في هذا البروتوكول، نقوم بتحديث التقدم الذي أحرز مؤخرا في كاليفورنيا التصوير 2 + الإشارات من الخلايا العصبية في GFP الموسومة شرائح أنسجة المخ باستخدام أحمر فلوري كاليفورنيا 2 + مؤشر صباغة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
على الرغم من الزيادة الهائلة في معرفتنا عن الآليات الكامنة والترميز للمعلومات في الدماغ، والسؤال المركزي بشأن الخطوات الدقيقة الجزيئية فضلا عن نشاط الخلايا العصبية محددة في نواة متعددة الوظائف للمناطق الدماغ مثل منطقة ما تحت المهاد لا تزال قائمة. هذه المشكلة يتضمن تحديد المكونات الجزيئية المشاركة في تنظيم مختلف الاجهزة هرمون عصبي نقل الإشارة. من الكالسيوم داخل الخلايا ترتفع 2 + تلعب دورا هاما في تنظيم حساسية الخلايا العصبية، سواء على مستوى نقل الإشارة في مواقع ومتشابك.
ظهرت أدوات جديدة للمساعدة في تحديد الخلايا العصبية في الدماغ لا يحصى من الخلايا العصبية بالإعراب عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج معينة. لرصد كل من المكان والزمان التحفيز التي يسببها الكالسيوم 2 + الردود في GFP الموسومة الخلايا العصبية، وهي منظمة غير الفلورية الخضراء كا 2 + ن مؤشر صبغلاستخدامها eeds. وبالإضافة إلى ذلك، المجهري متحد البؤر هو وسيلة مفضلة من الخلايا العصبية الفردية في التصوير شرائح الأنسجة بسبب قدرته على تصور الخلايا العصبية في الطائرات متميزة من عمق داخل الأنسجة والحد من خارج التركيز مضان. كا 2 + مؤشر ratiometric FURA-2 وقد استخدم في تركيبة مع GFP الموسومة الخلايا العصبية 1. ومع ذلك، هو متحمس الصبغة بواسطة ضوء (UV) فوق البنفسجية. أعاقت تكلفة من الليزر وعمق الاختراق محدودة الضوئية للضوء UV استخدامه في العديد من المختبرات. وعلاوة على ذلك، قد GFP مضان تتداخل مع الإشارات FURA-2 2. لذلك، قررنا استخدام أحمر فلوري الكالسيوم مؤشر + 2 صباغة. التحول السكتات ضخمة من FURA متعدد الألوان الحمراء يسمح تحليل مضان أحمر في تركيبة مع GFP باستخدام الطول الموجي الإثارة واحد. كان لدينا نتائج جيدة في السابق باستخدام FURA الحمراء في تركيبة مع GFP الموسومة الخلايا العصبية الشمية 3. يبدو أن بروتوكولات لشرائح الأنسجة للعمل حاسة الشم هكذلك qually في الخلايا العصبية طائي 4. FURA الحمراء يعتمد كا 2 + وأيضا الجمع بين التصوير بنجاح مع خلايا البنكرياس β-GFP الموسومة وGFP الموسومة المستقبلات في الخلايا أعرب HEK 5،6. A هوس القليل من FURA الحمراء هو أن كثافة مضان في 650 نانومتر يقلل مرة واحدة في مؤشر يربط الكالسيوم 7. ولذلك، فإن مضان من الخلايا العصبية يستريح مع انخفاض تركيز الكالسيوم + 2 لديه كثافة عالية نسبيا. تجدر الإشارة إلى أن الأحمر أخرى CA 2 +-مؤشر الأصباغ موجودة أو يتم تطويرها حاليا، التي قد تعطي نتائج أفضل أو تحسين في الخلايا العصبية المختلفة، ومناطق الدماغ.
البروتوكول
1. إعداد الحل وجل الاغاروز
- إعداد حل خارج الخلية وفقا للجدول مع الماء المقطر مزدوجة. وسوف تكون درجة الحموضة 7.3 ~ بعد 10 دقيقة مع تحريك كربوجين (95٪ O 2/5٪ CO 2)، والأسمولية 300 الميلي أسمول 8. إذا كنت بحاجة لأعلى الأسمولية، يمكن تعديلها بإضافة مزيد من السكر (1 ملي تساوي 1 الميلي أسمول). يتم تصفية حل مرتين باستخدام غشاء ميكرون 0،2 مرشح للقضاء على جزيئات الغبار والتلوث الجرثومي ممكن.
| اسم كاشف |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
والسؤال الكبير هو في علم الأعصاب لفهم كيفية عمل الدماغ بمعالجة المعلومات الاجتماعية. يتم ترميز مصدر الغالبة من المعلومات اللازمة للاعتراف الاجتماعي من خلال حاسة الشم أو إشارات pheromonal. الكشف عن هذه الإشارات العصبية من قبل السكان في الأنف والاعتراف الإشارات في الدماغ، وخاصة منطقة ما تحت المهاد، ولعب دورا رئيسيا في العديد من العمليات الاجتماعية والهرمونات وعوامل التأثير الهرموني العصبي الأخرى 13-16. عقبة أساسية لتحليل الاستجابات العصبية في مناطق الدماغ مثل منطقة ما تحت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر زملائنا الذين شاركوا في أعمال تلخيص هنا. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (SFB 894)، "تحليل التكاملية من الشم 'وSchwerpunktprogramm DFG 1392 وفولكس واجن من قبل مؤسسة (TLZ). TLZ أستاذ يشتنبرغ لمؤسسة فولكس واجن.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم | شركة | القط. N ° | |
| أجار | سيجما | A1296 | |
| Fura-red/AM | إينفيتروجن | F-3021 | |
| بلورونيك F-127 | سيجما | P2443 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | فيشر العلمية | BP231 | |
| تهتز بليد مشراح الوبر V 50 | زايس | 9770170 | |
| CU جهاز التبريد 65 لمشراح الوبر V 50 | زايس | 9920120 | |
| O 2 / CO حاضنة 2، CB210-UL | غلاف | 0019389 | |
| سوبر الغراء، LOCTITE 406TM | هنكل | 142580 | |
| ضعف ملاعق، شكل ملعقة | Bochem | 3182 | |
| ملاعق Microspoon، شكل ملعقة | Bochem | 3344 | |
| مقص الربيع، موريا، Vannas-ولف - شفرات 7MM | أدوات العلوم الجميلة | 15370-52 | |
| مقص الربيع، Vannas - شفرات 3MM | أدوات العلوم الجميلة | 15000-00 | |
| فاغنر مقص | أدوات العلوم الجميلة | 14071-12 | |
| الملقط الطبية، دومون 7B | أدوات العلوم الجميلة | 11270-20 | |
| غرفة كبيرة مستطيلة حمام مفتوح (RC-27) | وارنر الصكوك | 64-0238 | |
| مبائر التألق BioRad مجهر 2100 | زايس | NA |
المراجع
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.
There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices.
