Fremgangsmåde til fremstilling<em> Arabidopsis</em> Blad-protoplaster, der er kompatible med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), hvilket muliggør undersøgelser af specifikke cellepopulationer. Denne fremgangsmåde er kompatibel med alle<em> Arabidopsis</em> Linje, der udtrykker GFP i en undergruppe af celler.
Efter indledningen af bladet primordium er biomasse akkumulering styres hovedsageligt af celleproliferation og ekspansion i bladene 1. Imidlertid Arabidopsis blad er et komplekst organ, der består af mange forskellige celletyper og flere strukturer. Samtidig indeholder voksende blad celler på forskellige udviklingstrin, med cellerne længst fra stilken være den første til at stoppe ekspanderende og undergår ældning 1. Forskellige celler i bladet derfor dividere, forlængede eller differentiering, aktive, stresset eller døde, og / eller reagere på stimuli i sub-sæt af de cellulære type ad gangen. Dette gør genomisk undersøgelse af bladet udfordrende: for eksempel, når man analyserer udtryk data fra hele blade, signaler fra genetiske netværk inden for forskellige cellulære respons zoner eller celletyper vil blive forvirret, hvilket resulterer i en ukorrekt profil, der genereres.
For at løse dette, several metoder er blevet beskrevet, som muliggør studier af cellespecifik genekspression. Disse omfatter laser-capture mikrodissektion (LCM) 2 eller GFP-udtrykkende planter, der anvendes til protoplast generation og efterfølgende fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) 3,4, den nyligt beskrevne INTAKT system for nuklear udfældning 5 og immunopræcipitation af polysomer 6.
FACS held er blevet anvendt for en række undersøgelser, også viser, at cellens identitet og afstand fra rodspids havde en signifikant virkning på ekspressionen profiler af et stort antal gener 3,7. FACS for GFP-linier er også blevet anvendt til at påvise cellespecifik transkriptionel regulering under root nitrogen svar og laterale rodudvikling 8, salt stress 9 auxin fordeling i roden 10 og at skabe en genekspression kort for Arabidopsis shoot apical meristem 11. SkøntFACS tidligere blevet anvendt til at sortere Arabidopsis blad afledte protoplaster baseret på autofluorescens 12,13, hidtil anvendelse af FACS for Arabidopsis der udtrykker GFP i bladene været meget begrænset 4. I den følgende protokol beskriver vi en fremgangsmåde til opnåelse Arabidopsis blad-protoplaster, der er kompatible med FACS og minimere indvirkningen af protoplast generation regime. Vi viser fremgangsmåden med KC464 Arabidopsis linje, der udtrykker GFP i adaxial epidermis 14, KC274 linje, der udtrykker GFP i vaskulært væv 14 og TP382 Arabidopsis linjen, som udtrykker en dobbelt GFP-konstruktion bundet til et kernelokaliseringssignal i De beskyttelsesceller (data ikke vist, figur 2). Vi i øjeblikket at bruge denne metode til at undersøge både celletypespecifik ekspression under udvikling og stress samt heterogene cellepopulationer på forskellige stadier af senescens.
Vi har beskrevet en fremgangsmåde, der tillader anvendelsen af Arabidopsis planter, der udtrykker GFP i bladene til protoplast generation og efterfølgende cellesortering under anvendelse af FACS. Denne metode giver tilstrækkelige mængder af RNA, der skal anvendes til amplifikation og derfor efterfølgende analyse ved enten qPCR eller microarray. De sorterede fraktioner er højt beriget for GFP-holdige celler som påvist ved qPCR (fig. 2).
For at opnå høje udbytter af levende protoplaster er det vigtigt at arbejde hurtigt i løbet af de indledende trin i proceduren, indtil bladet strimler har været vakuum infiltreret med inhibitoren-holdige protoplast opløsning. Desuden er det, når der genereres 1 mm blad strimler er meget vigtigt at skære eller klippe bladene frem CHOP eller mos dem, da det fører til overdreven beskadigelse og dermed en lavere protoplast udbytte.
En kritisk forskel mellem den her beskrevne fremgangsmåde og andre published metoder er anvendelsen af RNase-hæmmere og transkriptionelle inhibitorer. De fleste metoder er udviklet til Arabidopsis rødder, hvorfra protoplaster kan dannes lettere. Men når der arbejdes med blade, med undtagelse mesophyll, er det nødvendigt at forøge protoplast generation tid. Det er derfor vigtigt at inkludere disse inhibitorer til beskyttelse mod ændringer i genekspression som følge af protoplast generation selve behandlingen (data ikke vist). Tilstedeværelsen af inhibitorerne fører til en manglende evne til at montere en transskription respons, enten ved at skifte gener til eller fra, hvilket kan gøre protoplasterne mere sårbare, da dette fører til et tab af plasticitet, hvormed at imødegå de belastninger af protoplasting procedure.
Vi har anvendt den her beskrevne fremgangsmåde med succes med en række af GFP-udtrykkende Arabidopsis linier. Vigtigere er det, vi har brugt denne metode med GFP linjer udtrykker GFP enten kraftigt ikernen, eller meget svagere i et non-localized/diffuse cytosolisk måde, som det er tilfældet med de KC464 og KC274 linier anvendes her. Begge typer af linjer er kompatible med fremgangsmåden og giver højt beriget fraktioner af GFP-udtrykkende protoplaster (figur 2 og 3). Fremgangsmåden kan let tilpasses andre fluoroforer, selv fluorophoren skal vælges for fluorescens, som er signifikant forskellig fra autofluorescens af døde / døende celler for at bevare evnen til at vælge levende celler.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i Buchanan-Wollaston lab på celle-type og udviklingsstadiet specifik profilering understøttes af Agron-omik-projektet (tilskud # LSHG-CT-2006 til 037.704) i 6 rammeprogram for Programme for Europa-Kommissionen. Arbejdet i Gifford lab på celletypespecifik profilering understøttes af en BBSRC New Investigator tilskud (BB/H019502/1).
De KC274 og KC464 Arabidopsis linjer blev opnået fra AAR Webb (University of Cambridge).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
Cellulase RS | Melford | C8003 |
Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |