Fremgangsmåte for fremstilling av<em> Arabidopsis</em> Blad protoplaster som er kompatible med fluorescens aktivert celle sortering (FACS), slik at for studier av spesifikke cellepopulasjoner. Denne metoden er kompatibel med alle<em> Arabidopsis</em> Linje som uttrykker GFP i en undergruppe av celler.
Etter innvielsen av bladet primordium, er biomasse akkumulering kontrollert hovedsakelig ved celleproliferasjon og ekspansjon i bladene en. Imidlertid er Arabidopsis blad et komplekst organ som består av mange forskjellige celletyper og flere strukturer. Samtidig, inneholder voksende blad celler på ulike stadier av utvikling, med cellene lengst fra petiole være den første til å slutte utvide og gjennomgå senescence 1. Ulike celler i bladet er derfor dele, elongating eller differensiering, aktiv, stresset eller død, og / eller svare på stimuli i sub-sett av deres cellulære typen til enhver tid. Dette gjør genomisk studie av bladet utfordrende: for eksempel når analysere uttrykk data fra hele blader, signaler fra genetiske nettverk som opererer i forskjellige cellulære respons soner eller celletyper vil bli forvirret, noe som resulterer i en unøyaktig profilen blir generert.
For å møte dette, several metoder har blitt beskrevet som muliggjøre studier av celle spesifikk genekspresjon. Disse inkluderer laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) 2 eller GFP uttrykker plantene som brukes til protoplast generasjon og påfølgende fluorescens aktivert celle sortering (FACS) 3,4, den nylig beskrevet intakt system for kjernefysisk nedbør 5 og immunoutfelling av polysomes 6.
FACS har blitt brukt for en rekke studier, inkludert viser at cellen identitet og avstand fra rotspissen hadde en signifikant effekt på uttrykk profiler av et stort antall gener 3,7. FACS av GFP linjer har også blitt brukt til å demonstrere celle-spesifikke transcriptional regulering under root nitrogen svar og lateral root utvikling 8, salt stresset 9 auxin distribusjon i roten 10 og for å skape et genuttrykk kart over Arabidopsis skyte apikale meristem 11. SelvFACS har tidligere blitt brukt til å sortere Arabidopsis blad avledet protoplaster basert på autofluorescens 12,13, har så langt bruken av FACS på Arabidopsis linjer uttrykker GFP i bladene vært svært begrenset 4. I følgende protokoll beskriver vi en fremgangsmåte for å oppnå Arabidopsis blad protoplaster som er kompatible med FACS samtidig som effekten av protoplast generasjonen regimet. Vi viser metoden med KC464 Arabidopsis linje, som uttrykker GFP i adaxial epidermis 14, KC274 linje, som uttrykker GFP i den vaskulære vev 14 og TP382 Arabidopsis linje, som uttrykker en dobbel GFP konstruere knyttet til en kjernefysisk lokalisering signal i vernetidsbryterne celler (data ikke vist, Fig. 2). Vi bruker denne metoden for å studere både celle-typespesifikk uttrykk under utvikling og stress, samt heterogene cellepopulasjoner på ulike stadier av senescence.
Vi har beskrevet en fremgangsmåte som tillater bruk av Arabidopsis planter uttrykker GFP i bladene for protoplast generasjon og påfølgende celle sortering hjelp FACS. Denne metode gir tilstrekkelige mengder av RNA som skal benyttes til forsterkning og derfor påfølgende analyse ved enten qPCR eller microarray. Fraksjonene sorterte høyanriket for GFP-holdige celler, som demonstrert av qPCR (figur 2).
For å oppnå høye utbytter av levende protoplaster er det avgjørende å arbeide raskt i løpet av de første trinnene i fremgangsmåten, før bladet strimler har vært vakuum infiltrert med inhibitor-holdige protoplast løsning. I tillegg, når genererer 1 mm blad strimler det er svært viktig å skjære eller kutte bladene heller enn "chop" eller mos dem, da dette fører til unødig skade og dermed en lavere protoplast yield.
En kritisk forskjell mellom fremgangsmåten beskrevet her og andre published metoder er bruk av RNase hemmere og transkripsjonelle inhibitorer. De fleste metodene er utviklet for Arabidopsis ordrøtter som protoplaster kan genereres lettere. Imidlertid, når det arbeides med blader, excepting mesophyll, er det nødvendig å øke protoplast generasjonstid. Derfor er det viktig å inkludere disse hemmere for å beskytte mot endringer i genekspresjon som følge av protoplast generasjonen behandlingen selv (data ikke vist). Imidlertid fører tilstedeværelse av hemmere av en manglende evne til å montere en transkripsjon respons, enten ved å bytte gener på eller av, noe som trolig vil gjøre protoplaster mer sårbare som dette fører til et tap av plastisitet med å motvirke stress av protoplasting prosedyre.
Vi har brukt metoden beskrevet her lykkes med en rekke GFP-uttrykkende Arabidopsis linjer. Viktigere, har vi brukt denne metoden med GFP linjer uttrykker GFP enten sterktkjernen, eller mye svakere i en non-localized/diffuse cytosoliske måte, slik tilfellet er med de KC464 og KC274 linjer som brukes her. Begge typer linjer er kompatible med fremgangsmåten og gi høyanriket fraksjoner av GFP-uttrykkende protoplaster (figur 2 og 3). Metoden kan lett tilpasses andre fluoroforer, selv fluoroforen velges for fluorescens som er vesentlig forskjellig fra den autofluorescens av døde / døende celler for å bevare muligheten for å velge levende celler.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet i Buchanan-Wollaston lab på celle-type og utviklingsstadiet bestemt profilering støttes av Agron-omics prosjektet (tilskudd # LSHG-CT-2006-037704) i 6 th Framework progamme av EU-kommisjonen. Arbeidet i Gifford lab på celle-type spesifikke profilering er støttet av en BBSRC New Investigator Grant (BB/H019502/1).
De KC274 og KC464 Arabidopsis linjene ble hentet fra AAR Webb (University of Cambridge).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
Cellulase RS | Melford | C8003 |
Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |