Summary
هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في تطوير العقاقير. متابعة أهداف متعددة في نفس الوقت يزيد كثيرا من فرص النجاح لاكتشاف الرصاص. يسلط الضوء على المقالة التالية كيفية مركز سياتل الجينوم الإنشائية للأمراض المعدية يستخدم نهجا متعدد الاهداف لتحديد الجينات إلى هيكل إنفلونزا PB2 A الوحيدات.
Abstract
تفشي جائحة من سلالات الأنفلونزا شديدة الضراوة يمكن أن يسبب الاعتلال والوفيات على نطاق واسع في المجتمعات البشرية في جميع أنحاء العالم. في الولايات المتحدة وحدها، هي سبب ما معدله 41،400 حالة وفاة و1860000 المستشفيات عن طريق العدوى فيروس الإنفلونزا كل عام 1. وقد تم ربط الطفرات نقطة في البلمرة الأساسية البروتين الوحيدات 2 (PB2) إلى التكيف من العدوى الفيروسية في البشر 2. وقد كشفت النتائج المستخلصة من هذه الدراسات أهمية بيولوجية من PB2 كعامل الفوعة، وبالتالي إبراز إمكاناتها كهدف العقاقير المضادة للفيروسات.
برنامج علم الجينوم الهيكلي طرح من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) يوفر التمويل لالزمرد الحيوية وثلاث مؤسسات شمال غرب المحيط الهادئ الأخرى التي تشكل معا مركز سياتل الجينوم الإنشائية للأمراض المعدية (SSGCID). ويكرس SSGCID إلى تزويد المجتمع العلمي مع ثلاث،هياكل البروتين الأبعاد (ه) من مسببات الأمراض المعدية فئة AC. مما يجعل هذه المعلومات متاحة الهيكلية للمجتمع العلمي يعمل على تسريع هيكل القائم على تصميم الأدوية.
هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في تطوير العقاقير. متابعة أهداف متعددة في نفس الوقت يزيد كثيرا من فرص النجاح لاكتشاف قيادة جديدة من خلال استهداف طريقا أو عائلة بروتين كامل. وقد وضعت الزمرد بيو خط أنابيب عالية الإنتاجية، متعدد الاهداف المعالجة المتوازية (MTPP) لتحديد الجينات إلى هيكل لدعم الكونسورتيوم. نحن هنا وصف البروتوكولات المستخدمة لتحديد بنية الوحيدات PB2 من أربعة إنفلونزا A سلالات مختلفة.
Protocol
يتم تقديم لمحة عامة عن بروتوكول في الشكل 1.
علم الأحياء الجزيئي
1. بناء تصميم
استخدام البرمجيات الملحن جين لتصميم بناء البروتين وهندستها كودون تسلسل الجينات الاصطناعية. وقد عرضت استخدام البرمجيات الملحن جين بالتفصيل في مكان آخر 3.
- استخدام وحدة عارض محاذاة، وبناء وحدة التصميم للمقارنة بين التحالفات تسلسل البروتين وتحديد بناء البروتين. محاذاة الهدف تسلسل الأحماض الأمينية في كل من العناصر الهيكلية الأساسية و 3D من homologs في بنك معلومات البروتين (PDB)، إذا كانت متوفرة (الشكل 2).
- استخدام المعلومات محاذاة إلى تقديم تصاميم بناء هيكل الموجهة عن طريق اختيار مصطلحات جديدة تقوم على المحافظة على بنية الأساسية وهياكل 3D من homologs.
- تصميم إدراج PCR (iPCR) وناقلات PCR (vPCR) amplimers (محطة الاشعال).
- باستخدام الجينات Cخوارزمية البروتين إلى الحمض النووي omposer، والعودة ترجمة تسلسل الأحماض الأمينية في بناء هندسيا كودون تسلسل الحمض النووي.
- استخدم الجدول الاستخدام السليم كودون (CUT) لتحسين تسلسل للتعبير في E. القولونية.
- استنساخ تقريبا تضاف إلى pET28 ناقلات تعديلها لإدراج N-محطة 6X العلامة الحامض الأميني وSmt3/SUMO انصهار بروتين أن يسمح لسهولة تنقية.
- ضع الاصطناعية أجل الجين DNA مع 2.0 و الاشعال النظام من تقنيات الحمض النووي المتكاملة.
2. البلمرة امتداد التمهيدي غير كاملة (الأنابيب) الاستنساخ
- إعداد الاشعال والجينات
- أجهزة الطرد المركزي لوحات الموفر من قبل المورد التي تحتوي على الاشعال في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- جلب تركيز التمهيدي إلى 100 ميكرومتر وإضافة 50 العازلة TE ميكرولتر.
- تمييع الاشعال إلى 10 ميكرومتر مع منزوع الأيونات (DI) المياه في لوحة 96-V-أسفل جيدا.
- أجهزة الطرد المركزي لهذا الجين الموفر من قبل المورد في أنبوب 1.5 مل في 1،300 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- في أنابيب 1.5 مل، وجعل التخفيفات من كل التمهيدي إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
- الاشعال متجر والجينات في -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- إعداد إدراج PCR (iPCR)
- ذوبان الجليد قارورة من PFU ميكس ماجستير على الجليد، الحفاظ على الجينات والاشعال في درجة حرارة الغرفة.
- إنشاء لوحة خريطة تكليف الآبار لمجموعة من الاشعال وبناء.
- إضافة 13 ميكرولتر من المياه DI في كل بئر من لوحة PCR 96-جيدا.
- إضافة 5 ميكرولتر من الأمام و 5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي لكل رد فعل في لوحة 96 جيدا وفقا لخريطة لوحة، وضمان لتغيير نصائح بين كل بئر.
- إضافة 2 ميكرولتر من كل جين طول الكامل للالمناسب لها جيدا وفقا لخريطة لوحة.
- إضافة 25 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PFU إلى كل بئر، وضمان لتغيير نصائح بين كل بئر.
- دورة التفاعلات باستخدام PCR الشروط التالية:
- 95 ° C 2 دقيقة 95 ° C 30 ثانية
- 50 ° C و 45 ثانية
- 68 ° C 3 دقائق
- 4 ° C ∞
- كرر الخطوات دينار بحريني لمدة 25 دورات.
- نقل 10 ميكرولتر من كل رد فعل iPCR إلى لوحة جديدة PCR-96 أيضا.
- إضافة 3 ميكرولتر من صبغ 6X الحمل إلى كل عينة.
- فصل كل عينة على 1٪ TAE EtBr الاغاروز هلام في 110 فولت بجانب 100-500 نقطة أساس سلم الحمض النووي لتأكيد التضخيم شظية.
- مخزن iPCR المنتج في -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال (تجنب تجميد ذوبان الجليد قدر الإمكان).
3. إعداد المتجهات PCR (vPCR)
- بدء الثقافة بين عشية وضحاها تحولت من E. القولونية مع pET28 ناقلات البلازميد.
- تطعيم اثنين من 5 مل من أنابيب مرق 2-YT مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
- تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر في 220 دورة في الدقيقة.
- تدور باستمرار الثقافات بعد نمو بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
- استخدام جهاز قطر للاستثمار QIAGENالإعدادية سبين Miniprep كيت لاستخراج pET28 متجه من الكريات البكتيرية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخراج الإعداد تقييد انزيم الهضم من pET28 البلازميد.
- إضافة 2.2 ميكرولتر من العازلة 10X BamHI و 1 ميكرولتر من BamHI وHindIII إلى 20 ميكرولتر من pET28 النواقل.
- احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- منفصلة المنتج الهضم على هلام.
- الرجوع إلى الخطوة 2.2.10.
- خفض الفرقة متجه من الجل وتطهيره باستخدام QIAquick جل عدة استخراج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- باستخدام معمل NanoDrop، قياس تركيز الحمض النووي.
- تمييع خفض متجه إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- إعداد الاشعال vPCR.
- أجهزة الطرد المركزي IDT oligonucliotides الموردة لمدة 1 دقيقة في 1،300 دورة في الدقيقة.
- جلب التركيز إلى 100 ميكرومتر مع الماء DI.
- إعداد 10 ميكرومتر التخفيف من كلا الاشعال إلى الأمام وعكس في أنبوب 1.5 مل.
- الاشعال متجر والتخفيفات التمهيدي في -20 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد PFU ميكس ماجستير على الجليد وذوبان الجليد قالب والاشعال في درجة حرارة الغرفة.
- ردود الفعل vPCR الإعداد في لوحة PCR 96-جيدا:
- في الصف الأول من لوحة 96 جيدا الجمع بين 60 ميكرولتر من كل من الاشعال vPCR إلى الأمام وعكس و 24 ميكرولتر من هضمها pET28 قالب (10 نانوغرام / ميكرولتر).
- باستخدام ماصة الأقنية 12-طرف، ونقل 12 ميكرولتر من التمهيدي وقالب مزيج الرئيسي إلى كل ما تبقى بئر من لوحة. هذا ينبغي أن يؤدي في 12 ميكرولتر من التمهيدي ومزيج الرئيسي القالب في كل بئر من لوحة.
- إضافة 13 ميكرولتر من المياه DI إلى كل بئر.
- إضافة 25 ميكرولتر من PFU ميكس ماجستير إلى كل بئر.
- دورة ردود الفعل من خلال الشروط PCR المستخدمة في الخطوة 2.2.7.
- تجمع جميع من ردود الفعل vPCR إلى 15 مل أنبوب فالكون.
- تحقق من التضخيم شظية من خلال فصل 10 ميكرولتر من تجميع المنتج PCR على هلام (طول المتوقع من هضمها pET28 ناقلاتما يقرب من 6 KB).
- الرجوع إلى الخطوة 2.2.10.
- إعداد دمج لوحات.
- قسامة 3 ميكرولتر من المنتج vPCR في كل بئر من لوحة 96-V-أسفل جيدا.
- لوحات تخزينها في -20 درجة مئوية حتى تندمج مع المنتج iPCR.
4. دمج iPCR والمنتجات vPCR
- منتجات iPCR ذوبان الجليد وvPCR قبل aliquoted 96-جيدا دمج لوحة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 3 ميكرولتر من كل منتج iPCR إلى جيدا لها كل من لوحة الدمج.
- تحويل دمج لوحة في أعلى عشرة الخلايا المختصة كيميائيا.
- إضافة 2 ميكرولتر من كل رد فعل الاندماج في أنبوب واحد 50 ميكرولتر من الموفر من قبل المورد الخلايا المختصة كيميائيا والمضي قدما مع بروتوكول زودت الشركة المصنعة.
- إعداد الثقافات بين عشية وضحاها لكل بناء من لوحة التحول.
- قسامة 5 مل مرق السل (مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين) من 25 خزان معقم مل في كل بئر من كتلة بئر عميقة.
- باستخدام STERIتقنية جنيه، واختيار مستعمرة معزولة من كل لوحة التحول وتطعيم البئر المناسبة للكتلة بئر عميقة.
- تغطية كتلة مع غطاء Airpore.
- يهز كتلة في 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي كتلة لمدة 30 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة.
- تخلصي من طاف وبات الجزء العلوي من كتلة الجافة مع منشفة ورقية.
- مصغرة الإعدادية باستخدام QIAGEN 96-جيدا جهاز فراغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5. إعداد مخزون الجلسرين من التركيبات المستنسخة بنجاح
- تحويل بنجاح استنساخ تسلسل الحمض النووي في التحقق من صحة BL21 (DE3) الخلايا المختصة كيميائيا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- لكل بناء، واختيار مستعمرة معزولة واحدة من BL21 (DE3) التحول وتلقيح في 1 مل من مرق 2-YT (مع 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين).
- يهز الثقافات في 220 دورة في الدقيقة لمدة 3-4 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تسمية 1.5 ملالمسمار أنبوب قبعة مع فريدة من نوعها عدد بناء الهوية، سلالة خلية، والتاريخ. إضافة 500 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ و 500 ميكرولتر من خلية ثقافة وعكس عدة مرات. تخزين فورا الأسهم الجلسرين على الثلج الجاف أو في الفريزر -80 درجة مئوية.
6. اختبار التعبير
| تحلل عازلة R | غسل العازلة | شطف العازلة |
| 50 ملي ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 8.0 300 ملي مول كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول 1٪ توين 20 2 ملي MgCl 2 0.1 ميكرولتر / مل Benzonase 1 ملغ / مل الليزوزيم | 50 ملي ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 8.0 300 ملي مول كلوريد الصوديوم 20 ملي إيميدازول 0.05٪ توين 20 | 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 ملي مول كلوريد الصوديوم 250 مم الايميدازول 0.05٪ توين 20 |
* إضافة Benzonase، الليزوزيم،ومثبط البروتياز على الفور قبل تحلل.
- خط عينة من الأوراق المالية الجلسرين على الكاناميسين آغار انتقائية واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- بدء غير مسببة ما قبل الثقافة في كتلة أسفل 96-جولة جيدا؛ تطعيم 1.2 مل مرق السل (مع 50 ملغ / مل الكاناميسين) تستكمل مع 0.5٪ الجلوكوز مع E. نمت طازجة كولاي عزل. تنمو بين عشية وضحاها اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بعد نمو بين عشية وضحاها، تبدأ الثقافات الاستقراء، فحقن 1.2 مل من مرق السل (مع 50 ملغ / مل الكاناميسين) تستكمل مع Novagen بين عشية وضحاها نظام اكسبريس 1 (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) مع 40 ميكرولتر من قبل الثقافة.
- تنمو الثقافات الحث على نطاق صغير عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، صب قبالة طاف وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تجهيزها.
- في كتلة 96-جيدا، resuspend والكريات الخلية في 300 ميكرولتر العازلة تحلل. احتضان الخلايا في العازلة تحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تليها تحلل الميكانيكية التي تهز بقوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- توضيح المحللة الخام بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 4،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
- استخدام ماصة متعدد القنوات لنقل 200 ميكرولتر من المحللة توضيح (جزء قابل للذوبان) إلى أسفل الدرج 96-جيدا شقة (QIAGEN). لكل تحتوي أيضا عينة، إضافة 40 ميكرولتر الخرز ني NTA المغناطيسي (QIAGEN).
- تستنهض الهمم بلطف لوحة على الكرسي الهزاز لمدة 1 ساعة عند 16 درجة مئوية.
- وضع لوحة على لوحة آخر المغناطيسي (QIAGEN) وإزالة جزء غير منضم للذوبان. الحرص على عدم خروج أي ماصة من الخرز ني NTA.
- إزالة لوحة من لوحة آخر ومعلق بلطف حبات في 200 ميكرولتر غسل العازلة. ماصة صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية ثم قم بوضع لوحة مرة أخرى على لوحة آخر.
- إزالة العازلة يغسل وكرر الخطوة 6.12.
- إزالة لوحة من لوحة البريد وأزل ني NTA ملزمة تاالبروتين rget عن طريق الغسيل مع 50 ميكرولتر العازلة شطف لمدة 5 دقائق.
- عودة لوحة مسطحة القاع إلى لوحة مغناطيسية آخر ونقل شطف إلى 96 جيدا لوحة V-أسفل الطازجة.
- نقل 20 ميكرولتر من شطف إلى 96 جيدا لوحة V-أسفل الطازجة وتتفاعل مع 1 ميكرولتر ULP1 البروتيني.
- وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتحليل مزال مزال و+ Ulp1 جزء من قبل الكهربائي الشعري باستخدام LabChip 90.
- بدلا من ذلك، يمكن تحليل كل الكسور من اختبار التعبير عبر SDS-PAGE.
7. التخمير نطاق واسع
- استخدام غيض ماصة معقمة للحصول على كشط من مخزون الجلسرين، تطعيم 100 مل مرق السل (مع 50 ملغ / مل الكاناميسين) وتنمو بين عشية وضحاها. يهز في 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
- بعد نمو بين عشية وضحاها، وتوسيع ما قبل الثقافة، فحقن 1 لتر من مرق السل مع حلول autoinduction EMD (انظر بروتوكول الشركة المصنعة) (مع 50 ملغ / مل الكاناميسين) في 2 L قارورة حيرة مع 10 مل منقبل ثقافة (1:100 تمييع).
- يهز موسعة 1 الثقافات L عند 37 درجة مئوية، وتغيير درجة حرارة الحاضنة تهز إلى 20 ° C عندما يتم التوصل إلى الكثافة البصرية من 0.6 (OD 600).
- بعد نمو بين عشية وضحاها، واتخاذ ممثل قسامة 10 مل من كل بناء لاختبار التعبير.
- خلية الحصاد لصق بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، وتجاهل طاف.
- تجميد الخلية لصق في -80 درجة مئوية.
تنقية البروتين
مخازن:
| تحلل العازلة | الاحتياطي A (موازنة) | العازلة B (شطف) | التحجيم الواق العمود |
| 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 0.5٪ الجلسرين 0.02٪ CHAPS 10 ملي إيميدازول 1 ملم TCEP 50 أرجينين ملي 5 Benzonase ميكرولتر 100 مز الليزوزيم 3 أقراص مثبط البروتياز (EDTA خالية من) | 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول 1 ملم TCEP 50 أرجينين ملي 0.25٪ الجلسرين | 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 200 ملي إيميدازول 1 ملم TCEP | 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 200 ملي مول كلوريد الصوديوم 1٪ الجلسرين 1 ملم TCEP |
* إضافة Benzonase، الليزوزيم، وأقراص مثبط البروتياز إلى كل عينة ML 150 مباشرة قبل تحلل.
8. تحلل الخلية
- جعل 2 L من تحلل العازلة؛ لا تضيف الليزوزيم، وأقراص مثبط البروتياز أو benzonase (سيتم هي lysed كل عينة على حدة في 150 مل من تحلل العازلة).
- ذوبان الجليد و resuspend الخلية لصق في تحلل العازلة في كتلة 1:5: نسبة حجم بواسطة التحريك بقوة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. كسر أجزاء فضفاضة من الجانبين من الدورق باستخدام ملعقة نظيفة. خلال هذه الفترة الزمنية إعداد ني وdialy والرسومبمخازن الهيئة العامة للاستعلامات
- على الجليد، ليز الخلايا باستخدام sonicator Misonix (70٪ من الطاقة، 2 ثانية على / 1 ثانية قبالة البقول لمدة 3 دقائق) والحاويات دوامة بلطف لمنع الانهاك. حفظ صغيرة (200 ميكرولتر) قسامة من المحللة الخام لتحليل المستقبل.
- توضيح المحللة الخام بواسطة الطرد المركزي عند 18،000 x ج لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع طاف وحفظ صغيرة (200 ميكرولتر) قسامة لتحليل المستقبل. مخزن بيليه في 4 درجات مئوية حتى يتم تأكيد أنه تم هي lysed البروتين في جزء قابل للذوبان.
9. ما قبل التشغيل الإعداد صانع البروتين
- مع تحول صانع البروتين في والبرمجيات مفتوحة، تهيئة الصك.
- مرة واحدة تهيئة، ونعلق واحد 5.0 مل GE للرعاية الصحية HisTrap FF العمود النيكل وكلاب (ني عمود) في سطر منفصل من الهزال لكل من العينات.
- تشغيل وحدات التخزين العمود 3-4 (CV) من العازلة موازنة من خلال كل عمود.
- رئيس موازنة وخطوط شطف العازلة.
- Equilibrيأكلون الأعمدة بواسطة الشفط العازلة من A إلى العمود مرة واحدة.
10. النيكل 1 (NI1) عمود
- يغسل كل عمود مع 20 مل من الماء ملي-Q لإزالة العازلة التخزين. تشغيل 5 مل العازلة B و 25 مل العازلة A للموازنة.
- تحميل المحللة توضيح تحتوي على البروتين solubilized في الأعمدة بمعدل 2 مل / دقيقة ثم اتبع من قبل 15 غسل مل مع العازلة A.
- أزل بروتين محدد في التدرج خطوة مع مخازن ألف وباء من النسب التالية بكل احترام: 5 مل 95:5، 5 مل 60:40، 10 مل 0:100. جمع كل جزء على حدة شطف.
- تحليل: كسور مزال، المحللة الخام، المحللة توضيح، والتدفق من خلال بواسطة SDS-PAGE. الكسور تجمع تحتوي على البروتين واستخدام معمل NanoDrop لقياس A 280 تقريبا لتحديد كمية البروتين الحاضر.
11. ULP1 الشق
- الحفاظ على قسامة صغيرة (250 ميكرولتر) من تجمع العمود NI1 لتحليل هلام اللاحقة. جلب بقيةتجمع NI1 إلى 10 مل وإضافة اليوبيكويتين مثل البروتياز 1 (ULP1) في 1 ميكرولتر / 5 ملغ من البروتين الكلي لإزالة علامة لعه في فريق الإدارة العليا.
- Dialyze تجمع NI1 + ULP1 ضد 2 L من العازلة A لمدة 4 ساعة في 4 درجات مئوية في 10 كيلو دالتون قطع الوزن الجزيئي (MWCO) على طبق من ضجة في 4 درجات مئوية.
- بعد غسيل الكلى، وتشغيل SDS-PAGE من NI1 سباحة وحمام سباحة + NI1 ULP1 لتحديد ما إذا كان ULP1 انشقاق ناجحة.
12. النيكل 2 (Ni2) عمود
- تحميل بروتين المشقوق فوق العمود ني نفسه وكرر الخطوة 9.3 بمعدل انخفاض تدفق من 1 مل / دقيقة. سوف علامة قبالة المشقوق ربط العمود وسوف البروتين الهدف tagless التدفق من خلال الآن. جمع من خلال تدفق في وعاء جديد.
- غسل العمود ني مع 3 مل العازلة A تليها 5 مل من العازلة B إلى أزل كل صاحب الموسومة البروتين وملزمة nonspecifically. جمع كل جزء على حدة.
- تشغيل SDS-PAGE من Ni2 التدفق من خلال، وغسل وشطف Ni2 الكسور للتحقق ULP1 الانقسام وأن العلاقات العامةotein موجود في التدفق من خلال. استخدام معمل NanoDrop لقياس A 280 تقريبا لتحديد وجود البروتين.
13. التركيز
- تركيز Ni2 التدفق من خلال (وNi2 شطف إذا البروتين موجودا) إلى 5 مل مع المركزي Amicon الترا 10 كيلو دالتون MWCO أنبوب الطرد المركزي. تدور في فترات 10 دقيقة في 4،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. خلط مع ماصة بين كل دورة لمنع البروتين من الإفراط في التركيز على طول الغشاء.
14. اللوني الحجم الاستبعاد (SEC)
- اقامة Sephacryl S-100 10/30 GL عمود (GE للرعاية الصحية) من خلال تحقيق التوازن مع 200 مل SEC العازلة بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة على نظام AKTApurifier (GE للرعاية الصحية).
- إعداد 10 superloops مل للاستخدام على العمود SEC وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- باستخدام حقنة 5 مل، وتحميل العينات على superloops وبدء التشغيل SEC.
- رصد أثر الأشعة فوق البنفسجية الامتصاصية في 280 نانومتر في حين جمع صغير الحجم FRالإجراءات.
- تشغيل الكسور SEC عبر SDS-PAGE.
- تجمع الكسور SEC تظهر أعلى كثافة العصابات.
- التركيز الكسور SEC المجمعة. الرجوع إلى الخطوة 13.1.
- البروتين قسامة إلى 100 عينات ميكرولتر، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
تبلور
15. بلورة البروتين
- قبل ملء كل خزان من 96 جيدا المدمجة جونيور لوحة تبلور (الزمرد بيو) مع 80 ميكرولتر من شاشة بلورة (الزمرد بيو) في الاختيار.
- تمييع البروتين مع التحجيم عازلة ل2-20 ملغ / مل وتخزينها على الجليد.
- الاستغناء 0.4 ميكرولتر من البروتين و 0.4 ميكرولتر من الشاشة تبلور في كل من الآبار 96، وتغطي مع اضحة وضوح الشمس ختم الشريط (مانكو).
- تخزين لوحة عند 16 درجة مئوية أثناء التحقق من بلورة البروتين بشكل دوري على مدى الأسابيع القليلة القادمة تحت مجهر تشريح.
16. حصاد الكريستال </ P>
- إنشاء cryoprotectant من المحلول الام وجلايكول الإثيلين. قص الشريط واضحة تغطي بشكل جيد مع الكريستال بروتين الهدف. لبئر فارغة، إضافة 1.6 ميكرولتر من حالة ببلورة المقابلة وتتحد مع 0.4 ميكرولتر من جلايكول الإثيلين مما أسفر عن تركيز النهائي من 20٪ جلايكول الإثيلين و 80٪ بلورة حالة. ملاحظة: لتحسين حيود الكريستال محاولة cryoprotectants مختلفة مثل: الجلسرين والزيوت، وانخفاض الجليكول ايثيلين MW، و / أو في النسب المئوية للcryoprotectant متفاوتة.
- قبل حصاد يبرد على عفريت على غرار ALS في ديوار مليئة النيتروجين السائل والغطاء مع غطاء.
- حصاد الكريستال من خلال وضع CryoLoop مع القطر الداخلي مطابقة حجم الكريستال على عصا كريستال المغناطيسي (بحوث هامبتون) وحلج القطن مباشرة من الحل أيضا.
- تراجع فورا CryoLoop مع الكريستال المقطوع في ثم يغرق في cryoprotectant عفريت على غرار ALS وميض تجميد جrystal. كرر لعدد المطلوب من البلورات.
17. الكريستال فحص / جمع البيانات
- مرة واحدة حصاد اكتمال استخدام عصا عفريت لوضع المغناطيسي البرد عفريت غطاء على ALS عفريت. مع ملقط عازمة، والوجه عفريت رأسا على عقب.
- نقل عفريت لRigaku ACTOR ديوار، المسمار مروج المخدرات عفريت على عفريت، ولكمة قبالة غطاء تركها في ديوار مع دبابيس مواجهة.
- باستخدام البرمجيات JDirector، وشاشة الكريستال تحت كل المعلمات التالية: شق شعاع تعيين إلى 0.5 درجة، للكشف عن مسافة معينة إلى 50 ملم، الخطوة الصورة ل70 درجة، وطول التعرض لتعيين 30 ثانية.
- تشغيل Mosflm على الصور اختبار لكم النار مع JDirector لتحديد ما هو أفضل وضوح الشمس واستراتيجية لجمع البيانات.
- جمع مجموعة بيانات كاملة يعتمد على نتائجك من Mosflm.
18. معالجة البيانات / هيكل تقدير
- تشغيل XDS / 4 معالج xscale لمعالجة البيانات.
- فتح مجموعة برامج CCP4.
- تشغيل طابعة Phaser 5 لحساب حل بديل الجزيئي باستخدام التماثل عالية نموذج البحث، عندما تكون متاحة. في هذه الحالة استخدمنا 3CW4 PDBID كنموذج البحث 6.
- تشغيل Refmac 7 إلى صقل نموذج الجزيئي الخاص بك ضد انعكاس الملحوظة التي تم جمعها في ورقة العمل. وينبغي أن يستند القرار النهائي الخروج من أعلى قذيفة والتي يحددها المعلمات التالية: R عامل> 50٪، I / سيجما> 2، واكتمال> 90٪.
- بناء نموذج الإلكترون 3 الأبعاد كثافة مع برامج الرسومات الجزيئية أبله 8.
- قبل إيداع هيكل في PDB التحقق من صحة ذلك مع MolProbity 9 برامج للتحقق من جودة هيكل هو مناسبة لترسب.
Representative Results
توضح النتائج التالية النتائج المتوقعة من البروتوكول وصفها، وفي حالة PB2، نتائج المرصودة.
باستخدام الملحن جين، تم تصميم خمسة الهدف كامل طول تسلسل الأحماض الأمينية للبوليميريز فيروس الانفلونزا PB2 الوحيدات (الشكل 2). وكان تسلسل PB2 تترجم مرة أخرى وتعرض للكثير من الخطوات الهندسة 3، مما أدى إلى كودون تسلسل منسقة الأمثل للتعبير في E. القولونية. من المنتجات iPCR (الشكل 3B)، أي ما مجموعه أربعة وثلاثين بنيات تم استنساخ بنجاح إلى تعديل pET28 نظام ناقل 10 مع N-6X صاحب محطة، SMT العلامة الانصهار باستخدام الأنابيب الاستنساخ 3 كما هو مبين في الشكل 3A. ويرد موجز لسير العمل استنساخ في الشكل 4.
بعد استنساخ ناجحة، تم اختبار بروتين تعبير الصغيرة الحجم من كل بناء في BL21 (DE3) E.الخلايا القولونية. وقد نمت الخلايا في المتوسط TB تستكمل مع Novagen بين عشية وضحاها اكسبرس 1 حبة متوسطة الحجم (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) لمدة 48 ساعة عند 20 درجة مئوية في حاضنة تهتز مجموعة في 220 دورة في الدقيقة. بعد النمو، وكان حصاد الخلايا واختبارها للتعبير البروتين للذوبان باستخدام الاستشراد الشعرية مع الفرجار LabChip 90. أربعة عشر دولة من الدول الأربع والثلاثين PB2 بنيات أدى إلى ذوبان البروتين الهدف ودخلت التخمير على نطاق واسع. وقد نمت الثقافات على نطاق واسع من كل بناء في المتوسطة TB تستكمل مع ليلة وضحاها اكسبرس 1 حبة متوسطة الحجم Novagen وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد النمو، وكان حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وتخزينها في -80 درجة مئوية. وأكد تعبير البروتين على نطاق واسع من كل ثقافة عبر تحليل SDS-PAGE (الشكل 5) قبل الشروع في تنقية واسعة النطاق.
تم استخدام الة لصنع بروتين لإجراء تنقية مواز من أربعة عشر بنيات PB2. ولست] توضيح من آلتم تشغيل أربعة عشر لتر يبني من خلال عمود النيكل وكلاب. بعد تحديد أي الكسور الواردة البروتين المستهدف بواسطة SDS-PAGE، وكان يتم تجميع الكسور المقابلة لكل عينة وتم تحديد تركيز كل من قبل A القراءة 280. وقد أجريت إزالة للعلامة صاحب، SMT 6X عن طريق إضافة ULP1 تليها غسيل الكلى بين عشية وضحاها وعمود النيكل الثاني. وقد أجريت تأكيدا لإزالة زوائد له، SMT بواسطة SDS-PAGE (الشكل 6)، وتركزت كل عينة مع 10 كيلو دالتون أنبوب الطرد المركزي Amicon الترا. بعد تركيز باستخدام أنابيب الطرد المركزي المركزي Amicon الترا، تم تشغيل كل عينة على عمود التحجيم لتحقيق نقاء البلورات. وأجري تركيز الثانية لزيادة تركيز البروتين إلى المستوى اللازم لتبلور. وتنقيته بنجاح كل أربعة عشر بنيات ودخلت حيز المحاكمات التبلور.
وقد بدأ تبلور من خلال الذوبان الاب سابقاأوزين البروتين. تم إجراء تبلور في غرفة التحكم في المناخ في 16 ° C مع لوحات مصممة خصيصا (الزمرد بيو) للجلوس قطرة بخار نشرها (الشكل 7). أجري الفحص الأولي مع أربع شاشات متناثر مصفوفة؛ JCSG +، حلف، معالج كامل، وCryoFull (الزمرد بيو)، بعد أن استراتيجية نيومان الموسعة. وكان 0.4 ميكرولتر من محلول البروتين ثم يخلط مع 0.4 ميكرولتر من crystallant (أو حل خزان) من الخزان المناظرة باستخدام 96-جيدا المدمجة لوحات تبلور جونيور (الزمرد BIO). من أربعة عشر عينات تنقيته تسعة منهم أسفرت عن بلورات المناسبة للدراسة حيود (الشكل 8). تم جمع مجموعة بيانات حيود في المنزل على خمسة من تسعة بنيات تبلورت في النحاس Kα الطول الموجي باستخدام Rigaku SUPERBRIGHT FR-E + الدورية لل-الأنود مولد الأشعة السينية مجهزة الأوسميك VariMax HF البصريات وزحل 944 + CCD كاشف (الشكل 9 ). تم معالجة كل مجموعة بيانات مع XDS / معالج xscale 4 < / سوب> وتدرج إلى التوصل إلى حل نهائي. أجريت محاولات حل عن طريق استبدال الهياكل الجزيئية خارجا مع فيزر 5 من CCP4 جناح 7. وتم الحصول على النماذج النهائية بعد التنقيح في REFMAC 7 و إعادة بناء دليل مع الطير المائي 11. تم تقييم الهياكل وتصحيحه للهندسة واللياقة البدنية مع MolProbity 9. تم تحديد ما مجموعه أربعة هياكل فرعية PB2 (الشكل 10) وأودعت في PDB. ويوضح الشكل (11) والنتيجة العامة في كل مرحلة في خط أنابيب MTPP.
الشكل 1. نظرة عامة على SSGCID مسار الجين إلى بنية للمعالجة المتوازية متعدد الاهداف في Emerald بيو.
الشكل 2. عارض المحاذاة والبروتين كونستركت وحدة التصميم في مجال البرمجيات الملحن الجينات. قاعدة الأحماض الأمينية بناء الهدف هو مبين باللون الأخضر (إطار الأوسط) وتظهر بنية truncations الموجهة من بنيات بديلة في الذهب (النافذة السفلى). ويرد محاذاة متعددة انفلونزا الفيروسية PB2 متواليات مقارنة تسلسل وعناصر البنية الثانوية من المجال C-محطة من 3CW4 PDBID. المعرفة من بنية المجال وعناصر هيكل الثانوي يسمح truncations N-محطة التي سيتم اختيارها ضمن الجينات الملحن وحدة التصميم بالنقر بزر الماوس الأيمن على بقايا الأحماض الأمينية المطلوبة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
ithin الصفحات = "دائما"> 
الشكل 3A. ويتضح الأنابيب الاستنساخ حيث يتم تضخيمه إدراج الجينات الاصطناعية (البرتقالي) من خلال تصميمه إلى الأمام (خطوط حمراء والبرتقالي) وعكس (خطوط البرتقالي والأزرق) الاشعال لتوليد إدراج مادة PCR. يتم تضخيمه وناقلات التعبير مع خطوط الاتجاه المعاكس (الأحمر والأسود ) وإلى الأمام (خطوط الأزرق والأسود) الاشعال لتوليد PCR ناقلات المواد. تسلسل محطة iPCR منتجات مكملة لتسلسل محطة من المنتجات vPCR (أحمر من iPCR يكمل الأحمر والأزرق vPCR من iPCR يكمل الأزرق من vPCR). وهذا يسمح للiPCR وvPCR المنتجات ليصلب لتشكيل البلازميدات التي يتم تكرارها على التحول إلى مضيف BL21 (DE3) E. المختصة كيميائيا الخلايا القولونية.
3B الشكل. الاغاروز تحليل هلام من iPCR المنتج يمكن أن ينظر إليها TS من الوحيدات PB2. الفشل iPCR كما العصابات خافت أو ملطخ، في حين يتم تمثيل المنتجات iPCR الناجحة التي قام بها عصابات قوية. عموما يمكن جودة المنتج iPCR تكون مرتبطة مع نجاح الاستنساخ. علامات الوزن الجزيئي في kiloDaltons. ويرد الرقم من ريمون وآخرون.، 2011 12.
الشكل 4. أجريت خطوات هندسة الجينات من الهدف PB2 البروتينات باستخدام البرمجيات الملحن الجينات. بعد إنشاء تسلسل المهندسة الحمض النووي لكل هدف، وقد صممت 6-7 بنيات بروتين بديلة لكل منها. أدت المعالجة المتوازية متعددة الهدف في الخطوات الأولية لتصميم الجينات والاستنساخ في 34 يبني، 14 منها كانت أهداف قابلة للحياة التي أنتجت بروتينات قابلة للذوبان في E. القولونية.
إعادة 5 "SRC =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
الشكل 5. ممثل تحليل SDS-PAGE التخمر نطاق واسع تظهر بروتين تعبير قوي (الحجم المتوقع من 25.76 كيلو دالتون)، ما يقرب من 50٪ قابل للذوبان (حارة 4)، وحوالي 50٪ من الانقسام العلامة 6X له في فريق الإدارة العليا من بروتين مزال (لين 7).
الشكل (6). النتائج SDS-PAGE لمدة ثلاث بنيات من الوحيدات PB2 البلمرة لين 1، الواسمات الجزيئية الوزن (المسمى على اليسار في كيلو دالتون)؛. الممرات 2 و 6، و 10، والبروتين تجميع من النيكل 1 عمود؛ الحارات 3 و 7 و 11، من خلال تدفق البروتين المشقوق في المخزن A من النيكل 2؛ الممرات 4، 8، و 12، وإزالة علامة 6X له في فريق الإدارة العليا في المخزن B من النيكل 2.
d/4225/4225fig7.jpg "/>
الرقم 7. A التخطيطي من بخار نشر بواسطة الأسلوب قطرة الجلوس. الأسلوب قطرة الجلوس لبلورة البروتين يندرج تحت فئة من بخار نشرها. هذا الأسلوب ينطوي على عينة تنقيته من البروتين ومرسب لكي تتوازن مع خزان أكبر تتضمن شروطا مماثلة في تركيز أعلى. كما يبخر الماء من عينة البروتين والتحويلات إلى الخزان، يزيد تركيز مرسب إلى المستوى الأمثل لبلورة البروتين.
الرقم 8. الكريستال بروتين من البلمرة PB2 الوحيدات من سلالة من فيروس الانفلونزا.
الشكل 9. الأشعة السينية صورة الحيود من البلمرة PB2 الوحيدات منسلالة من فيروس الأنفلونزا.
الشكل 10. المخططات الشريط من الجزيئات في وحدة غير متكافئة البلورات من 4 PB2 الهياكل. الهياكل الثانوية الملونة في نمط قوس قزح مع رموز PDB المقابلة. (أ) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (ب) 3KHW (A / المكسيك / InDRE4487/2009/H1N1) (ج) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (د) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).
الشكل 11. تحليل نتائج لإنفلونزا PB2 الأهداف وفقا للأساليب وصفها. ومتطوره.ويتضح E خط أنابيب تقرير في خمس خطوات: الاستنساخ، قابلية الذوبان، وتنقية، وتبلور هيكل المصير.
Discussion
المعالجة المتوازية متعددة الهدف
هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في اكتشاف المخدرات. ويكرس SSGCID إلى تزويد المجتمع العلمي مع هياكل البروتين ثلاثة أبعاد من مسببات الأمراض المعدية فئة AC. وجعل هذه المعلومات متاحة على نطاق واسع الهيكلية تخدم في نهاية المطاف إلى تسريع هيكل القائم على تصميم الأدوية.
الخطوة الأولى الحاسمة لنهج MTPP هو تصميم بناء. بنيات متعددة من كل البروتين المستهدف يزيد من احتمال تحديد هيكل ناجح وزيادة التحول. فلا مناص من أن بعض بنيات البروتين ستفشل خلال مراحل خط الانابيب. تنفيذ أسلوب الاستنساخ الأنابيب يعتمد أسلوب MTPP من خلال السماح للتوليد العديد من يبني في شكل 96-جيدا دون العمل خطوات تنقية مكثفة. الاقتران استنساخ الأنابيب مع القدرة على تحليل بروتين تعبير في نفس شكل 96-جيدا (الفرجار مختبررقاقة 90) يعجل مزيد من التدفق الإجمالي. الاقتران من هذه الأساليب يسمح لسرعة تحديد بنيات التي تنتج بروتين قابل للذوبان والتي تضمن نجاح إنتاج البروتين على نطاق واسع وتنقية.
أحد الجوانب الأساسية لنجاح MTPP عالية الإنتاجية هو صانع البروتين (رقم براءة الاختراع الأمريكية 6818060، الزمرد BIO) الصك. صانع البروتين هو مواز نظام السائل اللوني 24 قناة وضعت خصيصا لتعزيز كفاءة إنتاج بروتين عالية الإنتاجية والهيكلية المتعلقة الجيني التطبيقات البحثية خط أنابيب. باستخدام بروتوكول سبق وصفها لصانع البروتين، ومزايا واضحة في المقارنة إلى نظام FPLC سطر واحد. ويمكن لشخص واحد تنقية ما يصل إلى 48 هدفا في نفس الوقت ضمن فترة ثماني ساعات. في المقابل، يمكن لشخص واحد باستخدام نظام FPLC سطر واحد يطهر فقط كحد أقصى من أربعة أهداف ضمن نفس الإطار الزمني. مستويات عالية من النقاء لكل هدفتحقق مع صانع البروتين هي عامل حاسم في نجاح متزايد في وقت لاحق من البلورات البروتينية لتحليل هيكل.
القيود واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
حل هياكل ثلاثية الأبعاد بواسطة البلورات بالأشعة السينية هو جهد متعدد نظموا العديد من التحديات، واحدة منها هو عدم القدرة على الحصول على كميات كبيرة من البروتين الهدف قابل للذوبان. استراتيجية واحدة والتي يمكن تنفيذها للتغلب على مشكلة الذوبان هو استخدام مضيف التعبير البديلة مثل E. الخلايا القولونية غير قادرة على أداء العديد من حقيقية النواة التعديلات بعد متعدية الهامة. التعبير في مختلف الخميرة، وخطوط الخلية الحشرات والثدييات التي هي قادرة على أداء هذه التعديلات بعد متعدية غالبا ما تكون بديلة مناسبة. يتم التعبير عن البروتينات المستهدفة في بعض الأحيان ولكن غير قابلة للذوبان تماما في ظروف تحلل القياسية. صانع البروتين يمكن أن يكون مصدرا قيما للاختبار السريع للأوضاع تحلل الخلايا البديلةكما هو موضح في سميث وآخرون. 2011 13. هذه الاستراتيجية غالبا ما يكون ضروريا للحفاظ على الاهداف المتحركة عبر خط الانابيب. في أي خط أنابيب الجينوميات الهيكلي، وبروتوكولات موحدة قد لا تكون مناسبة لكل الهدف الذي يأتي من خلال خط أنابيب، وربما بحاجة إلى أهداف التحسين الفردية. على سبيل المثال، اخترنا لاستخدام 20٪ جلايكول الإثيلين لكل cryoprotectant. في الحالات أن هذا الشرط غير مناسب، قد cryoprotectants أو تركيزات البديل يجب أن يتم اختباره.
ونظرا للطبيعة الفريدة من كل هدف البروتين الفردية، ومعدل منظم وخطوة لا يمكن التنبؤ بها في تحديد هيكل هو التبلور. للإزاحة خط أنابيب MTPP نسبة النجاح منخفضة عادة من بلورة البروتين مع التحسين من شاشات مصفوفة متفرق الأولي. كل الكريستال الأولي ضرب من المتاحة تجاريا شاشات مصفوفة متناثر هو الأمثل مع مزيد من منشئ E-الشاشة (الزمرد BIO). تم تصميم الشاشة الأمثل عس اوند حالة ضرب الكريستال الأولية، تغيير تركيزات من المخازن المؤقتة، وأملاح، ومواد مضافة. شاشات الأمثل ناجحة تسفر عن بلورات المناسبة للدراسة الحيود وتحديد هيكل.
برنامج علم الجينوم الهيكلي طرح من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (NIAID) يوفر التمويل لالزمرد الحيوية وثلاث مؤسسات شمال غرب المحيط الهادئ الآخرين الذين هم معا SSGCID (الزمرد بيو، SeattleBiomed، جامعة واشنطن والمختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ) . وقد تم اختيار كل عضو من أعضاء الكونسورتيوم لخبرتهم في تطبيق تكنولوجيات للدولة من بين الفن المطلوبة لإنجاز أهداف البرنامج الجينوميات الهيكلية المعدية. حتى الآن، قد أودعت SSGCID 461 هياكل في الترتيب PDB على أنها سابع أكبر مساهم في العالم، وفي عام 2011، والأكثر إنتاجية. وتقدم البروتوكولات والمنهجيات من SSGCID بقصد الاستفادة منالمجتمع العلمي وإدامة البحوث من الأمراض المعدية.
Disclosures
الكتاب والعاملين من الزمرد الحيوية، وشركة
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء اتحاد SSGCID. يتم تحقيق أهداف SSGCID المحتمل بفضل جهود هائلة من جميع أعضاء الفريق في Emerald بيو. وقد تم تمويل هذا البحث في إطار العقد الاتحادي رقم HHSN272200700057C من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، والمعاهد الوطنية للصحة ووزارة الصحة والخدمات البشرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | IDT | ||
| Genes | DNA 2.0 | ||
| TE buffer | Qiagen | provided in kit | |
| 96-well half skirt PCR plates | VWR | 10011-248 | |
| PFU Master Mix | |||
| 6X Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 10X TAE | Teknova | T0280 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | |
| pET28 vector | |||
| 2-YT Broth | VWR | 101446-848 | |
| Kanamycin | Teknova | K2151 | |
| Restriction Enzymes | Fermentas | ||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Top 10 chemically comp cells | Invitrogen | C4040-06 | |
| Disposable Troughs (Sterile, 25 ml) | VWR | 89094-662 | |
| Airpore covers (Rayon films for bio cultures) | VWR | 60941-086 | |
| 24-well blocks | VWR | 13503-188 | |
| QIAvac 96 | Qiagen | 19504 | |
| BL21(DE3) cells chemcomp (phageR) | NEB | C2527H | |
| 50% Glycerol | VWR | 100217-622 | |
| TB Media | Teknova | T7060 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | ||
| 1 M Tris pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| 5 M NaCl | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Aldrich | G7893-4L | |
| CHAPS | JT Baker | 4145-01 | |
| Imidazole | Sigma | 56749-1KG | |
| TCEP | Amresco | K831-10G | |
| L-arginine | Amresco | 0877-500G | |
| Benzonase | EMD | 70746-3 | |
| Lysozyme | USB | 1864525GM | |
| 10 kDa MWCO dialysis tubing | Thermo | 68100 | |
| Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators | Millipore | UFC901024 | |
| HisTrap FF columns | GE | 17-5255-01 | |
| HiTrap Chelating columns | GE | 17/0408-01 | |
| Compact Jr crystallization plates | Emerald Bio | EBS-XJR | |
| Crystalization screens | Emerald Bio | ||
| Ethylene Glycol 100% | Emerald Bio | EBS-250-EGLY | |
| Crystal Wand Magnetic Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm | Hampton Research | HR4-955 | |
| ALS style puck | |||
| Puck Wand | |||
| Bent Tongs | |||
| Puck Pusher |
References
- Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature. PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).
- Yamada, S., et al. Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus. PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).
- Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis. BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).
- Kabsch, W. Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J.
- Kuzuhara, T., Kise, D., et al. Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue. J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).
- Murshudov, G. N., Skubàk, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).
- Cowtan, K. Recent developments in classical density modification. Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).
- Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).
- Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease. Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).
- Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification. Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).
