Summary
Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.
Abstract
Glikosifingolipidler (GSL) 'ın böyle bir embriyonik gelişim, sinyal iletimi ve immün reseptör tanıma 1-2 gibi önemli biyolojik süreçler için yapısal bilgiler ayı biomacromolecules, en glycoconjugate sınıfına aittir. Bu kompleks izomerler şeklinde şeker parçalan, ve yağ asil zincir uzunluğu, doymamışlık ve hidroksilasyon ile varyasyonları dahil olmak üzere, lipid parçalarını içerir. Karbonhidrat ve seramid bölümleri Hem biyolojik önemi temeli olabilir. Örneğin, üç-hexosylceramides globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) ve aynı moleküler kitleleri, ancak 3-4 tamamen farklı biyolojik işlevleri için sorumlu karbonhidrat kısmın, belirgin şeker bağların sahip isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) da içermektedir. Başka bir örnek olarak, gösterilmiştir ki alfa-galactosylceramide, invari için güçlü bir agonist ligandının seramid kısmının modifikasyonukarınca NKT hücreleri, kanser ve oto-immün hastalıklar 5 hayvan modellerinde değişiklikler, sitokin salgılama profilleri ile işlev. Bağışıklık organlarda izomerleri ve hücrelerin yapısal bir analizini yapmakta zorluk çok biyolojik fonksiyonları 6 belirlemek için bir bariyer görevi görür.
Burada, 7-9 bağışıklık hücreleri içinde glycosphingolipid profillerin, nispeten basit, hızlı ve hassas analiz için bir yöntem, bir biçim ortaya görüntülenmiştir. Bu yöntem, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon kullanan sonraki analizi ile Glikosifingolipidler 10-15 çıkarılması ve kimyasal modifikasyonu (permethylation, Şekil 5A aşağıya bakınız, heksoz bölgesinin tüm OH gruplarının permethylation sonra reaksiyon MeO ile değiştirildi), zamana dayalı -uçuş kütle spektrometresi (MALDI-TOF/MS) ve iyon tuzağı kütle spektrometresi. Bu yöntem, bir tam bir analiz için 50 milyon bağışıklık hücrelerini gerektirir. Deneyler bir hafta içinde tamamlanabilir. Çeşitli Glikosifingolipidler nispi bolluk sentetik standartlar ile karşılaştırma ile tarif edilebilir. Toplam iGb3/Gb3 karışım 2 fmol 9 mevcut olduğunda, bu yöntem, GB 3 izomerler arasında% 1 iGb3 ölçmek için bir hassasiyete sahiptir.
Iyon tuzak kütle spektrometrisi izomerleri analiz etmek için de kullanılabilir. Örneğin, aynı numune içinde globotriaosylceramide ve isoglobtriaosylceramide varlığını incelemek için, bir yapısal iki (Şekil 5 aşağıya bakınız) arasında ayrım glycosphingolipid moleküllerin parçalanma kullanılabilir. Ayrıca, şeker parçalan kimyasal modifikasyonu (a permethylation reaksiyon ile) daha yüksek duyarlılık ve spesifite için iyonizasyon ve parçalanma verimi artırır ve siyalik asit kalıntılarının kararlılık artar. Glikosifingolipidler çıkarma ve kimyasal modifikasyonu, klasik bir edilebilir başlık kimyasal olarak yapılabilir, ve kütle spektrometrisi çekirdek ile gerçekleştirilebiliriyon tuzağı MS enstrümanları ile tesisleri.
Protocol
1. Lab Güvenlik Endişeleri
- Tüm organik çözücüler anlaşılır etiketleme ile belirli alanlarda saklanmalıdır. Gerekli yangın söndürücüler türleri için üretici tarafından etiket bkz.
- Kullanılan çeşitli reaktifler potansiyel kanserojendir, ve zihinsel depresyona neden olabilir. Bu reaktifler havalandırma olan bir kimyasal kaputu (spesifik reaktifler ve özellikleri için ekipman tabloya bakınız) ele alınmalıdır.
- Tavsiye edilir organik çözücüler ve hücreler, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması her zaman kullanılabilir gibi kişisel koruyucu ekipman ile çalışırken.
2. Sıçan Lösemi Hücreler Glikosifingolipidler Ekstraksiyon
- Mağaza RBL sıçan lösemi hücreleri -80 altında 16x100 mm cam tüpler içinde 8 (10000000-100,000,000) ° C koşulları. Hücreler tripan mavisi boyama sonrası hemasitometre ile sayılır. Hücre canlılığı% 95'den daha fazla olmalıdır.
- Geniş sonicat kullanılarak lipidler Özü1-2 saat karışık kutup çözücüler ile her biri için iyon dört kez. İlk ve son çözücü olarak kloroform-metanol 1:1 (v / v), 6 ml kullanımı. Izopropanol altı mililitresi: heksan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, kullanımdan önce aspirasyon ile üst faz kaldırmak) daha sonra ikinci ve üçüncü çözücü olarak da kullanılabilir. Bu çözücü karışım izopropanol ile hazırlanır: heksan: bir 55:25:20 oranında H2O, kuvvetlice titreme, ve bir üst faz çıkarılır, hangi görünmesine izin verir. Kullanım için alt evre tutun.
- Topak, çözünmeyen malzeme santrifüjleme ile sonikasyon izleyin. Süpernatantlar Sandalye. 4 saat boyunca, bir Speedvac içinde kurutun. Speedvac dışıysa ya da azot akışı döner buharlaştırıcı kullanılabilir. Buharlaşan organik çözücüler tutmak için iyi bir soğuk tuzak kullanın. Vakum pompası yağ olarak organik çözücü kirlenmesi vakum pompası verim düşer.
- Yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) kullanılarak bir ön analiz gerçekleştirin. Glikolipitler ölçmek için,% 50 sülfürik asit çözeltisi (50 ml içinde 100 mg) ve bir standart Galaktoz (100 ml stok çözelti 40 mg) içinde bir% 0.2 Orcinol hazırlanır. Reaksiyon 30 ul hacim içinde standart bir eğri (g / L 0 ile 20 g / L) olarak kullanım için bir seri seyreltmeleri hazırlayın. Her bir seyreltme serisi numune metanol ve 20 ul ekle. , Metanol 200 ul her bir glikolipid örnek çözülür sonikasyon, glikolipid ve miktar ölçümü için 20 ul kullanır. Vidalı kapaklar (Sarstedt, 72.692.005) ile 1.5 ml Eppendorf tüpleri içinde, standart eğri için hizmet Galaktoz-H 2 metanol O-çözümleri bir dizi ile, her bir numune için en az% 50 sülfürik asit çözeltisi içinde% 0.2 Orcinol 0.4 mL . 100 ısıtma bloğu içinde 5 dakika için kaynatılır ° C. Sunrise Tecan Mikroplaka Okuyucu kullanarak 440 nm'de renk reaksiyonu optik yoğunluğu okuyun. Kloroform-metanol 1:1 (v / v) ile muamele nötr yağlar için çözücü olarak H2O 60:35:8 (v / v / v) metanol: HPTLC gerçekleştirmek için, kloroform kullanır. Heksan: H2O 55:25:20 (v / v / v) olarak kullanımı izopropanolasit lipidler (gangliosides) için çözücü. İzole edilen nötr GSLs 200 ul çözücü kloroform içinde çözülmüştür: metanol 1:1 (v / v) ve Drummond Microcaps tarafından Merck silis jel ince tabaka kromatografisi plaka üzerine yüklendi. Plakalar çözücü kloroform çalıştırıldı: metanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ve kurutulur. Glikosifingolipidler 300 Orcinol-sülfürik asit tarafından görüntülendi ° C.
- DEAE A-25 Sephadex küçük bir sütun üzerinde anyon değişim kromatografisi ile nötr ile asitli lipidler dışarı asidik lipitler, fraksiyondan nötr yağlar ayırmak için, [DEAE Sephadex A25 reçine Sephadex A-25 reçine ıslatma yolu ile hazırlanabilir kloroform içinde toz: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) bir karışımı. Sephadex A25 reçine bırakılır olduğu tüm bu kadar süpernatant aspire. Reçine yıkama H2O 30:60:8 (v / v / v) metanol: kloroform taze ekleyin. Sephadex A25 reçine] gelen negatif yüklü artıkları çıkarmak için üç kez tekrarlayın.
- Eritmek, Sonikasyon (en fazla 10 dakika), ve solüsyona kloroform içinde adım 2.1 'den tekrar süspansiyon lipidler: Gerektiğinde H2O 30:60:8 (v / v / v) metanol.
- Cam yünü ve 9 kullanarak küçük bir DEAE Sephadex A25 (Cl Formu) sütun hazırlayın "Pasteur pipeti. Dikkatle böylece reçine tozu sütun geçmez cam yünü paketleyin. Etmek DEAE Sephadex A25 (Cl Formu) reçine ekle" Sütun kuru izin olmadan Pasteur pipeti "9" boyun. Eğer akıtıcı herhangi bir reçine görmüyorum emin olun. Kloroform içinde çözülmüş numuneler: metanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) eritildi. Nötral lipid Kesir yoluyla akışıdır.
- Metanol içinde sodyum asetat 8 ml ile asidik lipit fraksiyonu (reçine bağlı) Zehir. , Nötr ve asidik kesirleri hem kurulayın diyaliz bunları desalt, Speedvac onları kurutun ve HPTLC bunları analiz.
Asidik fraksiyonu 3. Adım reaksiyon için, doğrudan diyaliz edilebilir gangliosides içerir.Nötr fraksiyonu bir asetilasyon reaksiyonla çıkarılması gerekir nötr Glikosifingolipidler, ama aynı zamanda fosfolipidler (fosfatidilkolin ve sphingomyelin), sadece içerir.
Bizim tecrübelerimize göre, bir diyaliz kaset yöntemi, bir diyaliz tüp veya ters faz C18 kolon kromatografisi daha verimli ve kullanışlı.
- Bir sonraki adım bir asetilasyonu ve peracetylation reaksiyonu nötr Glikosifingolipidler fosfolipidleri çıkarılmasıdır. DEAE Sephadex 4 saat Speedvac A-25 geçişkenliğin fraksiyonu (soğutma) kurulayın. Örnekleri kuruduktan sonra, başka bir 4 saat Speedvac ve kuru içine geri koymak. Kalan suyun peracetylation reaksiyonu önlemek gibi, bu örnekler tamamen kuru olduğundan emin olun.
- 1 ml piridin ile oda sıcaklığında veya 37 ° C'da karanlık içinde asetik anhidrid ve 0,5 ml numune Peracetylate. Piridin ve asetik anhidrit Bu miktar kadar için uygun olanGlikosifingolipidler 200 ug. GSLs daha iyi bir çözünürlüğe sahiptirler olarak bu reaksiyon, 37 ° C'de gerçekleştirilebilir.
- Tam buharlaşma sağlamak için tolüen 3x (beraberce buharlaştırma) 1 ml 'de, 3 saat süre ile Speedvac ile peracetylated malzeme kurutun. Numuneleri kuruyana kadar hala Speedvac, tamamen kuru değilse.
- Florisil boncuklar kullanılarak, cam yünü ile Pasteur pipeti bir Florisil (Sigma-Aldrich) sütun (30-60 mesh, 10 × 80 mm) hazırlayın. Florisil boncuklar tamamen bir 110 ° C fırın içinde inkübasyon yoluyla, kullanımdan önce kurutulmalıdır. Yukarı boyuna Pasteur pipet içine doldurun boncuklar, ve 1,2-dikloroetan-heksan 4:1 (v / v) içinde dengeye.
Florisil sütundan Elüsyon çok hızlı. Çözücülerin hızlı kolon uçuculuk kurutma yol açabilir. Böylece bütün solvent karışımları da elüsyon sırasında kolon durdurmak mümkün değildir, çünkü kolon çalıştırmadan önce hazırlanmalıdır.
- Peracetyl Uygula1. 1,2-dikloroetan-heksan 4:1 (v / v) ml ve 1,2-dikloroetan, 10 mL, ardından aynı çözücü, 6 ml ile kolon yıkama içinde ated örnek. 1,2-dikloroetan, aseton 1:1 (v / v), 6 ml ile nötr peracetylated GSLs Zehir. Peracetylated fosfolipidler yok ederken peracetylated Glikosifingolipidler, Florisil kolon bağlamak için bu adım Glikosifingolipidler dan peracetylated fosfolipidler kaldırır.
- 2 ml 0.5 M sodyum metoksit ile 2 saat ve deacetylate için Speedvac tarafından fraksiyonlar kuru [Sigma-Aldrich, 403067], oda sıcaklığında 3 saat boyunca 2 ml metanol içinde.
- Metanolik asetik asit ve 3 ml diyaliz ile Speedvac, desalt ile [asetik asit / metanol 15/85 v / v], kuru [3 mL su içinde kurutulmuş ürün çözülür ve Slide-A-Lyzer içine enjekte ile karışım Nötrleştir Diyaliz Kaset, 24 saat boyunca suya karşı dialyze. En az iki kez su değiştirin]. Numuneler tamamen kuruyana kadar Speedvac tarafından diyalizlenmiş GSLs (su çözeltisi içinde) kurulayın.
3. Glikosifingolipidler 13 Kimyasal Modifikasyonu (Permethylation)
- Bir vidalı kapak ve Teflon astarlı bir cam tüp GSLs (1-20 mg) tanıtılması ve özel kurutma koşulları veya inert gaz atmosferinde kullanmadan dimetil sülfoksit (150 ul) ekleyin.
- Bir tokmak ile kimyasal bir havan içinde öğütülerek sodyum hidroksit partikülleri elde edilen toz sodyum hidroksit (40-60 mg) hazırlayın. Bir çok kuru ortamda tozlar depolamak ve tozlar nefes önlemek için kimyasal kaputu taşlama yapmak için dikkatli olmak emin olun.
- Sonraki bir spatula ile örnek çözeltiye sodyum hidroksit tozu ekleyin. 100 mikrolitre Halmilton şırınga ile iyodometan (80 ul) ekleyin [ya da kauçuk borudan yapılmış bir şırınga aracılığıyla bağlı pipet kalibre edilmiş bir 100 mikrolitre VWR kullanılabilmektedir] ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır.
- Su (2 mi) ile metilasyon reaksiyonu dindir. Tarafından permethylated ürün 3 kez ÖzüDiklorometan ilave (2 ml) [glikolipitler alt faz, yani üst faz yeni bir cam tüpe transfer edilebilir, ve diklorometan ile tekrar ekstre edilir ve diklorometan fazı, içindedir].
- Kombine diklorometan [, su üst faz, daha sonra atılabilir] 2 ml su ile 3 kez özü yıkayın. En son yıkama aşamasından sonra, yeni bir tüp için örnekler aktarmak ve Speedvac kullanılarak kurutun.
- Örnekler daha sonra, ESI-MS analizi için metanol 100 ila 200 ul içinde çözülebilir.
4. Permethylated Gycosphingolipids MALDI-TOF Analizi
- Bir MALDI TOF-TOF Kütle Spektrometresi (Biosystems 4700, Foster City, CA Uygulamalı) üzerine MALDI-TOF-MS ve MALDI-TOF/TOF-MS/MS deneyler yapın. 10 mg / ml dihidroksibenzoik asit (DHB) asetonitril ve su içinde% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 50 hacim arasında en az% 50 hacim karıştırma ile matris hazırlayın.
- DHB matris MALDI küçük kalkan üzerinde lekeli olabilirmetanol içinde çözülmüş örnek bir 1 ul (100 ng GSLs içeren) nokta, ardından t (1 ul) eklendi. Yavaşça uygulayın ve analizden önce kurumasını bekleyin.
5. Permethylated Glikosifingolipidler İyon Trap MS Analizi
- Bir nanoelectrospray kaynağı kullanarak doğrusal iyon tuzağı kütle spektrometre (ThermoScientific LTQ, San Jose, CA) kütle spektrometresi yürütmek, 230 0.30 dak / ul debi ° 30-50% çarpışma enerjisi ile pozitif iyon modunda C kapiler sıcaklığı. Öncül iyon bir minimal rezidüel bereket bırakmak çarpışma enerjileri ayarlayın. Sodyum adducts gibi tüm iyonlar algıla.
- Glikan parça m / z 667 ve uç disakarit 1 üzerinden sodiated moleküler iyon MS 4 ürün iyon farklı şekilleri karşılaştırarak GB3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) ve iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standartlarının izobarik bir karışım içinde iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) tespit - ene iyon m / z 445 (yaniX → 667 → 445 → X permethylated GB3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) olanlar ile ESI-LIT-MS ile saf permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) standartları MS 1) tespit moleküler iyon demektir.
Representative Results
Sıçan lösemi hücre çizgisi RBL (NKT hücreleri için glycosphingolipid antijen sunan bir antijen sağlayan hücre türü) Glikosifingolipidler bir MALDI MS analizi, bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Iyonları belirli glycosphingolipid yapılar (Şekil 3A) atanabilir. NB-DGJ 16, glycosphingolipid sentezi, her Glikosifingolipidler önemli bir azalma (Şekil 3B) gözlendi inhibe eden bir ilaç ile tedavi edilen hücreler RBL. Yapısal izomerler ayırt edilemez. Applied Biosystems 4700 MS / MS kapasitesi sınırlı yapısal bilgisi elde edilmesine izin vererek MS 2 fragmanları MS1 iyonları parçalanma izin verir. Ancak, MS2 analizi sıklıkla oligosakkarit izomerleri ayırt etmek yeterli değildir.
Glikosifingolipidler İyon tutarak MS analizleri bu tür iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) ve GB 3 (Galα olarak izomer çalışma etkinleştirirŞekil 3A tespit trihexosylceramide iyonlar halinde bulunabilirler 4Galβ4Glcβ1Cer). Farklılıkları (Şekil 4A ve 4B) bulundu kadar böyle izomerleri algılamak için, standart iGb3 ve GB3, parçalanma çok sayıda mermi ile analiz edilmiştir. Burada sunulan örnekte (Şekil 5C) iGb3 ve GB3 standart iGb3 ve GB3 karşılaştırarak tarafından ayrımcılık olabilir.
Şekil 1. Glycosphingolipid ekstraksiyon prosedürü Akış şeması ve Glikosifingolipidler (permethylation) kimyasal modifikasyonu. Glikosifingolipidler organik çözücüler hücreler elde edildi. Olmayan Glikosifingolipidler kaldırmak için, lipidler peracetylated ve deasetillenmiş olabilir. İkincisi, Glikosifingolipidler kimyasal bir permethylation reaksiyon tarafından modifiye edildi, hangi MS detectio duyarlılık ve özgüllüğünü arttırırn. Son olarak, glycosphingolipid profiller MALDI-TOF kütle spektrometrisi, iyon tuzak kütle spektrometresi kullanılarak belirlenmiştir.
Şekil 2. Orcinol sülfürik asit metodu ile Glycosphingolipid miktar tayini:% 50 sülfürik asit çözeltisi ve glikoz bir standart eğri olarak Orcinol olarak% 0.2 ile Glikosifingolipidler belirlenmesi.
Şekil 3,. Sıçan lösemi hücrelerinin Glycosphingolipidomics C. Örnek MALDI kütle spektrumu;. Her biri belirli bir iyon glycosphingolipid yapısını temsil eder, yapısal izomerler olarak ayırt edilemez B. NB-DGJ, glycosphingolipid sentez, s inhibe eden bir ilaç.ignificantly RBL hücrelerinde üretilen tüm Glikosifingolipidler azaltır.
Şekil 4. Glikosifingolipidler izomerlerinin Tandem Kütle Spektrometresi. Permethylated GSLs Gb 3 Cer ve IGB 3 Cer pozitif mod iyon tuzağı kütle spektrometresi A. Karakteristik ayrışma yolları. Gb 3 ve IGB 3 açıkça onların parçalanması desenleri ile ayrılır. Bağlantı farklılıklar izobarik m / z 445 öncüleri ile tutarlı MS 4 ürün iyonları yansıtılır. B. IGB3 arası Örnek sonuçlar iGb3/Gb3 izomerden oluşan bir karışım olarak ölçülebilir. Yıldız yalnızca iGb3 için tanısal iyonlar göstermektedir. buraya tıklayın içinbüyük bir rakam görmek.
Şekil 5,. İyon kapanı MS Glikosifingolipidler izomerlerinin analiz sağlar. A. Standart iGb3 ve iyon tuzağı LTQ kütle spektrometresi parçalanma 4 tur sonra parçalanma profili GB3 farklılık göstermektedir. IGb3 veya GB3. C. türetilen iyonların B. Karakteristik MS 4. profili Trihexosyleramides iyon tuzağı MS yöntemiyle (Dapeng Zhou tarafından Şekil) tarafından tespit edilebilir iGb3 ve GB3 izomerleri karışımları vardır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Glycome, genom ve proteom benzerlik içindeki bir terim, bir organizmanın tüm sakarit yapılarını ifade eder. Tam glikozilasyon manifoldu fonksiyonlarını kavramak hem işlevsel hem de yapısal glycomics çalışmaları da dahil olmak üzere entegre bir yaklaşım gerektirir. Hem glukanıdır biyosentezi, glukanıdır yapıların oluşabilecek karmaşıklığı ve çeşitliliği, moleküler düzeyde modülasyonlu glukanıdır ligand-reseptör etkileşimlerinde aglikon yapısının sık tutulum, ve düşük bolluk ligandların fonksiyonel önemi olmayan şablon odaklı doğa tarafından karmaşıktır.
Bu, genel olarak kütle spektrometrisi (MS), özellikle düşük bolluk ligandlar tanımlanması ve karakterize edilmesi için yapısal glycomics çalışmalar için vazgeçilmez bir yöntem olduğu genel olarak kabul edilmektedir. Moleküler türler olarak glukanlardır veya glycoconjugates gözlemlemek için genellikle elektrosprey iyonizasyon (ESI) adlı yüksek verimli, düşük enerji iyonizasyon yöntemi kullanın. Daha det içinglukanıdır yapısının karakterizasyonu ailed, bireysel moleküler türler seçmek ve küçük parçalar halinde glukanlardır kırmak için esastır. Bu, normal olarak atıl gaz molekülleri ile çarpışma sayesinde glukanlardır aktive içerir çarpışma ile endüklenen ayrışma ile yapılır. Daha fazla enerji ile bağ kırılmasının indükler, ve sonuçta elde edilen parça, sistematik analiz glikan moleküler yapısı hakkında bilgi sağlar. Genellikle, "imza" parçaları özellikle glukanıdır yapısal özellikler için tanısal olduğu oluşturulabilir. Birlikte moleküler kütle ile, aşağıdaki yapı parçaları yeni olup, özellikle de bazen glukanlardır tanımlamak için yeterli olabilir, ancak son olarak çok daha fazla bilgi tam olarak karakterize etmek için gerekli olmuştur. Bu yöntemler, şeker bileşim analizi, bağlantı analizi için kısmen metillenmiş alditol asetat arasında gaz kromatografi analizi kütle spektrometrisi, ve spesifik glycosidase sindirim 17 içerir.
18-19 gösterildiği gibi, etkili bir şekilde (IT-MS), bir iyon tuzak kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir düşük enerji parçalanma, birden fazla yuvarlak, çok glikan kütle spektral analizi ile bilgi verimi artırır . Parçalanma (diğer MS araçları ile yapılabilir edilemeyen) dört ya da beş tur ile, bu aynı olan bileşenleri karışımı içinde bir arada mevcut olsa bile, farklı bir şeker bağlar düzenlenmiş aynı şeker bileşenleri içeren izomerik glukanlardır ayırt etmek mümkündür molekül kütlesi (İzobarları). Bu analiz için, glukanlardır permethylation kullanılarak metil grupları ile tüm serbest hidroksil gruplarının yerine, türevlendirilmiş edildi. Glukanlardır yapısal atama permethylation olmadan mümkün olsa da, permethylation duyarlılık 17 artar.
Levery ve Zhou, izomerik stru tespiti de dahil olmak üzere BT-MS yöntemi potansiyel tüm avantajlarını, birleştirdikBirden çok izobarik karışımları 7-9 şeklinde mevcut Glikosifingolipidler son derece hassas kimlik ve miktarının belirlenmesi için MS 4 ve 5 MS spektrumları olarak gözlenebilir imza teşhis iyonları kullanılarak ctures. Teoride, biz kimyasal sentez edilebilir standart glikolipidlerin durumu bekleyen, mevcut her glikolipid yapısını tespit etmek mümkün olabilir.
Bu analizin kritik adımlar biyolojik örneklerden GSLs iyileşme oranı vardır. GSL Tipik olarak 80 ug örneğin RBL olarak 100 milyon tümör hücrelerinden elde edilebilir. Iyon tuzağı Massenspektrometer parçalanma çok sayıda mermi için yeterli molekül iyonları üretmek için, tümör GSLs en az 10 mikrogram gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs Düşük verim daha da parçalanma tabi olamazdı iyonlar, düşük bolluk yol açacaktır. Analiz başarı elde edilmiştir GSLs miktarına bağlıdır. Tipik olarak, son konspermethylated GSLs ve entration bir nano-elektrosprey kaynak üzerinde analiz edilmeden önce, metanol içinde çözülmüş 1 mg / ml, ulaşması gerekir. Ayrıntılı bir MS n analizi için sınır MS 1 profilindeki spesifik iyon bolluğu bağlıdır. Tipik bir e 7 iyon bolluğu tam bir MS 5 analizi için gereklidir. Saflaştırma sırasında GSLs ve düşük verim başına asetillenmiş GSLs, Florisil reçine kromatografi kolonuna bağlı yıkanmış, ve daha sonra akıtılan olmalıdır peracetylation aşaması esnasında GSLs kaybı (fosfolipid kaldırılır) neden olabilir. Silis jel ile per-asetillenmiş GSLs bir bağlayıcı sağlamak için, numune içinden akan sonra sütun kromatografi ile iki kere yeniden olmalıdır.
Disclosures
DZ Biotex, Houston, Teksas, ve yayınlanan bu makalede açıklanan teknolojileri ile ilgili patent, ya da uygulama dahil bir mucit için danışmanlık yapmaktadır.
Acknowledgments
DZ MD Anderson Kanser Merkezi ve NIH hibe AI079232 tarafından desteklenmektedir. MD Anderson Kanser Merkezi NIH hibe CA16672 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 Dichlor–thane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12x75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
- Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. Fundamental Immunology. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
- Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide. J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).
- Zhou, D.
- Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells. Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).
- Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy. Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).
- Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus. J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).
- Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).
- Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry. Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).
- Hakomori, S. I. A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).
- Ciucanu, I., Kerek, F. Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis. Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Levery, S. B., Hakomori, S. Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring. Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).
- Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes. J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).
- Ciucanu, I., Costello, C. E. Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates. J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).
- Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing. J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. Essentials of Glycobiology. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library. Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).
