Summary
면역 기관과 세포의 glycosphingolipid 항원의 표현 프로필에 대한 통찰력을 얻을 수있는 구체적이고 민감한 방법을 설명합니다. 방법은 화학적으로 합성 표준에 비해 구조 분석을위한 glycosphingolipid 분자의 단계 - 현명한 조각을 허용 이온 트랩 질량 분광법을 활용합니다.
Abstract
Glycosphingolipids (GSL의)는 이러한 배아 개발, 신호 전달, 그리고 면역 수용체 인식 1-2로 크게 생물학적 과정에 대한 구조적 정보를 부담 biomacromolecules의 glycoconjugate 클래스에 속한다. 그들은 복잡한 isomers의 형태로 설탕 moieties 및 지방산 아실 체인 길이, unsaturation, 그리고 hydroxylation 등의 형태 지질 moieties가 포함되어 있습니다. 탄수화물과 ceramide 부분은 모두 생물학적 중요성을 기준으로 할 수 있습니다. 예를 들어, 트라이 - hexosylceramides는 globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer)과 동일한 분자 질량 만 3-4 완전히 다른 생물학적 기능에 대한 책임 탄수화물 잔기의 고유 한 설탕 연계가 isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)를 포함합니다. 또 다른 예에서, 그것은 입증 된 알파 - galactosylceramide, invari에 대한 강력한 작용제의 리간드의 ceramide 부분의 수정개미 NKT 세포, 암 및 면역 질환 5 동물 모델의 변화의 시토 킨 분비 프로필 및 기능을. 면역 기관의 isomers와 세포의 구조 분석을 수행의 어려움은 많은 생물학적 기능주세요 6을 결정하기위한 장벽 역할을합니다.
여기, 우리는 7-9 면역 세포의 glycosphingolipid 프로파일을 상대적으로 간단하고 빠른, 그리고 민감한 분석 방법의 시각화 버전을 제시한다. 이 방법은 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화하여 이후의 분석에 이어 glycosphingolipids 10-15의 추출 및 화학적 수정 (permethylation가 그림 5A 아래 참조 hexose의 OH 그룹이 permethylation 반응 후 MeO로 대체 된) 시간을 기준으로 의 기내 질량 분광법 (MALDI-TOF/MS)와 이온 트랩 질량 분광법. 이 방법은 완전한 분석을위한 50,000,000 면역 세포가 필요합니다. 실험은 일주일 이내에 완료 할 수 있습니다. 다양한 glycosphingolipids의 상대 풍부은 합성 표준 비교로 구분 할 수 있습니다. 총 iGb3/Gb3 혼합물의 두 fmol 9 존재할 때이 방법은, Gb3 isomers 중 1퍼센트에게 iGb3을 측정 감도를 갖추고 있습니다.
이온 트랩 질량 분광법은 isomers를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 동일한 샘플에서 globotriaosylceramide과 isoglobtriaosylceramide의 존재를 분석하고, 하나는 구조적으로 두 (그림 5 아래 참조) 사이에 차별을 glycosphingolipid 분자의 조각을 사용할 수 있습니다. 또한, 설탕 moieties의 화학 수정은 (permethylation 반응을 통해) 높은 감도 및 특이성에 대한 이온화 및 조각화 효율성을 향상하고, sialic 산성 잔류의 안정성을 증가시킵니다. glycosphingolipids의 추출 및 화학적 수정은 고전 인증 화학 후드에서 수행 할 수 있으며, 질량 분광법은 코어에 의해 수행 될 수이온 트랩 MS 장비와 시설을 갖추고 있습니다.
Protocol
1. 연구실 안전 우려
- 모든 유기 용제는 일반 라벨과 특정 영역에 저장해야합니다. 필요한 소화기의 종류에 대해 제조하여 라벨을 참조하십시오.
- 사용 여러 시약은 잠재적으로 발암 있으며, 정신 우울증의 원인이 될 수 있습니다. 이 시약은 통풍과 화학 후드 (특정 시약 및 구체적인 내용에 대한 장비의 표를 참조)에서 처리해야합니다.
- 그것은 권장되는 유기 용제 및 세포 등 장갑, 실험실 코트와 눈 보호 항상 활용할 수 같은 개인 보호 장비와 작업 할 때.
2. 쥐 백혈병 세포에서 Glycosphingolipids의 추출
- 스토어 RBL의 쥐 백혈병 세포 -80 이하 16x100 mm 유리 튜브 8 (10000000-100000000) ° C 조건. 세포는 trypan 블루 염색 후 hemocytometer에 의해 계산됩니다. 세포의 생존은 95 % 이상 높은해야합니다.
- 광범위한 sonicat를 사용하여 지질의 압축을 풉니 다1-2 시간 혼합 극성 용매와 각 이온은 네 번. 처음이자 마지막 용매로 클로로포름 - 메탄올 1시 1분 (V / V) 6 ML을 사용합니다. 이소프로판올의 여섯 밀리리터 : 헥산 : H 2 O 55:25:20 (V / V / V, 사용하기 전에 흡인하여 위의 단계를 제거)은 다음 두 번째 및 세 번째 용매로 사용하실 수 있습니다. 이 용매는 혼합 이소프로판올에 의해 준비가되어 있습니다 : 헥산 : 55:25:20 비율로 H 2 O, 힘차게 흔들어, 그리고 상부 단계는 제거 될, 표시 할 수 있도록합니다. 사용을위한 낮은 위상을 유지.
- 펠렛 불용성 물질을 원심 분리로 sonication을 따르십시오. supernatants을 수영장을 보유하고 있습니다. 4 시간에 Speedvac에서 그들을 말린다. Speedvac를 사용할 수없는 경우 질소 스트림 또는 회전 증발기를 사용하실 수 있습니다. 증발 유기 용제를 개최 할 수있는 좋은 감기에 트랩을 사용합니다. 진공 펌프 오일에 유기 용매의 오염은 진공 펌프의 효율을 저하합니다.
- 고성능 얇은 층 크로마토 그래피 (HPTLC)를 사용하여 예비 분석을 수행합니다. glycolipids을 수량화하기, 50 % 황산 산성 용액 (50 ML 100 밀리그램)와 갈락토오스 표준 (100 ML 주식 솔루션 40 밀리그램)의 0.2 % Orcinol를 준비합니다. 30 μl 반응 볼륨에서 표준 곡선 (g / L 0에서 20g / L까지)로 사용할 dilutions 일련의를 준비합니다. 각 희석 시리즈 샘플로 메탄올의 20 μl를 추가합니다. , 메탄올 200 μl 각 glycolipid 샘플을 분해 sonicate하고, glycolipid 수량 측정 20 μl를 사용합니다. 망 모자 (Sarstedt, 72.692.005)와 1.5 ML Eppendorf 튜브에 표준 곡선 위해 봉사 갈락토오스-H 2 O - 메탄올 솔루션의 일련의 각 샘플 50 % 황산 용액에서 Orcinol 0.2 %의 0.4 ML를 추가합니다 . 100 가열 블록의 5 분에 삶아 ° C. 선 라이즈 Tecan Microplate Reader를 사용하여 440 nm의에서 색 반응의 광학 밀도를 읽어 보시기 바랍니다. 클로로포름 - 메탄올 1시 1분 (V / V)로 치료 중립 지질의 용매로 H 2 O 60:35:8 (v / V / V) : 메탄올 : HPTLC 수행하려면 클로로포름을 사용합니다. 헥산 : H 2 O 55:25:20 (V / V / V)로 이소프로판올을 사용하여산성 지질 (gangliosides)의 용매. 격리 된 중성 GSLs는 200 μl 용매 클로로포름에 용해 됨 : 메탄올 1시 1분 (V / V)와 Drummond Microcaps로 머크 실리카 젤 얇은 층 크로마토 그래피 판에 탑재. 플레이트는 용매 클로로포름에 게재되었습니다 메탄올 : H 2 O 60:35:8 (v / V / V) 및 건조. glycosphingolipids은 300에서 Orcinol - 황산에 의한 시각화했다 ° C.
- DEAE Sephadex A-25 작은 열에서 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 중성 및 산성 지질 아웃 산성 지질, 분수에서 중성 지질을 분리하기 위해 [DEAE Sephadex 대답 25 수지는 Sephadex A-25 수지 몸을 담글 수에 의해 준비 할 수 있습니다 클로로포름의 분말 : 메탄올 : H 2 O 30:60:8 (v / V / V) 밤. Sephadex 대답 25 수지하지 않은되어 그 때까지 표면에 뜨는을 대기음. 수지 씻어 H 2 O 30:60:8 (v / V / V) : 메탄올 : 신선한 클로로포름을 추가합니다. Sephadex 대답 25 수지]에서 부정적인 요금이 부과 잔류 물을 제거하는 세 번 반복합니다.
- 디졸브, sonicate (10 개 이상 분) 및 클로로포름의 단계 2.1에서 지질을 resuspend : 필요할 때 H 2 O 30:60:8 (v / V / V) : 메탄올.
- 유리 양모와 9를 사용하여 작은 DEAE Sephadex 대답 25 (망할 CIA 양식) 열 준비 "파스퇴르 피펫합니다. 조심스럽게 있도록 수지 분말이 칼럼을 통과하지 않는 글라스 울을 싸.에 DEAE Sephadex 대답 25 (망할 CIA 양식) 수지 추가" 열 건조 말도없이 파스퇴르 피펫 "9"목. 당신은 eluent에서 수지가 표시되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 클로로포름에 용해 샘플 : 메탄올 : H 2 O 30:60:8 (v / V / V)을 해산했다. 중성 지질 분획은 분수를 통해 흐름입니다.
- 메탄올의 아세트산 나트륨의 8 ML과 산성 지질 일부를 (수지에 바인딩) Elute. , 중성 및 산성 분수를 모두 건조 투석하여 문제를 탈염하다, Speedvac하여 건조하고 HPTLC을 기준으로 결과를 분석 할 수 있습니다.
산성 비율은 3 단계 반응을 직접적으로에 dialyzed 할 수 있습니다 gangliosides가 포함되어 있습니다.중립적 인 비율은 아세틸 반응에 의해 제거해야합니다 중성 glycosphingolipids뿐만 아니라, phospholipids (phosphatidylcholine과 sphingomyelin),뿐만 아니라이 포함되어 있습니다.
우리의 경험에서 투석 카세트의 방법은 투석 튜브 나 역 위상 C18 칼럼 크로마토 그래피보다 더 효율적이고 편리합니다.
- 다음 단계는 아세틸과 peracetylation 반응에 의해 중성 glycosphingolipids에서 phospholipids의 제거입니다. DEAE Sephadex 4 시간의 Speedvac의 A-25 통과 분수 (냉각 포함) 말린다. 샘플 건조 후, 또 다른 4 시간 동안 Speedvac 건조로 다시 넣어. 잔여 물이 peracetylation 반응을 차단하므로 이러한 샘플이 완전히 건조되었는지 확인합니다.
- 피리딘의 1 ML, 룸 온도 37 ° C 밤에 어둠 속에서 아세트산 무수물의 0.5 ML로 샘플을 Peracetylate. 피리딘과 아세트산 무수물이 정도까지 적절한 것입니다glycosphingolipids 200 μg합니다. GSLs 더 용해도을 가지고이 반응은 37 ° C에서 수행 할 수 있습니다.
- 완전한 증발을 위해 톨루엔 3 배 (coevaporation) 1 ML의 추가와 함께, 3 시간에 Speedvac하여 peracetylated 자료를 말린다. 샘플 건조 될 때까지 계속 Speedvac 완전히 건조하지 않은 경우.
- Florisil 구슬을 사용하여, 유리 울 파스퇴르 피펫에 Florisil (시그마 - 알드리치) 열 (30-60 메쉬, 10 × 80mm)를 준비합니다. Florisil 비즈는 완전히 110 ° C 오븐에 부화하여 사용하기 전에 건조해야합니다. 최대 목에 파스퇴르 피펫으로 구슬을 기입하고, 1,2-dichloroethane-헥산 4시 1분 (V / V)에 평형.
Florisil 칼럼에서 용출은 매우 빠른 것입니다. 용매의 급속한 수축은 열 건조 될 수 있습니다. 따라서 모든 용매 혼합물은이 용출 동안 열을 중지 할 수 없습니다 때문에 열을 실행하기 전에 준비해야합니다.
- peracetyl을 적용한 1,2 - dichloroethane-헥산 4시 1분 (V / V)의 ML, 그리고 1,2-dichloroethane의 10 ML 다음, 같은 용매 6 ML과 열을 씻어에 ated 샘플. 1,2 - dichloroethane - 아세톤 1시 1분 (V / V) 6 ML과 중성 peracetylated GSLs을 Elute. peracetylated phospholipids 안하면서 peracetylated glycosphingolipids는 Florisil 컬럼에 바인딩하기 때문에이 단계는, glycosphingolipids에서 peracetylated phospholipids를 제거합니다.
- 2 ML 0.5 M 나트륨 methoxide로 2 시간과 deacetylate에 Speedvac하여 분수를 건조 [시그마 - 알드리치, 403067] 실온에서 3 시간에 메탄올 2 ML 인치
- methanolic 아세트산의 3 ML 투석에 의해 Speedvac, 탈염하다하여 [아세트산 / 메탄올 85분의 15 V / V], 드라이 [물 3 ML에있는 말린 제품을 디졸브하고, 슬라이드-A-Lyzer에 삽입과 혼합물을 중화 투석 카세트, 24 시간 물에 대한 dialyze. 적어도 두 번 물을 변경]. 샘플이 완전히 건조 될 때까지 Speedvac하여 dialyzed GSLs을 (물 솔루션)을 말린다.
3. Glycosphingolipids 13 화학 변경 (Permethylation)
- 나사 캡과 테플론 라이너와 함께 유리관에 GSLs (1-20 μg)를 소개, 특별 건조 조건이나 불활성 가스 분위기를 사용하지 않고 디메틸 sulfoxide (150 μl)을 추가합니다.
- 유봉과 화학 박격포에서 그들을 분쇄하여 수산화 나트륨 입자의 분말 수산화 나트륨 (40-60 밀리그램)을 준비합니다. 매우 건조한 환경에서 분말을 저장하고 분말을 호흡 방지하기 위해 화학 후드에 연삭을 할주의해야합니다.
- 다음 주걱으로 샘플 솔루션에 수산화 나트륨 가루를 추가합니다. 100 마이크로 리터 Halmilton 주사기와 이오도 메탄 (80 μl)을 추가 [또는 고무 튜브를 통해 주사기에 연결된 피펫 눈금을 100 마이크로 리터의 VWR를 사용할 수 있습니다] 1 시간 동안 실온에서 혼합를 흔들.
- 물 (2 ML)로 methylation 반응을 해소. 하여 permethylated 제품 3 번 압축을 풉니 다dichloromethane의 추가 (2 ML) [glycolipids은 낮은 단계하므로, 위 단계가 새로운 유리 튜브로 전송 될 수 있으며, dichloromethane로 다시 추출 dichloromethane 단계에 해당합니다].
- 통합 dichloromethane는 [, 물 위의 단계를 다음 처리 할 수 있습니다] 2 ML의 물과 함께 3 회를 추출 씻으십시오. 마지막 세척 후, 새로운 튜브에 샘플을 전송하고, Speedvac를 사용하여 건조.
- 샘플은 다음 ESI-MS 분석을위한 메탄올의 100-200 μl에 용해 할 수 있습니다.
4. Permethylated Gycosphingolipids의 든 - TOF 분석
- 든 TOF-TOF 질량 분광계 (Biosystems 4700, 포스터 시티, CA를 적용)에 든 - TOF-MS와 MALDI-TOF/TOF-MS/MS 실험을 수행합니다. 10 MG / ML dihydroxybenzoic 산 (DHB) 아세토 니트릴과 물에 0.1 % trifluoroacetic 산 (TFA)의 50 % 볼륨의 50 % 볼륨을 혼합하여 행렬을 준비합니다.
- DHB 매트릭스가 든 targe에서 발견 할 수 있습니다메탄올에 용해 시료의 1 μl (100 NG의 GSLs를 포함) 장소 다음 t (1 μl). 천천히 적용하고 분석하기 전에 건조 할 수 있습니다.
5. Permethylated Glycosphingolipids의 이온 트랩 MS 분석
- nanoelectrospray 소스를 사용하여 선형 이온 트랩 질량 분석기 (ThermoScientific LTQ, 산호세, CA)에 질량 분광법을 수행, 230에서 0.30 분 / μl 유량 ° 30-50% 충돌 에너지와 긍정적 인 이온 모드에서 C 모세관 온도. 전구체 이온의 최소 잔류 풍부한을 떠나 충돌 에너지를 설정합니다. 나트륨 알데히드 부가 물 등 모든 이온을 감지합니다.
- glycan 조각 m / Z 667와 터미널 이당류 일을 통해 sodiated 분자 이온에서 MS 사 제품 이온의 다른 패턴을 비교하여 Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer)와 iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) 표준의 isobaric 혼합에 iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)를 식별 - 에너지 이온 m / Z 445 (즉,X → 667 → 445 →, X permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)의 사람들과 ESI - 조명-MS를 통해 순수 permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) 표준의 MS 1)에서 감지 분자 이온을 의미합니다.
Representative Results
쥐 백혈병 세포 라인 RBL (NKT 세포에 glycosphingolipid 항원을 제시 항원 제시 세포 유형)에서 glycosphingolipids의 든 MS 분석의 예는 그림 3에 표시됩니다. 이온은 특정 glycosphingolipid 구조 (그림 3A)에 할당 할 수 있습니다. NB-DGJ 16 glycosphingolipid 합성, 모든 glycosphingolipids 상당한 감소는 (그림 3B) 관찰을 억제하는 약물에 의해 치료 RBL 세포합니다. 구조 isomers는 구별 할 수는 없습니다. 응용 Biosystems 4700의 MS / MS 용량이 제한된 구조 정보를 생성 할 수 있도록, MS 두 조각 MS1 이온의 분열 할 수 있습니다. 그러나, MS2 분석은 종종 올리고당 isomers을 차별하기에 충분하지 않습니다.
glycosphingolipids의 이온 트랩 MS 분석은 iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer)와 Gb3 (Galα으로 isomers 연구를 수도 3a에 감지 trihexosylceramide 이온으로 존재할 수 4Galβ4Glcβ1Cer). 차이는 (그림 4A 및 4B) 발견되었습니다 때까지 isomers을 감지하기 위해 표준 iGb3 및 Gb3은 조각의 여러 반올림하여 분석 하였다. 여기에 제시된 예에서 (그림 5C) iGb3 및 Gb3는 표준 iGb3와 Gb3에 비교하여 차별 될 수 있습니다.
1 그림. glycosphingolipid 추출 절차의 흐름 차트 및 glycosphingolipids (permethylation)의 화학 수정. Glycosphingolipids는 유기 용제에 의해 세포로부터 추출되었다. 비 glycosphingolipids을 제거하려면, 지질은 peracetylated와 deacetylated 할 수 있습니다. 둘째, glycosphingolipids는 화학적으로 permethylation 반응에 의해 수정 된, 즉 MS detectio의 감도와 특이성을 향상N. 마지막으로, glycosphingolipid 프로필이 든 - TOF 질량 분광법과 이온 트랩 질량 분광법을 사용하여 결정됩니다.
그림 2. Orcinol 황산 방법으로 Glycosphingolipid 정량화 : 50 % 황산 용액과 포도당 표준 곡선에 Orcinol 0.2 %를 사용하여 glycosphingolipids의 정량화.
그림 3. 쥐 백혈병 세포의 Glycosphingolipidomics A. 대표 든 질량 스펙트럼,. 각 이온은 특정 glycosphingolipid 구조를 나타내는 구조 isomers는 구별 할 수는 없습니다 B. NB-DGJ, glycosphingolipid 합성,을 억제하는 약물이.ignificantly RBL 세포에서 생산되는 모든 glycosphingolipids을 줄일 수 있습니다.
4 그림. Glycosphingolipids의 isomers의 직렬 질량 분광법. permethylated GSLs GB 3 CER 및 iGb 3 CER의 긍정적 인 모드 이온 트랩 질량 분광법에 대한 A. 특성 분해 경로. GB 3 iGb 3 명확하게 자신의 조각 패턴으로 구분됩니다. 결합의 차이는 isobaric m / Z 445 전구체와 일치 MS 사 제품 이온에 반영됩니다. B는. iGB3을 보여주는 대표적인 결과는 iGb3/Gb3 isomers의 혼합으로 측정 할 수 있습니다. 별은 iGb3에 대한 진단 이온을 나타냅니다. 여기를 클릭에더 큰 그림을 볼 수 있습니다.
그림 5. 이온 트랩 MS는 glycosphingolipids의 isomers의 분석을 할 수 있습니다. A. 표준 iGb3와 이온 트랩 LTQ 질량 분석기의 조각 4 라운드 후 조각화 프로필 Gb3 쇼의 차이. iGb3 또는 Gb3. C.에서 파생 된 이온의 B. 특성 MS 사의 프로필 Trihexosyleramides은 이온 트랩 MS 방법 (Dapeng 저우의 그림)에 의해 식별 할 수 iGb3과 Gb3 isomers의 혼합물입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
glycome, 게놈과 프로테옴에 비유 년에 주장 용어 유기체의 모든 saccharide 구조를 의미합니다. 완전히 글리코 실화의 매니 폴드 기능을 이해하기 위해서는 두 기능 및 구조 glycomics 연구 등의 통합 된 접근 방식을 필요합니다. 모두 glycan 생합성, glycan 구조의 결과 복잡성과 다양성, 분자 수준의 변조 glycan 리간드 - 수용체 상호 작용의 aglycone 구조의 자주 참여, 낮은 풍부한의 리간드의 기능 중요성의 비 템플릿 기반의 자연 복잡합니다.
그것은 일반적으로 대량 분석법 (MS)가 특히 낮은 풍부한의 리간드를 파악하고 특성화를위한 구조 glycomics 연구를위한 필수적인 방법입니다 가능합니다. 분자 종으로 glycans 또는 glycoconjugates을 관찰하기 위해, 우리는 종종 전기 분무 이온화 (ESI)라는 고효율, 낮은 에너지 이온화 방법을 사용합니다. 더 나온에 대한glycan 구조의 특성 ailed, 그것은 각각의 분자 종을 선택한 후 작은 조각으로 glycans을 깨는 것이 중요합니다. 이것은 일반적으로 불활성 가스 분자와 충돌을 통해 glycans를 활성화 관련 충돌 유발 분해에 의해 이루어집니다. 증가 에너지는 본드 파손을 유도하고, 결과 조각의 체계적 분석은 glycan의 분자 구조에 대한 정보를 제공합니다. 종종, "서명"조각은 특정 glycan 구조 기능에 대한 진단 아르 그 생성 할 수 있습니다. 함께 분자 질량이 조각은 구조가 소설, 특히 때때로 glycans를 식별하기 위해 충분한 수 있지만 과거에 더 많은 정보가 완전히를 특징하는 데 필요한되었습니다. 이러한 방법은 설탕 성분 분석, 연계 분석을위한 부분적으로 methylated alditol acetates의 가스 크로마토 그래피 질량 분광법 분석, 특정 glycosidase의 소화 17 등이 있습니다.
18-19 동안 시연, 효과적으로 (IT-MS) 이온 트랩 질량 분석기에서 수행 할 수 있습니다 낮은 에너지 조각, 여러 발은 크게 glycan 질량 스펙트럼 분석의 정보 수율을 향상 . 단편화 (다른 MS 악기 짓을 할 수없는)의 4 5 판으로, 이러한이 같은과 구성 요소의 혼합물에 함께 존재하는 경우에도, 다른 설탕 연계에 배치 같은 설탕 구성 요소가 포함 이성질체 glycans를 구별 할 수 있습니다 분자 질량 (isobars). 이 분석은 glycans는 permethylation를 사용하여 메틸 그룹과 무료로 히드 록실 그룹을 대체 derivatized했다. glycans의 구조 임무가 permethylation없이 가능하지만, permethylation이 감도 17 증가한다.
Levery과 저우는 이성질체 stru의 검출 등의 IT-MS 방법론의 잠재적 인 장점을 모두를 결합했습니다여러 isobaric 혼합물 7-9의 형태로 존재 glycosphingolipids의 고감도 식별 및 quantitation에 대한 MS 4 MS 5 스펙트럼에서만 관찰 서명 진단 이온을 사용 ctures. 이론적으로, 우리는 화학적으로 합성 할 수 있습니다 표준 glycolipids의 가용성중인 모든 기존 glycolipid 구조를 식별 할 수 있습니다.
이 분석의 중요한 단계는 생물학적 샘플에서 GSLs의 회복 속도입니다. GSL의 일반적으로 80 μg이 같은 RBL 등 100,000,000 종양 세포에서 복구 할 수 있습니다. 이온 트랩 질량 분석기의 조각의 여러 라운드에 대한 충분한 분자 이온을 생성하려면, 종양 GSLs의 최소 10 마이크로 그램이 필요합니다. 정화 중 GSLs의 낮은 수율은 또한 조각의 대상이 될 수 없습니다 이온의 낮은 풍부한 될 것입니다. 분석의 성공은 복구 아르 GSLs의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로, 최종의 concpermethylated GSLs의 entration는 나노 전기 분무 소스에 분석되기 전에, 메탄올에 용해 한 MG / ML에 도달해야합니다. 철저한 MS N 분석을위한 제한은 MS 하나의 프로필에서 특정 이온의 풍부한에 따라 달라집니다. 일반적인 전자 7 이온 풍부은 철저한 MS 오 분석이 필요합니다. 정화 중 GSLs의 낮은 수율은 당 acetylated GSLs가 Florisil 수지 크로마토 그래피 컬럼에 바인딩 세척하고, 이후 용출해야합니다 peracetylation 단계에서 GSLs의 손실 (phospholipids를 제거하는)에 의해 발생할 수 있습니다. 실리카 겔에 당 acetylated GSLs의 바인딩을 보장하기 위해 샘플이 흐르는 후 크로마토 그래피 칼럼에 두 번 다시로드해야합니다.
Disclosures
DZ는 BioTex, 휴스턴, TX, 그리고 발행이 문서에서 언급 된 기술에 관한 특허 또는 응용 프로그램에 포함 발명가에 대한 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
DZ는 MD 앤더슨 암 센터와 NIH 보조금 AI079232에서 지원됩니다. MD 앤더슨 암 센터는 NIH 보조금 CA16672에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 Dichlor–thane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9"'' |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12x75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
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