I denne protokollen, oppdaterer vi siste utviklingen i bildebehandling Ca<sup> 2 +</sup> Signalene GFP-merket nevroner i hjernen vev skiver med en rød fluorescerende Ca<sup> 2 +</sup> Indikator fargestoff.
Til tross for en enorm økning i kunnskap om mekanismene bak koding av informasjon i hjernen, en sentral spørsmål om de nøyaktige molekylære trinn samt aktivitet av spesifikke nerveceller i multi-funksjonelle kjerner av hjernen områder som hypothalamus forbli. Dette problemet omfatter identifikasjon av de molekylære komponentene som er involvert i reguleringen av ulike neurohormone signaltransduksjon kaskader. Forhøyninger av intracellulært Ca2 + spille en viktig rolle i regulering av følsomheten av nevroner, både på nivået av signaltransduksjon og på synaptiske områder.
Nye verktøy har kommet for å hjelpe med å identifisere nevroner i mylderet av hjernen neurons ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av en bestemt promoter. Å overvåke både romlig og tidsmessig stimulus-indusert Ca 2 + svar i GFP-merkede nevroner, en non-grønn fluorescerende Ca 2 + indikator dye needs skal brukes. I tillegg er konfokalmikroskopi en favoritt fremgangsmåte for avbildning individuelle nevroner i vev skiver på grunn av sin evne til å visualisere nevroner i distinkte plan av dybde i vevet, og å begrense ut-av-fokus fluorescens. Den Proporsjonal Ca 2 + indikator fura-2 har vært brukt i kombinasjon med GFP-merket nevroner 1. Imidlertid er fargestoffet opphisset av ultrafiolett (UV) lys. Kostnaden av laseren og den begrensede optiske inntrengningsdybde av UV-lys hindret bruken i mange laboratorier. Videre kan GFP fluorescens forstyrre fura-2 signaler 2. Derfor har vi besluttet å bruke en rød fluorescerende Ca 2 + indikator fargestoff. Den enorme Strokes forskyvning av fura-rød tillater flerfarget analyse av rød fluorescens i kombinasjon med GFP hjelp av en enkelt eksitasjonsbølgelengde. Vi hadde tidligere gode resultater ved bruk av fura-rød i kombinasjon med GFP-merket olfactory neurons 3. Protokollene for olfactory vev skiver syntes å fungere equally godt i hypothalamus nevroner 4. Fura-red basert Ca 2 + bildebehandling ble også vellykket kombinert med GFP-merket bukspyttkjertelen β-celler og GFP-merket reseptorer uttrykt i HEK celler 5,6. Litt innfall av fura-rødt er at dens fluorescens intensitet ved 650 nm avtar når indikatorlampen binder kalsium 7. Derfor har fluorescens av hvilende nevroner med lav Ca2 + konsentrasjon relativt høy intensitet. Det bør bemerkes at andre røde Ca 2 +-indikatoren fargestoffer eksisterer eller er under utvikling, som kan gi bedre eller forbedret resultat i ulike nerveceller og hjernen områder.
En viktig spørsmål i nevrovitenskap er å forstå hvordan hjernen behandler sosial informasjon. En dominerende kilden til informasjon som er nødvendig for sosial anerkjennelse er kodet av olfactory eller Pheromonal signaler. Påvisning av disse signalene ved nevronale populasjoner i nesen og anerkjennelse av signalene i hjernen, spesielt hypotalamus, spille en viktig rolle i mange sosiale prosesser og påvirke hormoner og andre neuroendokrine faktorer 13-16. En vesentlig hindring for å analysere neuronal …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker våre kolleger som deltok i arbeidet oppsummert her. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'Integrative analyse av luktesans' og av Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ er en Lichtenberg professor i Volkswagen Foundation.
Name | Company | Cat. N° |
Agar | Sigma | A1296 |
Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |