 4 uker ved 4 ° C.

2. Disseksjon av musen hjernen

Sørg for at alle dyr eksperimentelle prosedyrer er utført i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt av dyrevelferd komiteer i de respektive institusjoner.

  1. Før SACRificing dyret, sørg for at agar gel blokkene er klare til bruk.
  2. Anesthetize musen med isofluran (1-4% isofluran i oksygen ved hjelp av en presisjons vaporizer for omtrent 1 min). Det er viktig å hindre hypoksi og derfor neuronskade. En ulempe med isofluran er kostnadene og logistikken med presise vaporizers. En dødelig overdose i et åpent system kan være et alternativ, siden musen vil bli ofret. Yrkesmessig sikkerhet er i dette tilfellet en alvorlig bekymring. Den isofluran må direkte ventilert ut av rommet. Derfor bør en overdose i et åpent system utføres i avtrekkskap.
  3. Avlive musen ved halshugging etter overvåke anestesidybden ved å teste den bakre foten refleks. Denne pedalen eller pote klype refleks er utført av fast klemme en labb eller tå mellom ens fingre for å lokke fram en tilbaketrekking reaksjon fra dyret. Et dyr som viser en refleks er ikke på et kirurgisk anestesinivå og definitivt ikke ien stat å avlive.
  4. Etter dekapitering, kutt hodebunnen med en enkelt kant razorblade sentralt i sagittal retning, fra pannebenet til den eksterne nakkeknøl. Flytte to deler av hodebunnen, først fra den mediale caudal slutten i rostral lateral retning, deretter ned i ventrale retning (figur 1A-C).
  5. Lage to lateral og en rostral kutt i foramen magnum med en liten fjær saks (se for å kutte retning svarte stiplede piler i figur 1C). Nøye Cleave av kraniet fra mediocaudal til lateral rostral med sløve tang (se brede grå piler i figur 1C). I eldre dyr et lite kutt på sagittal sutur er nyttig og ofte nødvendig for å unngå skadelige kortikale lag av hjernen.
  6. På dette tidspunktet er occipital, interparietal og parietalbena bør tas av. Hvis det fortsatt er tilstede, bør dura mater fjernes forsiktig ved hjelp av pinsett for å hindre skade på brain i neste trinn.
  7. Ta bort squamosal bein, anterior ethmoidal og frontpartiet foramen (figur 1D).
  8. Hjernen kan nå enkelt fjernes med en omvendt mikro skje spatel og severing Hjernenerve (figur 1E).

3. Slicing koronal hypothalamus Deler av Mouse Brain

  1. Plasser hjernen på sin ventrale side på en cut-motstandsdyktig overflate og fjerne lillehjernen med en enkelt kant barberblad (figur 2A). Denne rett snitt overflate vil være grunnlaget for montering hjernen på en plate for å muliggjøre kutting av koronale hjernen seksjoner.
  2. Lim hjernen med kuttet delen på platen på mikrotomen (Zeiss, Hyrax V50) med lave mengder en rask herding høy ytelse cyanoakrylat limet superlim (Loctite 406, Figur 1A). I tillegg, lim en 1 cm 3 agar gel blokk (se 1.5) på den ventrale side av hjernen (se 'v' i (figur 2B).
  3. Etter noen sekunder obligasjonen har tørket, sette platen i badekaret av mikrotomen din fylt med 6 ° C kald oksygenrikt (95% O 2/5% CO 2) ekstracellulære løsning (se 1.1).
  4. Bruk passende lav skjæring hastighet og kuttet 300 mikrometer tykke skiver. I tilfelle av mikrotomen vårt, bruker vi en frekvens på 60 Hz, en amplitude på 0,8 mm og en hastighet på 0,8 mm / s (figur 2C). De koronale hjernen skiver er enten samles rett etter hverandre kutt eller kan stå i badekaret til hele hjernen har vært delt. De koronale hjernen skiver er nøye transferred til et begerglass med kaldt oksygenert ekstracellulære løsning. Diverse verktøy er designet for å utføre overføringen (f.eks kutt bred plast eller glass Pasteur pipetter eller brede skjeen spatler). Det avhenger av experimentator som blir foretrukket. Viktigst, bør skivene håndteres hensiktsmessig å begrense skade.
  5. Hvis mikrotomen kan programmeres til å kutte skiver automatisk, kan du begynne å forberede Ca 2 + indikator dye lasting løsning på dette tidspunktet. Ellers, er det anbefalt at utarbeidelsen av denne løsningen utføres før hjernen slicing er avsluttet å minimalisere forsinkelser for måling Ca 2 + responser i neuronene, nemlig før trinn 2.

4. Klargjøring av Ca 2 + Indikator Dye Loading Solution

En kritisk trinn i lasting nevroner ofte forblir helsen til cellene som avhenger av hvor mye skade forårsaket av og hastigheten påDisseksjon prosedyren. En annen viktig trinn synes å være bruk av frisk Pluronic F-127-løsning (se 4.1). Det blir anbefalt å gjøre denne løsningen i laboratoriet og ikke å bruke en forhåndslagde løsning fra en leverandør. Avhengig av temperaturen, fuktigheten og hyllen levetid Pluronic F-127-løsning, ble det registrert nedbrytning av olfactory og hjernen nevronene under Ca 2 + loading prosedyre.

  1. Klargjør 20% (w / v) Pluronic F-127 (Sigma) i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved å legge til Pluronic F-127 pulver på toppen av DMSO løsningen. Direkte sonicate denne løsningen uten forutgående vortex eller blanding. Innen 2 min sonikering på Pluronic F-127 bli oppløst. 100 pl Pluronic F-127 løsninger er forberedt frisk ukentlig.
  2. Ta en tube på 50 mikrogram celle-permeable fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetoksymetyl ester) og tilsett 5 ul 20% Pluronic F-127-løsning. Bland løsningen ved hjelp av tuppen av pipetten din.
  3. Legg 45 pl ekstracellulære solutipå (se 1.1) til blandingen og virvle det snart.
  4. Legge til en ekstra 325 pl ekstracellulære løsning og sonicate røret i 3 min.
  5. Etter sonikering legge 1.156 ml oksygenrikt (95% O 2/5% CO 2) ekstracellulære løsning for å få den endelige Ca 2 + indikator dye lasting løsning (30 pM fura-red/AM, 0,33% DMSO og 0,065% Pluronic F-127) . Oppbevar røret på et mørkt sted inntil bruk (se pkt. 4.8).
  6. Overfør koronale hjernen skiver til en 6-brønns cellekultur plate (BD Falcon) fylt med oksygenert (95% O 2/5% CO 2) ekstracellulære løsning (opp til seks stykker per brønn).
  7. Suge av oksygenrikt ekstracellulære løsning fra kamrene i 6-brønners plate tar seg ikke å skade hjernen skiver.
  8. Pipet direkte 750 pl av Ca 2 + indikator fargestoff loading løsning til hver brønn. Hjernen skiver bør dekkes av løsningen som inneholder fura-red/AM (nedsenking lasting).
  9. Incubate skivene i en O 2 / CO 2 cellekultur inkubator (O 2: 23,5%; CO 2: 5%) i 45 til 60 minutter ved 37 ° C.
  10. Ved slutten av inkubasjonstiden, erstatte Ca 2 + indikator fargestoff loading løsning ved fersk oksygenert ekstracellulære løsning for å hindre overbelastning av celler med fura-rød og påvirke på en subtil måte Ca 2 + måling via den chelaterende handlingen av fargestoffet. Sektorene er så blir holdt i O 2 / CO 2 inkubator (se forrige punkt for innstillinger) til bruk og er levedyktig for opptil 3-6 timer.

5. Mikroskopi og analyse

I denne protokollen vil fluorescensintensiteten av GFP som identifiserer cellen av interesse, og av Ca 2 + indikator fargestoff måles samtidig i hjernen skiver. Således bør konfokal mikroskop være utstyrt med riktig laser, filtre og to fotomultiplikator-rør for å samle de to emissipå signaler. GFP og endringen i fluorescensintensiteten av fura-rødt kan måles ved hjelp av en enkelt eksitasjonsbølgelengde av 488 nm. Utslipp fluorescens fra fluoroforer kan hentes ved hjelp av en 522/DF35 nm filter for GFP og en lang-pass filter for bølgelengder større enn 600 nm for fura-rød.

  1. Å starte overvåking stimulans-induserte endringer i fluorescens-signal, som er et mål på den intracellulære Ca2 +-konsentrasjon, en av de fura-røde loaded hjernen skiver overføres til en innspilling kammer (dvs. Warner Instruments RC-27 Åpent Bath kammer) som kan monteres på den konfokal mikroskop oppsett (Figur 3A, B).
  2. Sikre hjernen stykket med en harpe (Figur 3C) for å hindre at stykket å flytte grunnet perfusjon hastighet bad løsning (oksygenert ekstracellulære løsning, se trinn 1.1). Harpe (slice holderen) er laget av en parallell oppstilling av nylontråd (separert fra hverandre ved ~ 1 mm) tredd påen U form sølv eller platina ramme. Temperaturen av badet oppløsningen ved dette trinnet bør være minst romtemperatur. Hvis de økte temperaturer er nødvendig, har riktig behandling for å bli tatt for å unngå kondens på mikroskop linser og bevegelse av fokusplanet på grunn av skiftende deler i mikroskopet.
  3. Perfuse stykket i 10 min med oksygenrikt ekstracellulære løsning for å fjerne eventuelt overskudd av ekstracellulær Ca2 + indikator fargestoff. Strømningshastigheten av perfusjon bør justeres til ~ 100 ul / s (tips om en passende perfusjon system se 9).
  4. Se på stykket gjennom mikroskopet ved lav forstørrelse, noterer retningen av stykket til postene dine og finne ditt område av interesse i stykket, i vårt tilfelle hypothalamus området i hjernen.
  5. Bytt til stor forstørrelse og finne cellen av interesse i stykke ved å samle GFP bilder og samtidig kontrollere fluorescensintensiteten av fura-rødsignalet (Figur 4A-C). Celler nær overflaten kan bli skadet eller døde. Derfor bør celler lokalisert ved en dybde på mer enn 10 mikrometer velges for avbildning. Vi kunne pålitelig måle cellene opp til en dybde på 40-50 um, startet hvoretter signalstyrken til å slippe. Husk at fura-rødt signal av celler i ro med lav Ca 2 + konsentrasjon har relativt høye fluorescensintensiteter. Denne høye fluorescensintensitet er i dette tilfellet ikke noe tegn på døde celler. GFP signalet kan brukes til å oppdage enhver drift eller bevegelse av vevet skive eller som en indikator for endringer i intracellulær pH 10.
  6. Juster lasereffekten til en verdi som tillater målinger i endringen av fura-rød fluorescensintensitet og hindrer bleking av de to fluoroforer. Derfor begynner med den laveste lasereffekten og juster for å oppnå tilstrekkelig signal-til-støy-forhold ved å endre svartnivå (offset), detektor blenderåpning, forsterkning og laser nøytral tetthetsfilters. Unntatt for lasereffekten, bør det samme gjøres for GFP signalet.
  7. Begynner å hente bilder på priser mellom 0,5 - 2 Hz for å samle fura-rød og GFP-signaler. Oppkjøpet prisen skal være optimalisert til forventet rate av Ca 2 + signal. Spenningsavhengige Ca 2 + pigger kan føre raskere og kortere transienter enn aktivering av noen signaltransduksjon kaskader krever aktivering av ulike andre budbringere. Lengden bildeinnlastingen bør være passende for formålet med eksperimentet. GFP signal over tid vil bidra til å bestemme om noen bevegelse av hjernen skive har oppstått.
  8. Ved kjøp og eksperimentet, alle skanning hodet innstillinger må holdes konstant for å spille pålitelige resultater som kan sammenlignes.
  9. Endringene i fluorescens over tid kan analyseres ved hjelp av ulike matematiske programmer, dvs. ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) eller MatLab (The MathWorks). Ved å sirkle den somata av en GFP-merket nervecellen som indikerer regionen av interesse (ROI), kan dette nøyaktig samme region bli analysert for endringer i Ca 2 + med fura-rød fluorescens-signalet over tid.

Ca 2 +-signaler kan bli presentert som vilkårlige fluorescens enheter eller som verdier (Af / F) for den relative endring i fluorescensintensitet (Af) normalisert til grunnlinjen fluorescens (F). Denne prosedyren resulterer i en negativ avbøyning når det intracellulære Ca 2 + konsentrasjonen øker ved hjelp fura-rødt som Ca 2 + indikator fargestoff. For å lette tolkningen av resultatene, anbefaler vi multiplisere Af / F verdier med -1 for å oppnå positive fluorescens signaler for å vise en økning i Ca 2 + (Figur 4C).

Å sammenligne resultater mellom nevroner amplitude og frekvens av Ca 2 +-signaler ikke skje med en vanlig periode eller sammenlignbare amplituder. Noen signaler kan bli sterkt påvirket av stokastiske prosesser i cellen. Derfor, for å kvantifisere den totale endringen i Ca 2 + i en gitt celle, og å muliggjøre sammenligning av Ca 2 + respons mellom nevroner i ulike områder av hjernen, analyse av arealet under kurven (AUC) er mer hensiktsmessig. Dette tiltaket for mengden av Ca 2 + omfatter noen innledende Ca 2 + forbigående, andre faser og vedvarende forhøyet Ca 2 + svar og svingninger. I dette tilfellet forsiktighet bør tas for å analysere den samme tidsperioden for å aktivere sammenligning mellom nerveceller.

6. Representant Resultater

Å starte karakterisere gonadotropin hormon reseptor (GnRHR) uttrykker nevroner i hypothalamus vi gjort bruk av transgene mus som uttrykker GFP etter Cre-mediert spenSion i GnRHR-uttrykke nevroner 4,11. GFP fluorescerende nevronene ble identifisert i ulike områder av hjernen, inkludert hypothalamus. Å undersøke fysiologiske egenskapene til disse GnRHR nevroner, må vi først registrert Ca 2 +-signaler i hypothalamus skiver med en confocal mikroskop. Først fikk vi koronale hjernen skiver fra disse mus bruker den ovenfor beskrevne protokoll. Figur 1 illustrerer det nødvendige verktøy, materialer og trinn for excising en mus hjerne. De koronale hypothalamus hjernen skiver ble kuttet (figur 2) og deretter lastet i henhold til trinnene i punkt 4 i protokollen. Singel hjerne stykke det riktige området er plassert i et opptak kammer, sikret med en harpe (figur 3) og deretter ved hjelp av en avbildet konfokal mikroskop (se trinn 5.1 til 5.9). Figur 4 viser et eksempel på to individuelle koronale hjernen skiver identifiserer singel GnRHR-τGFP celle etater, fluorescens i ro etter loading hjernen stykket med fura-red/AM og det sammenslåtte konfokal bildet som indikerer at GFP neuron hadde tatt opp fura-rød tilstrekkelig å muliggjøre undersøkelse av stimulans-indusert Ca2 +-signaler i disse cellene. Bruke protokoll vår utgangspunktet vi testet om GnRHR nevroner utnytte lignende Ca 2 +-signaler for stimulans oppdaget i forskjellige områder av hypothalamus i respons til direkte aktivering med GnRH (figur 4E). Varierte imidlertid disse signalene i sin bølgeform avhengig stimulans styrke og hjernen 4. Å kvantifisere endringen i dynamikken i Ca 2 + svar, området-under-the-kurven (AUC) kan beregnes som et mål for økning i intracellulær Ca 2 + (figur 4E) 4. Studier pågår for tiden å undersøke den molekylære basisen bak de Ca 2 + bølger og svingninger, deres avhengighet av sex og hormonelle status på dyret, og om de kan moduleresav andre naturlige stimuli.

Figur 1
Figur 1. Verktøy, materialer og trinn for excising en mus hjernen. A. Verktøy og materialer som brukes for hjernen disseksjon: 1, Loctite 406 superlim, 2, micro skje slikkepott, 3, enkelt kanten barberblad, 4, små og mellomstore våren saks, 5, butte tang, 6, saks, 7, Petri dish inneholder agar gel blokk, 8, bunnplate for montering hjernen til mikrotomen. BF. Bilder av noen trinn blir beskrevet i punkt 2 i protokollen. B. Fotografi av en mus hodet angir kutteposisjonen av hodebunnen (rød linje) og piler (oransje) som indikerer retningen huden skal trekkes bort fra benet (se trinn 2.4). C. Fotografi av musen hodet etter at huden er trukket bort viser bein strukturer (se trinn 2.4). Kutting retning sakse og retning for å bryte åpen kraniet med den butte pinsett indikeres med enten sortestiplede piler eller grå brede piler, henholdsvis. D. Fotografi av musen hjernen etter å eliminere de ulike bein strukturer (se trinn 02.05 til 02.07). E. Fotografi av fjerning av hjernen fortsatt koblet til skallen via Hjernenerve. F. Fotografi av en relativt uskadet mus hjernen.

Figur 2
Figur 2. Kutting av koronale hypothalamus deler av musen hjernen. A. Fotografere angir plasseringen av singelen kanten barberbladet for å eliminere lillehjernen (se trinn 3.1). B. Stilling av agar gel blokk i forhold til hjernen limt på basisplaten på mikrotomen (se trinn 3.2). C. Kapping av koronale hjerne stykke (notat her plasseringen av hjernen og gel blokkposisjoner i forhold til knivbladene på mikrotomen, se trinn 3.4.). d, dorsal, v, ventral.

Figur 3

Figur 4
Figur 4. Ca 2 +-signaler i τGFP nevroner av mus hypothalamus i hjernen skiver. AD. Identifikasjon av en GFP nevroner og samtidig oppkjøp av fura-rød fluorescens i koronale mus hjernen skiver. A. Confocal bilde av en koronale hjerne skive identifisere GnRHR-τGFP nevroner (grønn). B. Relativt ensartet fluorescens signal (rødt) av hjernen området vist i A observert etter lasting hjernen skive med fura-red/AM. C. sammenslåtte bildet viser neurons avbildet i A lastet med Ca 2 + indikator fargestoff (gulaktig). Grenser GFP neuron somata er angitt i stiplede hvite linjer, mens eksempler på to ikke-GFP somata (piler) er angitt i grå linjer. D. Eksempel på et GFP og ikke-GFP nervecellen med høyere mengder rød fluorescens i forhold til bakgrunnen. E. Eksempler på somatisk stimulus-induced Ca 2 + svar fra enkelte GFP-merket nevroner i ulike hypothalamus i hjernen områder (Pe, periventrikulær kjernen; DM, dorsomedial hypothalamus, Arc, arcuate kjernen). Arealet under kurven (AUC) er avbildet i rødt område. Den distinkte Ca 2 +-signaler mellom GnRHR-uttrykke nevroner fra ulike hypothalamus kjerner kan sammenlignes med AUC som et anslag for den totale endringen i Ca 2 + i en gitt celle i samme periode. F. Skjematisk tegninger og diagram som viser plasseringen av GFP-merket nevroner analysert i AE Øvre panel:. Plassering av en koronale hjerne sEL inneholder hypothalamus områder av hjernen (rød linje) midtre og nedre panel:. Skjematisk tegning av en hjerne skive (i midten) og forstørrelse av sin røde eske (nederste panel) indikerer med røde prikker omtrentlig posisjon av de registrerte GFP-merket nevroner fra PE, DM og Arc vist i E, svart område i nedre panel ordningen: 3. ventrikkel. Lavere to diagrammene er tilpasset fra Paxinos og Franklin 12. Nedre venstre hjørne tallet angir avstand (mm) fra bregma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En viktig spørsmål i nevrovitenskap er å forstå hvordan hjernen behandler sosial informasjon. En dominerende kilden til informasjon som er nødvendig for sosial anerkjennelse er kodet av olfactory eller Pheromonal signaler. Påvisning av disse signalene ved nevronale populasjoner i nesen og anerkjennelse av signalene i hjernen, spesielt hypotalamus, spille en viktig rolle i mange sosiale prosesser og påvirke hormoner og andre neuroendokrine faktorer 13-16. En vesentlig hindring for å analysere neuronal responser i hjernen områder som hypothalamus inneholder multifunksjonelle atomkjerner med flere neuroner er identifisering av bestemte nevroner av interesse.

Mange transgene mus linjer er utviklet, der hovedsakelig GFP bidrar til å identifisere nerveceller. Dessverre kompliserer fluorescerende eiendom GFP målinger ved hjelp Ca 2 + indikator fargestoffer som fluo-3 og fluo-4 17. Vi har derfor begynt å undersøkegate GFP-merket nevroner ved hjelp av en rød-forskjøvet Ca 2 + indikator fargestoff, som fura-rød 3,4. Fura-red basert Ca 2 + bildebehandling ble tidligere kombinert med GFP-merket bukspyttkjertelen β-celler og GFP-merket reseptorer uttrykt i HEK celler 5,6. Som fura-2, har noen krysstale mellom fura-rød og GFP blitt rapportert to. Likevel kan ved hjelp av høykvalitets utslipp filtersett med spesifikke båndbredder og dichromatic beamsplitter filtre begrense crosstalk / bleed-through mellom fargestoffer til en viss grad. Det er lurt å bekrefte innstillingene for en confocal mikroskop ved å måle begge kanaler (grønn og rød fluorescens) samtidig med (1) hjernen skiver med GFP-merket nevroner, men ikke lastet med Ca 2 + indikator fargestoff, så vel som (2) hjernen skiver uten GFP-merket nevroner, men lastet med den rød-forskjøvet Ca 2 + indikator. Med de samme innstillingene på confocal mikroskop som med en vanlig eksperiment, kan etterforskeren deretter merke hvis eny fluorescens detekteres i uensartet kanal, som bør unngås.

Noen etterforskere bruker Rhod-2 eller anbefaler bruk av X-rhod1 som et alternativ rød-forskjøvet fargestoff i kombinasjon med GFP-merket celler 2,18,19. Imidlertid Rhod AM synes fargestoffer til å ha en tendens til å konsentrere seg i mitokondriene 20 og har i mange neuroner lav merking virkningsgrad 17. På grunn av behov for forbedret rød-forskjøvet Ca 2 +-indikatorer, etterforskere og selskaper utvikler for tiden nye prober med forhåpentligvis overlegen ytelse 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker våre kolleger som deltok i arbeidet oppsummert her. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'Integrative analyse av luktesans' og av Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ er en Lichtenberg professor i Volkswagen Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma A1296
Fura-red/AM Invitrogen F-3021
Pluronic F-127 Sigma P2443
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 Zeiss 9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL Binder 0019389
Super glue, Loctite 406TM Henckel 142580
Double spatulas, spoon shape Bochem 3182
Microspoon spatulas, spoon shape Bochem 3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades Fine Science Tools 15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades Fine Science Tools 15000-00
Wagner Scissors Fine Science Tools 14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b Fine Science Tools 11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) Warner Instruments 64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
  2. Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
  3. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  4. Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
  5. Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
  6. Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
  7. Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
  8. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
  9. Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. Avaliable from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf (1998).
  10. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
  11. Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
  12. Paxinos, G., Franklin, J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd edn, Academic Press. (2001).
  13. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  14. Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
  15. Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
  16. Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
  17. Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
  18. Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
  19. Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
  20. Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
  21. Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.

There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. 'Stokes' was spelt with an 'r' at publication. This has been corrected to

The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

from

The huge Strokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength.

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).More

Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (66), e4213, doi:10.3791/4213 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter