Summary
एक विशिष्ट और संवेदनशील प्रतिरक्षा अंगों और कोशिकाओं में glycosphingolipid प्रतिजनों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक विधि का वर्णन है. विधि आयन जाल मास रासायनिक संश्लेषित मानकों की तुलना में कदम वार संरचनात्मक विश्लेषण के लिए glycosphingolipid अणुओं के विखंडन की अनुमति स्पेक्ट्रोमेट्री का लाभ लेता है.
Protocol
1. लैब सुरक्षा चिंताएं
- सभी कार्बनिक सॉल्वैंट्स स्पष्ट लेबलिंग के साथ विशिष्ट क्षेत्रों में संग्रहित किया जाना चाहिए. आग extinguishers के प्रकार के लिए विनिर्माण लेबल देखें.
- कई इस्तेमाल किया अभिकर्मकों संभावित कासीनजन हैं, और मानसिक अवसाद का कारण हो सकता है. इन अभिकर्मकों वेंटिलेशन के साथ एक रासायनिक हुड (विशिष्ट अभिकर्मकों और विशेष के लिए उपकरणों की तालिका देखें) में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
- यह अनुशंसा की जाती है कि जब कार्बनिक सॉल्वैंट्स और कोशिकाओं, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और आंखों की सुरक्षा के सभी समय पर उपयोग के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ काम कर रहा है.
2. Glycosphingolipids की चूहा लेकिमिया कोशिकाओं से निकासी
- स्टोर RBL चूहे लेकिमिया 16x100 मिमी ग्लास ट्यूब में (10 मिलियन से 100 मिलियन) -80 के तहत 8 कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस शर्तों. कोशिकाओं के बाद trypan नीले धुंधला hemocytometer से गिना जाता है. कोशिकाओं की व्यवहार्यता 95% से अधिक होना चाहिए.
- व्यापक sonicat का उपयोग कर lipids निकालेंआयन 1-2 घंटा मिश्रित polarity सॉल्वैंट्स के साथ प्रत्येक के लिए चार बार. क्लोरोफॉर्म मेथनॉल के रूप में पहली और आखिरी विलायक 01:01 (v / v) के 6 मिलीग्राम का उपयोग करें. Isopropanol के छह milliliter: hexane: एच 2 हे 55:25:20 (v / वी / वी, का उपयोग करने से पहले आकांक्षा से ऊपरी चरण को निकालने के लिए) तो दूसरे और तीसरे विलायक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विलायक मिश्रण isopropanol द्वारा तैयार किया जाता है: hexane: एच 2 हे एक 55:25:20 के अनुपात में, यह तेजी से मिलाते हुए, और एक ऊपरी चरण दिखाई देते हैं, जो हटाया जाएगा अनुमति देता है. उपयोग के लिए कम चरण रखें.
- अघुलनशील सामग्री गोली centrifugation साथ sonication का पालन करें. Supernatants पूल. उन्हें 4 घंटे के लिए एक Speedvac में सूखी. नाइट्रोजन धारा या रोटरी बाष्पीकरण अगर Speedvac अनुपलब्ध है इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अच्छा ठंडी सुखाया कार्बनिक सॉल्वैंट्स पकड़ जाल का उपयोग करें. कार्बनिक विलायक के वैक्यूम पंप तेल में संदूषण वैक्यूम पंप की क्षमता नीचा दिखाना होगा.
- एक प्रारंभिक उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (HPTLC) का उपयोग करते हुए विश्लेषण प्रदर्शन. Glycolipids मात्रा ठहराना50% सल्फ्यूरिक एसिड (50 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम) समाधान और एक गैलेक्टोज मानक (100 मिलीग्राम स्टॉक समाधान में 40 मिलीग्राम) में 0.2% Orcinol तैयार करने के लिए,. 30 μl प्रतिक्रिया मात्रा में dilutions मानक वक्र (शून्य से छ / एल 20 ग्राम / एल) के रूप में उपयोग करने की एक श्रृंखला तैयार. प्रत्येक कमजोर पड़ने श्रृंखला नमूना मेथनॉल की 20 μl जोड़ें. मेथनॉल की 200 μl में प्रत्येक glycolipid नमूना भंग, sonicate, और 20 μl glycolipid मात्रा माप के लिए उपयोग. खराब कर दिया है टोपियां (Sarstedt, 72.692.005) के साथ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में गैलेक्टोज एच 2 हे मेथनॉल समाधान है जो मानक वक्र के लिए सेवा की एक श्रृंखला के साथ 0.2 Orcinol% 50% सल्फ्यूरिक एसिड समाधान में प्रत्येक नमूने के 0.4 मिलीलीटर, जोड़ने . 100 हीटिंग ब्लॉक में 5 मिनट के लिए उबाल लें ° सी. सूर्योदय Tecan Microplate रीडर का उपयोग कर 440 एनएम पर रंग प्रतिक्रिया के ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें. तटस्थ lipids 01:01 क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (v / v) के साथ इलाज के लिए विलायक के रूप में एच 2 हे 60:35:8 (v / v / v): मेथनॉल: HPTLC प्रदर्शन, क्लोरोफॉर्म का उपयोग करें. Hexane: एच 2 हे 55:25:20 (v / v / v) के रूप में isopropanol का उपयोग करेंएसिड लिपिड (gangliosides) के लिए विलायक. पृथक तटस्थ GSLs 200 μl विलायक क्लोरोफॉर्म में भंग कर दिया गया था: मेथनॉल 01:01 (v / v) और Drummond Microcaps द्वारा मर्क सिलिका जेल पतली परत क्रोमैटोग्राफी प्लेट पर लोड है. प्लेटें विलायक क्लोरोफॉर्म में चलाए जा रहे थे: मेथनॉल: एच 2 हे (v / v / v) 60:35:8 और सूखे. glycosphingolipids 300 Orcinol सल्फ्यूरिक एसिड से देखे थे डिग्री सेल्सियस
- आदेश में अलग करने के लिए बाहर का DEAE A-25 Sephadex एक छोटे से कॉलम पर तटस्थ और अम्लीय आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा lipids अम्लीय, lipids अंश से तटस्थ lipids [DEAE Sephadex A25 राल A-25 Sephadex राल भिगोने के द्वारा तैयार किया जा सकता है क्लोरोफॉर्म में पाउडर: मेथनॉल: एच 2 ओ 30:60:8 (v / v / v) रातोंरात. तैरनेवाला Aspirate जब तक Sephadex A25 राल सब छोड़ दिया है है. मेथनॉल: ताजा क्लोरोफॉर्म जोड़ें एच 2 हे 30:60:8 (v / v / v) राल धोने. Sephadex A25 राल] से नकारात्मक चार्ज करने के अवशेषों को हटाने के लिए तीन बार दोहराएँ.
- भंग, Sonicate (कोई 10 से अधिक मिनट के लिए), और क्लोरोफॉर्म में 2.1 कदम से resuspend lipids: मेथनॉल: एच 2 हे 30:60:8 (v / v / v) जब जरूरत.
- कांच ऊन और एक 9 का उपयोग करके एक छोटे DEAE A25 Sephadex (Cl प्रपत्र) स्तंभ तैयार हैं "पाश्चर विंदुक कांच ऊन पैक ध्यान इतना है कि राल पाउडर स्तंभ के माध्यम से पारित नहीं है.. DEAE A25 Sephadex (Cl प्रपत्र) राल जोड़ें" गर्दन स्तंभ सूखी दे बिना पाश्चर विंदुक "9 के". यह सुनिश्चित करें कि आप किसी भी राल eluent में नहीं दिख रहा है. क्लोरोफॉर्म में भंग नमूने: मेथनॉल: एच 2 हे 30:60:8 (v / v / v) को भंग किया गया. तटस्थ लिपिड अंश अंश माध्यम से प्रवाह है.
- मेथनॉल में सोडियम एसीटेट की 8 मिलीग्राम के साथ अम्लीय लिपिड अंश (रेजिन बाध्य) Elute. दोनों तटस्थ और अम्लीय fractions सूखी, उन्हें डायलिसिस द्वारा फीका बनाना, उन्हें Speedvac द्वारा सूखे और उन्हें HPTLC द्वारा विश्लेषण.
अम्लीय अंश gangliosides, जो चरण 3 प्रतिक्रिया सीधे के लिए dialyzed जा सकता है.तटस्थ अंश न केवल glycosphingolipids तटस्थ, लेकिन यह भी phospholipids (phosphatidylcholine और sphingomyelin), जो एक एसिटिलीकरण प्रतिक्रिया द्वारा हटा दिया जाना चाहिए.
हमारे अनुभव में, डायलिसिस कैसेट की विधि, एक डायलिसिस ट्यूब या रिवर्स चरण C18 कॉलम क्रोमैटोग्राफी से अधिक कुशल और सुविधाजनक है.
- अगले कदम एक एसिटिलीकरण और peracetylation प्रतिक्रिया से तटस्थ glycosphingolipids से phospholipids के हटाने है. सूखी DEAE A-25 माध्यम से गुजरती Speedvac में 4 घंटे के लिए ठंडा करने के साथ अंश Sephadex. नमूनों के बाद सूख रहे हैं, उन्हें वापस रख एक और 4 घंटा लिए Speedvac और शुष्क में. सुनिश्चित करें कि इन नमूनों को पूरी तरह से सूख रहे हैं, के रूप में किसी भी अवशिष्ट पानी peracetylation प्रतिक्रिया को रोकने जाएगा.
- Pyridine के 1 मिलीग्राम और कमरे के तापमान या 37 ° रातोंरात सी में अंधेरे में एसिटिक एनहाइड्राइड के 0.5 मिलीलीटर के साथ नमूने Peracetylate. Pyridine और एसिटिक एनहाइड्राइड की यह राशि के लिए उचित हैglycosphingolipids की 200 ग्राम. इस प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जा सकता है, रूप में GSLs विलेयता बेहतर है.
- , टोल्यूनि 3x (coevaporation) के 1 मिलीलीटर के अलावा पूरा वाष्पीकरण को सुनिश्चित करने के साथ, 3 घंटा लिए Speedvac द्वारा peracetylated सामग्री सूखी. अगर नमूने सूखे तक अभी भी नहीं कर रहे हैं पूरी तरह से सूखा है, Speedvac.
- एक पाश्चर विंदुक में कांच ऊन के साथ एक Florisil (सिग्मा Aldrich) स्तंभ (30-60 जाल, 10 × 80 मिमी), तैयार Florisil मनकों का उपयोग कर. Florisil मोती का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से सूख जाना चाहिए, एक 110 ° C ओवन में ऊष्मायन. पाश्चर विंदुक में मोती गर्दन को, भरें और 04:01 1,2 dichloroethane hexane (v / v) में संतुलन में लाना.
Florisil स्तंभ से क्षालन बहुत तेज है. सॉल्वैंट्स का रैपिड अस्थिरता स्तंभ सुखाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस प्रकार सभी मिश्रण विलायक स्तंभ चल रहा है क्योंकि यह संभव क्षालन दौरान स्तंभ रोक नहीं है पहले तैयार किया जाना चाहिए.
- Peracetyl लागू04:01 1,2 dichloroethane hexane (v / v) की 1 मिलीग्राम, और एक ही विलायक, 1,2 - dichloroethane की 10 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया 6 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धोने में पैदा नमूना. 1,2 dichloroethane - एसीटोन 01:01 (v / v) के 6 मिलीलीटर के साथ तटस्थ peracetylated GSLs Elute. यह कदम glycosphingolipids से peracetylated phospholipids हटा, क्योंकि peracetylated glycosphingolipids Florisil स्तंभ के लिए बाध्य नहीं है, जबकि कर peracetylated phospholipids.
- 2 और 2 मिलीलीटर 0.5 एम सोडियम methoxide साथ घंटा deacetylate के लिए Speedvac द्वारा fractions सूखी [सिग्मा Aldrich, 403067] मेथनॉल के कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर में.
- 3 methanolic एसिटिक एसिड के मिलीग्राम [एसिटिक एसिड / मेथनॉल 15/85 वी / वी], डायलिसिस से सूखी Speedvac, फीका बनाना द्वारा [पानी के 3 मिलीलीटर में सूखे उत्पादों भंग, और स्लाइड - Lyzer में सुई के साथ मिश्रण बेअसर डायलिसिस कैसेट्स, 24 घंटे के लिए पानी के खिलाफ dialyze. पानी कम से कम दो बार बदलें]. सूखी द्वारा dialyzed GSLs Speedvac (पानी के घोल में) जब तक नमूने पूरी तरह से सूख रहे हैं.
3. 13 Glycosphingolipids कैमिकल संशोधन (Permethylation)
- (1-20 ग्राम) GSLs एक पेंच टोपी और Teflon लाइनर के साथ एक ग्लास ट्यूब, परिचय और सुखाने विशेष परिस्थितियों या अक्रिय गैस वातावरण का उपयोग कर के बिना डाइमिथाइल sulfoxide (150 μl) जोड़ने.
- सोडियम हाइड्रोक्साइड कणों से उन्हें एक पैर के साथ एक रासायनिक मोर्टार में पीस द्वारा तैयार पाउडर सोडियम हाइड्रोक्साइड (40-60 मिलीग्राम). सुनिश्चित करें कि एक बहुत शुष्क वातावरण में पाउडर की दुकान और रासायनिक हुड में पीस कर साँस लेने में पाउडर से बचने के लिए सावधान रहना.
- अगले एक रंग के साथ नमूना समाधान के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड पाउडर जोड़ने. एक 100 microliter Halmilton सिरिंज, के साथ iodomethane (80 μl) जोड़ें [या 100 microliter विंदुक calibrated VWR रबर टयूबिंग के माध्यम से एक सिरिंज जुड़े इस्तेमाल किया जा सकता है], और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिश्रण हिला.
- पानी (2 मिलीलीटर) के साथ मेथिलिकरण प्रतिक्रिया बुझाने. के द्वारा permethylated 3 बार उत्पादों निकालेंके अलावा dichloromethane (2 मिलीलीटर) [glycolipids dichloromethane चरण है, जो कम चरण में है, तो ऊपरी चरण एक नया ग्लास ट्यूब के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, और फिर dichloromethane साथ निकाले हैं.
- धो संयुक्त dichloromethane 2 मिलीलीटर पानी के साथ 3 बार निकालता [ऊपरी चरण है, जो पानी है, तो का निपटारा किया जा सकता है]. अंतिम धोने के बाद, एक नया ट्यूब नमूने हस्तांतरण, और Speedvac का उपयोग कर सूखी.
- नमूने तो ईएसआई एमएस विश्लेषण के लिए 100 से 200 मेथनॉल के μl में भंग किया जा सकता है.
4. MALDI-TOF Permethylated Gycosphingolipids का विश्लेषण
- एक MALDI TOF-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर (एप्लाईड Biosystems 4700, फोस्टर शहर, सीए) पर MALDI-TOF एमएस और MALDI-TOF/TOF-MS/MS प्रयोग करते हैं. मैट्रिक्स को 10 मिलीग्राम / एमएल dihydroxybenzoic एसिड (DHB) और acetonitrile में और 0.1% पानी में trifluoroacetic एसिड (TFA) की मात्रा 50% की मात्रा 50% मिश्रण से तैयार है.
- DHB मैट्रिक्स MALDI targe पर देखा जा सकता हैटी (1 μl), एक 1 (100 एनजी GSLs युक्त) नमूने के μl स्थान मेथनॉल में भंग बाद. धीरे धीरे लागू करते हैं और यह विश्लेषण करने से पहले सूखे के लिए अनुमति देते हैं.
5. आयन जाल एमएस विश्लेषण Permethylated Glycosphingolipids
- बाहर एक रैखिक आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर (LTQ, ThermoScientific, सैन जोस, CA) एक nanoelectrospray स्रोत का उपयोग कर पर कैर्री मास स्पेक्ट्रोमेट्री, 0.30 / μl मिनट 230 में प्रवाह की दर ° C 30-50% टक्कर ऊर्जा के साथ सकारात्मक आयन मोड में केशिका तापमान. टक्कर ऊर्जा सेट अग्रदूत आयन की एक न्यूनतम अवशिष्ट बहुतायत छोड़. सोडियम adducts के रूप में सभी आयनों का पता लगाने.
- Glycan टुकड़ा 667 मी / z और टर्मिनल 1 disaccharide के माध्यम sodiated आणविक आयन से एमएस 4 उत्पाद आयनों के विभिन्न पैटर्न की तुलना में iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) Gb3 और iGb3 मानकों (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) के एक समदाब रेखीय मिश्रण पहचानें ene आयन मीटर / z 445 (यानी→ 445 एक्स 667 → →, एक्स आणविक ईएसआई एल-एमएस के माध्यम से शुद्ध permethylated iGb3 मानकों (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) की 1) एमएस में permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) उन लोगों के साथ पता लगाया आयन का मतलब है.
Representative Results
चूहा लेकिमिया सेल लाइन RBL (एक प्रतिजन कोशिका प्रकार है कि NKT कोशिकाओं glycosphingolipid प्रतिजनों प्रस्तुत) से glycosphingolipids MALDI एमएस विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 3 में दिखाया गया है. आयनों विशिष्ट glycosphingolipid संरचनाओं (चित्रा 3 ए) को सौंपा जा सकता है. RBL 16 नो बॉल DGJ, एक दवा है जो glycosphingolipid संश्लेषण, सभी glycosphingolipids की महत्वपूर्ण कमी (3B चित्रा) मनाया गया रोकता द्वारा इलाज किया कोशिकाओं में. स्ट्रक्चरल isomers प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता. एप्लाइड Biosystems 4700 की क्षमता एमएस / एमएस एमएस 2 टुकड़े MS1 आयनों के विखंडन की अनुमति देता है, सीमित संरचनात्मक जानकारी उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, MS2 विश्लेषण अक्सर भेदभाव oligosaccharide isomers के लिए पर्याप्त नहीं है.
आयन जाल glycosphingolipids एमएस विश्लेषण isomers का (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) iGb3 और Gb3 (Galα के रूप में अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है) 4Galβ4Glcβ1Cer जो चित्रा 3A में पाया trihexosylceramide आयनों के रूप में मौजूद हो सकता है. ऐसी isomers का पता लगाने के लिए, मानक iGb3 और Gb3 विखंडन के कई दौर से विश्लेषण किया गया है, जब तक मतभेद (4A चित्रा और 4B) पाया गया. यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में (चित्रा 5C) iGb3 और Gb3 मानक iGb3 और Gb3 तुलना द्वारा भेदभाव किया जा सकता है.
चित्रा 1. फ्लो चार्ट, glycosphingolipid निष्कर्षण प्रक्रिया के और (permethylation) glycosphingolipids की रासायनिक संशोधन Glycosphingolipids. कोशिकाओं से कार्बनिक सॉल्वैंट्स द्वारा निकाले गए थे. गैर glycosphingolipids को दूर करने के लिए, lipids peracetylated और deacetylated हो सकता है. दूसरा, glycosphingolipids रासायनिक एक permethylation प्रतिक्रिया से संशोधित किया गया है, जो और एमएस detectio की संवेदनशीलता और विशिष्टता में सुधारn. अंत में, glycosphingolipid प्रोफाइल MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर निर्धारित किया गया है.
चित्रा 2. सल्फ्यूरिक एसिड विधि द्वारा Orcinol Glycosphingolipid मात्रा: 50% सल्फ्यूरिक एसिड समाधान और एक ग्लूकोज मानक वक्र में एक 0.2% Orcinol का उपयोग glycosphingolipids की मात्रा.
चित्रा 3. चूहे की कोशिकाओं लेकिमिया ए प्रतिनिधि MALDI जन स्पेक्ट्रम Glycosphingolipidomics. प्रत्येक आयन एक विशिष्ट glycosphingolipid संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, संरचनात्मक isomers नहीं किया जा प्रतिष्ठित बी नो बॉल DGJ, एक दवा है है कि glycosphingolipid संश्लेषण, रोकताignificantly RBL कोशिकाओं में उत्पादित glycosphingolipids कम कर देता है.
4 के बाहर चित्रा. Glycosphingolipids के isomers अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री. सकारात्मक मोड Gb permethylated 3 Cer और IGB 3 Cer GSLs आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए विशेषता अपघटन रास्ते. 3 GB और igb 3 स्पष्ट रूप से उनके विखंडन पैटर्न से अलग हो रहे हैं. संबंध में मतभेद एमएस 4 उत्पाद समदाब रेखीय मी / z 445 व्यापारियों के साथ लगातार आयनों में परिलक्षित होते हैं बी. प्रतिनिधि iGB3 परिणाम दिखा iGb3/Gb3 isomers का एक मिश्रण में मापा जा सकता है. सितारे केवल iGb3 लिए नैदानिक आयनों का संकेत मिलता है. लिए यहाँ क्लिक करेंबड़ा आंकड़ा देखें.
चित्रा 5. आयन जाल एमएस glycosphingolipids के isomers के विश्लेषण की अनुमति देता है ए मानक iGb3 और विखंडन प्रोफ़ाइल के विखंडन के दौर के बाद एक आयन जाल LTQ मास स्पेक्ट्रोमीटर में 4 Gb3 शो अंतर. बी से व्युत्पन्न iGb3 या Gb3 सी. आयनों की विशेषता एमएस 4 प्रोफ़ाइल Trihexosyleramides iGb3 और Gb3 isomers का मिश्रण है जो आयन जाल एमएस विधि (Dapeng झोउ द्वारा चित्रा) से पहचाना जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
glycome, एक जीनोम और proteome सादृश्य में गढ़ा शब्द, एक जीव की सभी सैकराइड संरचनाओं के लिए संदर्भित करता है. ग्लाइकोसिलेशन के कई गुना कार्य करने के लिए पूरी तरह से समझ दोनों कार्यात्मक और संरचनात्मक Glycomics अध्ययन सहित एक एकीकृत दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी. दोनों गैर टेम्पलेट glycan biosynthesis, जिसके परिणामस्वरूप और glycan संरचनाओं की जटिलता और विविधता, आणविक स्तर पर modulating glycan ligand-रिसेप्टर बातचीत में aglycone संरचना के लगातार भागीदारी, और कम बहुतायत ligands के कार्यात्मक महत्व की प्रकृति द्वारा संचालित जटिल हैं.
यह आम तौर पर स्वीकार किया है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की पहचान और निस्र्पक कम बहुतायत ligands के लिए विशेष रूप से संरचनात्मक Glycomics अध्ययन, के लिए एक अनिवार्य विधि है. आणविक प्रजाति के रूप में या glycans glycoconjugates का पालन करने के लिए, हम अक्सर एक अत्यंत कुशल, कम ऊर्जा ionization विधि, electrospray ionization (ईएसआई) कहा जाता है का उपयोग करें. अधिक det के लिएglycan संरचना के लक्षण वर्णन ailed, यह जरूरी है कि व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों का चयन करें और छोटे टुकड़ों में glycans को तोड़ने. यह आम तौर पर टक्कर प्रेरित हदबंदी जो अक्रिय गैस अणुओं के साथ टकराव के माध्यम से glycans को सक्रिय शामिल किया जाता है. वृद्धि हुई ऊर्जा बंधन टूटना लाती है, और परिणामस्वरूप टुकड़े के व्यवस्थित विश्लेषण glycan के आणविक संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है. अक्सर, "हस्ताक्षर" टुकड़े उत्पन्न हो सकता है कि विशेष glycan ढांचागत सुविधाओं के लिए निदान कर सकते हैं. आणविक जन के साथ साथ, इन टुकड़ों को कभी कभी glycans की पहचान करने के लिए पर्याप्त हो सकते हैं, लेकिन अतीत में बहुत अधिक जानकारी के लिए पूरी तरह से उन्हें चिह्नित की आवश्यकता है, खासकर अगर संरचना उपन्यास है. इन विधियों चीनी रचना विश्लेषण, गैस संबंध विश्लेषण के लिए आंशिक रूप से methylated alditol एसीटेट का क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, और विशिष्ट glycosidase 17 पाचन शामिल हैं.
18-19 दशक से अधिक प्रदर्शन, कम ऊर्जा विखंडन, जो एक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर में प्रभावी ढंग से किया जा सकता है बाहर किया जाता है (आईटी - एमएस) के कई दौर, बहुत glycan जन वर्णक्रमीय विश्लेषण से जानकारी उपज में सुधार . विखंडन (जो अन्य एमएस उपकरणों के साथ नहीं किया जा सकता है) के चार या पांच दौर के साथ, यह संभव है कि एक ही चीनी विभिन्न चीनी लिंकेज में व्यवस्थित घटक होते समाजिक glycans भेद, तब भी जब इन वर्तमान के साथ उसी के साथ घटकों के मिश्रण में हैं आणविक द्रव्यमान (isobars). इस विश्लेषण के लिए, glycans derivatized थे, मिथाइल permethylation समूहों के साथ सभी मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों की जगह. Glycans की संरचनात्मक काम permethylation के बिना संभव है, permethylation 17 संवेदनशीलता बढ़ जाती है.
Levery और झोउ, आईटी एमएस पद्धति के संभावित लाभ के सभी समाजिक stru का पता लगाने सहित, संयुक्तबेहद संवेदनशील और कई समदाब रेखीय 7-9 मिश्रण के रूप में मौजूद glycosphingolipids के पहचान quantitation के लिए हस्ताक्षर नैदानिक आयनों, केवल 4 एमएस और एमएस 5 स्पेक्ट्रा में नमूदार है, का उपयोग ctures. सिद्धांत रूप में, हम करने के लिए हर मौजूदा glycolipid संरचना की पहचान करने में सक्षम मानक glycolipids, जो रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है की उपलब्धता लंबित है, हो सकता है.
इस विश्लेषण के महत्वपूर्ण कदम जैविक नमूनों से GSLs के वसूली दर हैं. जीएसएल का आमतौर पर 80 ग्राम RBL के रूप में 100 लाख ट्यूमर कोशिकाओं से बरामद किया जा सकता है. आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर में विखंडन के कई दौर के लिए पर्याप्त आणविक आयनों उत्पन्न, ट्यूमर GSLs के कम से कम 10 माइक्रोग्राम आवश्यक हैं. शुद्धि दौरान GSLs की कम उपज आयनों, जो आगे विखंडन के अधीन नहीं किया जा सकता है की कम बहुतायत के लिए नेतृत्व करेंगे. विश्लेषण की सफलता GSLs जो बरामद कर रहे हैं की मात्रा पर निर्भर करता है. आमतौर पर, अंतिम सान्द्रpermethylated GSLs की entration पहले एक नैनो electrospray स्रोत पर विश्लेषण किया जा रहा है 1 मिलीग्राम / एमएल मेथनॉल में भंग, पहुँचना चाहिए. एक पूरी तरह से एमएस n विश्लेषण के लिए सीमा एमएस 1 प्रोफाइल में विशिष्ट आयन की बहुतायत पर निर्भर है. एक ठेठ ई 7 आयन बहुतायत एक पूरी तरह से एमएस 5 विश्लेषण के लिए आवश्यक है. शुद्धि दौरान GSLs की कम उपज चरण के दौरान peracetylation नुकसान GSLs (जो phospholipids हटा), जब प्रति acetylated GSLs Florisil राल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के लिए बाध्य किया जाना चाहिए, धोया, और बाद में eluted के कारण हो सकता है. प्रति acetylated GSLs के सिलिका जेल बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए, नमूने क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में दो बार करना चाहिए के माध्यम से बहने के बाद पुनः लोड.
Disclosures
DZ BioTex, ह्यूस्टन, TX, और इस अनुच्छेद में वर्णित प्रौद्योगिकियों से संबंधित पेटेंट जारी या आवेदन में शामिल एक आविष्कारक के लिए एक सलाहकार है.
Acknowledgments
DZ एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र और NIH अनुदान AI079232 द्वारा समर्थित है. एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र के हिस्से में NIH अनुदान CA16672 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 Dichlor–thane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12x75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
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