En metod för framställning av<em> Arabidopsis</em> Blad protoplaster som är kompatibla med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), möjliggör studier av specifika cellpopulationer. Denna metod är kompatibel med alla<em> Arabidopsis</em> Linje som uttrycker GFP i en delmängd av celler.
Efter initiering av blad primordium är biomassa ackumulering styrs främst av celltillväxt och expansion i bladen 1. Emellertid är Arabidopsis löv ett komplext organ som består av många olika celltyper och flera strukturer. Samtidigt innehåller den växande löv celler i olika stadier av utveckling, med cellerna längst bort från bladskaft är den första att sluta expandera och genomgår åldrande 1. Olika celler i bladet därför dela, förlängning eller differentiering, aktiv, stressad eller döda, och / eller reagera på stimuli i sub-uppsättningar av deras cellulära typ åt gången. Detta gör genomiska studie av blad utmanande: exempelvis vid analys expression data från hela blad, signaler från genetiska nätverk inom distinkta cellulära respons zoner eller celltyper kommer förväxlas, vilket resulterar i en felaktig profil genereras.
För att lösa detta, several metoder har beskrivits, vilka möjliggör studier av cell-specifik genexpression. Dessa inkluderar laser-capture mikrodissektion (LCM) 2 eller GFP uttryckande växter som används för generering protoplastfusion och efterföljande fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 3,4, den nyligen beskrivna INTAKT system för kärn utfällning 5 och immunoutfällning av polysomer 6.
FACS har framgångsrikt använts för ett antal studier, bland annat visar att cellidentiteten och avståndet från roten spetsen hade en betydande effekt på uttryck profiler av ett stort antal gener 3,7. FACS av GFP linjer har också använts för att demonstrera cellspecifik transkriptionsreglering under svaren rot kväve och laterala rotutveckling 8, salt stressen 9 auxin distribution i roten 10 och att skapa en karta genuttryck av Arabidopsis skjuta apikala meristem 11. ÄvenFACS tidigare har använts för att sortera Arabidopsis leaf härledda protoplaster baserade på autofluorescens 12,13, har hittills användningen av FACS på Arabidopsis som uttrycker GFP i bladen varit mycket begränsad 4. I följande protokoll beskriver vi en metod för att erhålla Arabidopsis blad protoplaster som är kompatibla med FACS och samtidigt minimera effekterna av protoplast generationen regimen. Vi visar metoden med KC464 Arabidopsis linjen, som uttrycker GFP i adaxial epidermis 14, KC274 linjen, som uttrycker GFP i den vaskulära vävnaden 14 och den TP382 Arabidopsis linjen, som uttrycker en dubbel GFP konstrukt kopplad till en nukleär lokaliseringssignal i vakten celler (data ej visade, figur 2). Vi håller för närvarande med denna metod för att studera både celltyp uttryck under utveckling och stress, samt heterogena cellpopulationer i olika stadier av åldrande.
Vi har beskrivit en metod som medger användning av Arabidopsis växter som uttrycker GFP i bladen för protoplaster generering och efterföljande cellsortering med användning av FACS. Denna metod ger tillräckliga mängder av RNA som skall användas för förstärkning och därför efterföljande analys av antingen qPCR eller microarray. De sorterade fraktionerna höganrikat för GFP-innehållande celler, vilket framgår av qPCR (figur 2).
För att uppnå höga utbyten av levande protoplaster är det viktigt att arbeta snabbt under de inledande stegen i förfarandet, tills blad remsorna har vakuum infiltrerat med hämmare innehållande protoplast lösning. Dessutom, när du skapar ett band mm blad är det mycket viktigt att skiva eller skära bladen i stället "chop" eller mosa dem, eftersom detta leder till svåra skador och därmed lägre protoplast avkastning.
En kritisk skillnad mellan den här beskrivna metoden och andra published metoder är användningen av RNas-hämmare och transkriptionella inhibitorer. De flesta metoder är utvecklade för Arabidopsis rötter, från vilka protoplaster kan genereras lättare. Men när man arbetar med löv, förutom mesophyll, är det nödvändigt att öka tiden protoplast generationen. Därför är det viktigt att inkludera dessa inhibitorer att skydda mot förändringar i genuttryck som resultat av protoplast generationens behandling själv (data visas ej). Leder dock förekomsten av inhibitorer till en oförmåga att montera en transkription svar, antingen genom att byta gener på eller av, vilket sannolikt kommer att göra protoplasterna mer sårbara eftersom detta leder till en förlust av plasticitet som att motverka stressen i protoplasting förfarande.
Vi har använt den metod som beskrivs här framgångsrikt med ett antal GFP-uttryckande Arabidopsis linjer. Det är viktigt att vi har använt denna metod med GFP som uttrycker GFP antingen starktkärnan, eller mycket svagare i ett cytosoliskt non-localized/diffuse sätt, såsom är fallet med de KC464 och KC274 linjer som används här. Båda typer av linjer är kompatibla med metoden och ger höggradigt anrikade fraktioner av GFP-uttryckande protoplaster (figur 2 och 3). Metoden kan lätt anpassas till andra fluoroforer, fastän fluoroforen måste väljas för fluorescens som är signifikant skild från autofluorescens av döda / döende celler för att bevara förmågan att välja levande celler.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Buchanan-Wollaston labb på cell-typ och utvecklingsstadium specifik profilering stöds av Agron-genomik projekt (bidrag # LSHG-CT-2006 till 037.704) i 6: e ramprogram stadsdelsförnyelse av Europeiska kommissionen. Arbetet i Gifford labbet på celltypspecifik profilering stöds av en BBSRC New Investigator Grant (BB/H019502/1).
De KC274 och KC464 Arabidopsis erhölls från AAR Webb (University of Cambridge).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
Cellulase RS | Melford | C8003 |
Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |