Summary
Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в разработке лекарственных препаратов. Занимаясь несколько целей параллельно значительно увеличивает шансы на успех для свинца открытие. В следующей статье подчеркивается, как Сиэтл структурной геномике центра инфекционных болезней использует мульти-целевого подхода для генной к определению структуры PB2 гриппа субъединицы.
Abstract
Пандемия вспышки высоко вирулентных штаммов гриппа может привести к широкомасштабным заболеваемости и смертности в популяциях человека во всем мире. В одних только Соединенных Штатах, в среднем 41 400 смертей и госпитализаций 1860000 вызваны вирусной инфекцией гриппа каждый год 1. Точечные мутации в полимераза основного белка 2 субъединиц (PB2) были связаны с адаптацией вирусной инфекции в организме человека 2. Выводы из такого исследования показали, биологическое значение PB2 как фактор вирулентности, тем самым подчеркивая его потенциал в качестве противовирусного препарата целевой.
Программа структурной геномики выдвинутые Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) предоставляет финансирование Emerald Bio и три других учреждений Тихоокеанского Северо-запада, которые вместе составляют Сиэтле структурной геномике центра инфекционных болезней (SSGCID). SSGCID посвящен обеспечению научного сообщества с Автошоуэлектронной мерной белковые структуры NIAID категории патогенов переменного тока. Создание таких структурных информацию доступной для научного сообщества служит для ускорения на основе структуры разработке лекарственных препаратов.
Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в разработке лекарственных препаратов. Занимаясь несколько целей параллельно значительно увеличивает шансы на успех нового открытия свинца, направляя путь или всей семьей белка. Emerald Bio разработала высокой пропускной способностью, Многоадресное параллельной конвейерной обработки (МТПП) для гена на элемент структуры решимость поддержать консорциума. Здесь мы описываем протоколы, используемые для определения структуры PB2 субъединицы из четырех различных штаммов гриппа А.
Protocol
Обзор протокола представлена на рисунке 1.
Молекулярная биология
1. Построить Дизайн
Использование программного обеспечения Гена Композитор спроектировать конструкцию белка и кодон разработаны синтетические последовательности гена. Использование программного обеспечения Гена Композитор был предложен подробно в другом месте 3.
- Использовать модуль просмотра Выравнивание и строительства Дизайн модуля для сравнения выравнивания белковых последовательностей белков и определить конструкцию. Совместите целевой аминокислотной последовательности как на первичном, и 3D структурные элементы из гомологов в Protein Data Bank (PDB), если таковые имеются (рис. 2).
- Используйте выравнивание информации, чтобы сделать структуру наведением конструкции конструкции, выбрав новую Термини на основе сохранения первичной структуры и 3D структур гомологов.
- Дизайн вставки ПЦР (IPCR) и векторных ПЦР (vPCR) амплимеров (клемма праймеров).
- Использование генной Cпротеин-к-ДНК алгоритм omposer, спину-переводить конструкции аминокислотной последовательности кодонов в инженерии последовательности нуклеиновой кислоты.
- Используйте соответствующий таблице кодонов (CUT) для оптимизации последовательности для экспрессии в E. палочки.
- Практически клонировать вставки в pET28 вектор модифицированы включением N-концевого 6x теги гистидин и Smt3/SUMO слитый белок, который позволяет легко очистки.
- Наведите порядок синтетического гена с ДНК и порядка 2,0 из праймеров интегрированные технологии ДНК.
2. Неполное полимеразной удлинения праймера (труба) Клонирование
- Подготовьте Грунтовки и гены
- Центрифуга поставляемые производителями планшетов, содержащих праймеров при 1000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- Принесите грунтовки концентрации до 100 мкМ и добавить 50 мкл ТЕ-буфера.
- Развести праймеров до 10 мкМ деионизированной (ДИ) воды в 96-луночных клиновой нижней пластины.
- Центрифуга от поставщика генов в 1,5 мл трубки при 1300 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- В 1,5 мл пробирки, чтобы разведений каждого праймера до 10 нг / мкл.
- Магазин праймеров и гены при -20 ° С, когда он не используется.
- Подготовка Вставить ПЦР (IPCR)
- Оттепель флакон Pfu Master Mix на льду, держать гены и праймеров при комнатной температуре.
- Создание пластина карты назначение скважин с набором праймеров и конструкции.
- Добавить 13 мкл деионизированной воды в каждую лунку 96-луночного планшета ПЦР.
- Добавляют 5 мкл вперед и 5 мкл обратного праймера для каждой реакции в 96-луночный планшет в соответствии с пластины карты, обеспечивая изменить советов между каждой лунке.
- Добавить 2 мкл каждого полноразмерного гена к соответствующему скважины в соответствии с пластиной карты.
- Добавить 25 мкл смеси Pfu мастер в каждую лунку, обеспечивая изменить советов между каждой лунке.
- Цикл реакций с использованием следующих условий ПЦР
- 95 ° С 2 мин 95 ° С 30 сек
- 50 ° С 45 сек
- 68 ° C 3 мин
- 4 ° C ∞
- Повторите шаги BD течение 25 циклов.
- Передача 10 мкл каждой реакционной IPCR на новый 96-луночный планшет ПЦР.
- Добавить 3 мкл 6X краситель нагрузки на каждом образце.
- Отдельные каждого образца на 1% TAE EtBr агарозном геле при 110 В рядом с ДНК лестнице 100-500 бит, чтобы подтвердить фрагмент усиления.
- Магазин IPCR продукт при температуре -20 ° С, когда он не используется (избежать замораживания-оттаивания как можно больше).
3. Подготовьте векторные ПЦР (vPCR)
- Начать ночной культуры преобразовано E. палочка с pET28 векторной плазмиды.
- Инокулируйте два 5 мл пробирки 2-YT бульоне с 50 мкг / мл канамицина.
- Grow культур в течение ночи при 37 ° С на шейкере при скорости 220 оборотов в минуту.
- Спин вниз культур после выращивания в течение ночи центрифугированием при 3000 оборотах в минуту в течение 15 мин.
- Используйте Qiagen КИПподготовки Spin Miniprep Kit извлечь pET28 вектор из бактериальных гранул в соответствии с инструкциями производителя.
- Настройка рестриктазы перевариваниями добываемого pET28 плазмиды.
- Добавить 2,2 мкл 10х буфера BamHI и 1 мкл BamHI и HindIII к 20 мкл pET28 вектор.
- Инкубируйте реакции в течение 1 часа при 37 ° С.
- Отдельный продукт пищеварения на геле.
- Обратитесь к шагу 2.2.10.
- Cut вектор группа из геля и очищают его с помощью извлечения QIAquick Gel Kit в соответствии с инструкциями производителя.
- Использование NanoDrop, количественной концентрации ДНК.
- Развести разрезанный вектор до 10 нг / мкл. Хранить при -20 ° С, когда он не используется.
- Подготовьте vPCR праймеров.
- Центрифуга IDT поставляется oligonucliotides течение 1 мин при 1300 оборотах в минуту.
- Принесите концентрации до 100 мкМ дистиллированной водой.
- Подготовьте 10 мкМ разбавления как прямой и обратный праймеры в 1,5 мл трубки.
- Хранить грунтовки и грунтовки разведения при -20 ° C.
- Оттепель Pfu Master Mix на льду и оттепель матрицы и праймеров, при комнатной температуре.
- Установка vPCR реакции в 96-луночный планшет ПЦР
- В первом ряду 96-луночного планшета сочетать 60 мкл прямого и обратного праймеров vPCR и 24 мкл переваривается pET28 шаблон (10 нг / мкл).
- С помощью 12-наконечник многоканальную пипетку, перенесите 12 мкл праймера и смесь шаблон мастер каждый оставшийся лунку планшета. Это должно привести к 12 мкл праймера и шаблон мастер смеси в каждой лунке пластины.
- Добавить 13 мкл деионизированной воды в каждую лунку.
- Добавить 25 мкл Master Mix Pfu в каждую лунку.
- Цикл реакций через условия ПЦР, используемый на стадии 2.2.7.
- Бассейн все vPCR реакции в 15 мл трубки сокола.
- Проверка фрагмента амплификации путем отделения 10 мкл объединенного продукта ПЦР в геле (ожидаемая длина переваренного вектора pET28составляет около 6 КБ).
- Обратитесь к шагу 2.2.10.
- Подготовка слияния пластин.
- Аликвотные 3 мкл продукта vPCR в каждую лунку 96-луночного клиновой нижней пластины.
- Магазин пластинами при температуре от -20 ° С до слияния с продуктом IPCR.
4. Слияние и IPCR vPCR продукты
- Оттепель IPCR продуктов и предварительно аликвоты vPCR 96-бы слиться планшет при комнатной температуре.
- Добавить 3 мкл каждого IPCR продукт с соответствующим лунку планшета слияния.
- Преобразование слияния пластины в десять химически компетентных клеток.
- Добавить 2 мкл каждой реакционной сливаются в единый 50 мкл трубки от поставщика химически компетентных клеток и заполните поставляемых протоколом производителя.
- Подготовьте ночных культур для каждой конструкции от преобразования пластины.
- Аликвоты 5 мл ТБ бульон (с 50 мкг / мл канамицина) с 25 мл стерильного резервуара в каждую лунку глубоких скважин блока.
- Использование SteriLe технику, выбрать изолированную колонию от каждого преобразования пластины и привить соответствующую лунку из глубокой скважины блока.
- Накройте блок с AIRPORE крышку.
- Встряхнуть блока при 220 оборотах в минуту при 37 ° С в течение ночи.
- Гранул клетки центрифугированием блок течение 30 минут при 4000 оборотов в минуту.
- Слейте надосадочную и погладить верхней части блока насухо бумажным полотенцем.
- Мини-преп использованием Qiagen 96-луночный вакуумный аппарат в соответствии с инструкциями производителя.
5. Подготовка Глицерин Запасы успешно клонировали Конструкции
- Transform успешно клонированной последовательности ДНК подтверждены в BL21 (DE3) химически компетентных клеток в соответствии с инструкциями производителя.
- Для каждой конструкции, выбрать одну изолированную колонию от BL21 (DE3) преобразования и переливая ее 1 мл 2-YT бульон (с 50 мкг / мл канамицина).
- Встряхнуть культуры при 220 оборотах в минуту в течение 3-4 ч при 37 ° С.
- Этикетка 1,5 млзащитный колпачок трубки с уникальной конструкцией идентификационный номер, клеточный штамм, и дату. Добавить 500 мкл 50%-ного глицерина и 500 мкл клеточной культуре и инвертировать несколько раз. Сразу глицерине хранить в сухом льду или в морозильнике -80 ° C.
6. Выражение Тестирование
| Лизиса Buffe R | Промывочного буфера | Буфера для элюции |
| 50 мМ Na 2 PO 4, рН 8,0 300 мМ NaCl 10 мМ имидазола 1% Tween 20 2 мМ MgCl2 0,1 мкл / мл Benzonase 1 мг / мл лизоцима | 50 мМ Na 2 PO 4, рН 8,0 300 мМ NaCl 20 мМ имидазола 0,05% Tween 20 | 25 мМ Трис, рН 8,0 300 мМ NaCl 250 мМ имидазола 0,05% Tween 20 |
* Добавить Benzonase, лизоцим,и ингибитора протеазы непосредственно перед лизиса.
- Подряд образца из раствора в глицерине на канамицин селективного агара и инкубировали в течение ночи при 37 ° С.
- Начать неиндуцирующей предварительной культуры в 96-луночных круглодонных нижнего блока; инокулята 1,2 мл ТБ бульон (с 50 мг / мл канамицина) с добавлением 0,5% раствора глюкозы с свежевыращенных E. кишечной изолировать. Расти в течение ночи встряхиванием при 220 оборотах в минуту при 37 ° С.
- После выращивания в течение ночи, начать индукции культур путем инокуляции 1,2 мл ТБ бульон (с 50 мг / мл канамицина) с добавлением Novagen Ночной экспресс Система 1 (в соответствии с протоколом производителя) с 40 мкл предварительной культуры.
- Расти мелких культур индукции при 20 ° С в течение 48 ч, встряхивании при 220 оборотах в минуту.
- Урожай клетки центрифугированием при 4000 оборотах в минуту в течение 15 минут, слейте супернатант и хранить при температуре -20 ° C в течение не менее 1 часа до обработки.
- В 96-луночный блок, ресуспендирования осадка клеток в 300 мкл буфера для лизиса. Клетки инкубируют в буфере для лизиса при комнатной температуре в течение 30 мин с последующим механическим лизис энергично встр хивани в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Уточнение неочищенного лизата центрифугированием в течение 30 минут при 4000 оборотов в минуту при 4 ° С.
- Использование многоканальной пипетки для передачи 200 мкл осветленного лизата (растворимая фракция) в 96-луночных плоскодонных нижний лоток (Qiagen). В каждую лунку, содержащую образец, добавляют 40 мкл Ni-NTA магнитных шариков (Qiagen).
- Аккуратно перемешивать пластины на качалке в течение 1 часа при 16 ° C.
- Место пластины на магнитной пластине сообщению (Qiagen) и удалить несвязанные растворимой фракции. Будьте осторожны, чтобы не пипетку любое из Ni-NTA бисером.
- Снять пластину с поста пластины и осторожно ресуспендировали бисером в 200 мкл промывочного буфера. Внесите вверх и вниз в течение 30 секунд, а затем поместить пластину обратно на посту пластины.
- Снимите промывочного буфера и повторите шаг 6,12.
- Удалите пластину от должности пластины и элюирования Ni-NTA связаны TArget белка путем промывки 50 мкл буфера для элюции течение 5 мин.
- Вернуться плоскую пластину снизу магнитной пластины пост и передать элюирования свежей 96-а V-нижней пластине.
- Передача 20 мкл элюирования свежий 96-луночный клиновой нижнюю пластину и вступает в реакцию с 1 мкл ULP1 протеазы.
- В соответствии с протоколом производителя, анализировать и Элюированную Элюированную + Ulp1 фракции методом капиллярного электрофореза использованием LabChip 90.
- Кроме того, все фракции из выражения тестирование может быть проанализирован с помощью SDS-PAGE.
7. Большой Брожение Масштаб
- С помощью стерильной кончика пипетки, чтобы получить соскоб из раствора в глицерине, прививки 100 мл ТБ бульон (с 50 мг / мл канамицина) и расти в течение ночи. Встряхнуть при 220 оборотах в минуту и 37 ° С.
- После выращивания в течение ночи, расширение предварительной культуры путем инокуляции 1 л ТБ бульон с EMD аутоиндукции решений (см. протоколу производителя) (при 50 мг / мл канамицина) в 2 л колбе с перегородкой 10 млпредкультуру (разведение 1:100).
- Встряхнуть расширенной 1 л культур при 37 ° С, изменить температуру встряхивания инкубатор при 20 ° С при оптической плотности 0,6 (OD 600) будет достигнута.
- После ночного роста, занять представитель 10 мл аликвоты из каждой конструкции для выражения тестирования.
- Урожай клеточной пасты центрифугированием при 5000 оборотах в минуту в течение 15 минут и отбросить супернатант.
- Замораживание клеточной массы при температуре -80 ° C.
Очистки белков
Буфера:
| Лизирующего буфера | Буфер (уравновешивающий) | Буфера В (элюирования) | Размеры колонки буфером |
| 25 мМ Трис, рН 8,0 200 мМ NaCl 0,5% Глицерин 0,02% ХАПС 10 мМ имидазола 1 мМ TCEP 50 мМ аргинин 5 мкл Benzonase 100 мг лизоцим 3 таблетки ингибитора протеазы (EDTA-бесплатно) | 25 мМ Трис, рН 8,0 200 мМ NaCl 10 мМ имидазола 1 мМ TCEP 50 мМ аргинин 0,25% Глицерин | 25 мМ Трис, рН 8,0 200 мМ NaCl 200 мМ имидазола 1 мМ TCEP | 25 мМ Трис, рН 8,0 200 мМ NaCl 1% Глицерин 1 мМ TCEP |
* Добавление Benzonase, лизоцим, и таблетки ингибитора протеазы друг 150 мл образец непосредственно перед лизиса.
8. Лизиса клеток
- Сделать 2 л буфера для лизиса, не добавляют лизоцим, таблетки ингибитора протеазы или бензоназы (каждого образца будут растворяться отдельно в 150 мл буфера для лизиса).
- Оттепели и ресуспендируют клеточной пасты в буфере для лизиса при массовом 1:05: объемном соотношении от энергично перемешивают в течение 30 мин при 4 ° C. Перерыв свободные куски с боков стакана с помощью чистой лопаточкой. За это время подготовить и Ni DialySIS буферов
- На льду лизиса клеток с использованием ультразвукового Misonix (70% мощности, 2 сек вкл / 1 с выкл импульсов в течение 3 мин) и нежно вихревой контейнер для предотвращения перегрева. Сохранить небольшой (200 мкл) аликвоты неочищенного лизата для последующего анализа.
- Уточнение неочищенного лизата центрифугированием при 18000 х г в течение 35 мин при 4 ° С, собирают супернатант и сохранить небольшой (200 мкл) аликвоты для последующего анализа. Магазин гранул при 4 ° С, пока не будет подтверждена белок был лизировали в растворимой фракции.
9. Предварительно перспективе Белки чайник установки
- С белок производитель включен и программное обеспечение открывать, инициализации инструмента.
- После инициализации, прикрепить один 5,0 мл GE Healthcare HisTrap FF никель-хелатной колонке (Ni колонка) на отдельной строке козловых для каждого из образцов.
- Выполнить 3-4 объемов колонки (CV) уравновешивающего буфера через каждую колонку.
- Премьер равновесия и линиями элюции буфера.
- Эквилибрели столбцов путем аспирации буфера через колонку один раз.
10. Никель 1 (Ni1) Колонка
- Промойте каждую колонку с 20 мл Milli-Q воды для удаления буфера хранения. Выполнить 5 мл буфера В и 25 мл буфера для уравновешивания.
- Загрузка осветленный лизат, содержащий солюбилизированного белка в колонки со скоростью 2 мл / мин, затем следовать по 15 мл промывки буфером А.
- Элюировать белком в ступенчатом градиенте с буферами А и В с помощью следующих соотношений почтительно: 95:5 5 мл, 5 мл 60:40, 10 мл 0:100. Сбор каждого элюирования фракции отдельно.
- Анализ: элюированных фракций сырой лизат, уточнены лизата и проточные помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Бассейн фракций, содержащих белок и использовать Nanodrop измерить 280 до примерно определить количество белка, присутствующего.
11. Расщепление ULP1
- Хранить небольшую аликвоту (250 мкл) Ni1 колонке бассейн для последующего анализа геля. Принесите остальноеиз Ni1 бассейн до 10 мл и добавляют убиквитин-подобных протеаз 1 (ULP1) в 1 мкл / 5 мг общего белка, чтобы удалить тег His-Smt аффинностью.
- Диализировать Ni1 бассейн + ULP1 против 2 л буфера в течение 4 часов при 4 ° С в 10 кДа молекулярным весом отсечки (ММО) на магнитной мешалки при 4 ° С.
- После диализа запустить SDS-ПААГ Ni1 бассейн и бассейн + Ni1 ULP1 чтобы определить, если ULP1 расщепления была успешной.
12. Никель 2 (Ni2) Колонка
- Загрузите расщепленный белок по сравнению с аналогичным колонки Ni и повторите шаг 9,3 при пониженной скорости потока 1 мл / мин. Расщепленный с тегом будет связываться с колонки и Tagless белка-мишени теперь проточные. Собирают проточные в свежем контейнера.
- Мытье Ni колонки 3 мл буфера с последующим добавлением 5 мл буфера B для элюирования все His-меченый и неспецифически связанного белка. Сбор каждой фракции отдельно.
- Выполнить SDS-ПААГ Ni2 проточные, вымыть и Ni2 элюирования фракций проверить ULP1 расщепления и PRotein присутствует в проточные. Используйте для измерения Nanodrop 280 до приблизительно определить наличие белка.
13. Обогатительный
- Концентрат Ni2 проточные (и Ni2 элюирование если белок присутствует) до 5 мл с помощью Amicon Ultra 10 кДа MWCO центрифужную пробирку. Спина в 10-минутными интервалами в 4000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. Смешать с помощью пипетки между спином, чтобы предотвратить белка от чрезмерной концентрации вдоль мембраны.
14. Гель-хроматографии (SEC)
- Установка Sephacryl S-100 10/30 GL колонка (GE Healthcare), уравновешивая с 200 мл буфера SEC при скорости потока 0,5 мл / мин AKTApurifier система (GE Healthcare).
- Подготовка 10 мл супершлейфов для использования на колонке SEC в соответствии с инструкциями производителя.
- Использование 5 мл шприц, загружать сэмплы на супершлейфов и начать перспективе SEC.
- Монитор УФ-поглощения следов при 280 нм при сборе небольшого объема FRдействий.
- Выполнить SEC фракции с помощью SDS-PAGE.
- Бассейн SEC фракций, демонстрирующих самые высокие полосы интенсивности.
- Концентрат SEC объединенных фракций. Обратитесь к шагу 13.1.
- Алиготе белка в 100 мкл образцов, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С.
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
15. Кристаллизации белков
- Предварительного заполнения каждого резервуара 96-а компактной пластинке кристаллизации Jr (Emerald BIO) с 80 мкл кристаллизации экран (Emerald BIO) выбора.
- Развести белка с размера буфера 2-20 мг / мл и хранят на льду.
- Отказаться от 0,4 мкл белка и 0,4 мкл кристаллизации экран в каждой из 96 скважин и охватывают с кристально чистой уплотнительная лента (Манко).
- Храните пластины при 16 ° С при проверке кристаллизации белков периодически в течение ближайших нескольких недель при вскрытии микроскопом.
16. Кристалл Сбор </ P>
- Создание криопротекторов от маточного раствора и этиленгликоль. Вырезать ясно ленту, закрывающую хорошо с кристаллом белка-мишени. Чтобы пустой, добавьте 1,6 мкл соответствующего кристаллизации состояние и в сочетании с 0,4 мкл этиленгликолем с получением конечной концентрации 20% этиленгликоля и 80% кристаллизации состоянии. Примечание: для оптимизации кристалл дифракционный попробовать различные криопротекторов, таких как глицерин, масла, низкой ММ полиэтиленгликоли, и / или в различном процентном соотношении от криопротекторов.
- Перед сбором остыть ALS-стиль шайбу в сосуд Дьюара, заполненный жидким азотом и крышки с крышкой.
- Урожай кристалла путем размещения CryoLoop с внутренним диаметром соответствующий размер кристалла на магнитные палочки Кристалл (Hampton Research) и совок его непосредственно из скважины раствора.
- Немедленно погрузите CryoLoop с собранный кристалл в криопротекторе затем погрузите в ALS-стиле шайбу Ледяная вспышка CRystal. Повторите эти действия для нужного количества кристаллов.
17. Кристалл Скрининг / сбор данных
- После уборки полное использование палочки шайбу поместить магнитную крио шайбу крышки на ALS шайбу. С согнутыми щипцы, перевернуть с ног на голову шайбу.
- Передача шайбу актер Ригаку Дьюара, винт толкателя шайба на шайбу, и удар с крышкой оставив его в сосуд Дьюара с булавками лицевой стороной вверх.
- Использование программного обеспечения JDirector, экран каждого кристалла под следующими параметрами: Ширина щели установлено на 0,5 градусов, детектор расстояние установлено на 50 мм, Шаг до 70 градусов, а также воздействие длины устанавливается на 30 сек.
- Выполнить Mosflm на тест изображения, отснятые с JDirector определить, что лучшими кристалла и стратегию для сбора данных.
- Соберите полный набор данных на основе ваших результатов Mosflm.
18. Обработка данных / определение структуры
- Запуск XDS / XSCALE 4 для обработки набора данных.
- Откройте CCP4 набор программного обеспечения.
- Выполнить Phaser 5 рассчитать молекулярный раствор замены помощью высокой модели поиска гомологии, если таковые имеются. В этом случае мы использовали PDBID 3CW4 как поиск модели 6.
- Выполнить Refmac 7 до точного молекулярной модели с наблюдаемыми отражение собраны в наборе данных. Окончательное решение должно быть основано офф самого высокого корпуса и определяется следующими параметрами: R фактор> 50%, I / Sigma> 2, и полнота> 90%.
- Построить 3-мерная модель электронной плотности с молекулярной графических программ COOT 8.
- Перед нанесением структуры в PDB проверить его с MolProbity 9 программное обеспечение, чтобы убедиться, что качество структуры подходит для осаждения.
Representative Results
Следующие результаты иллюстрируют ожидаемые результаты описанного протокола, и в случае PB2, наблюдаемые результаты.
Использование гена композитор, пять полнометражных целевой аминокислотной последовательности полимеразы гриппа PB2 субъединицы вируса были разработаны (рис. 2). PB2 последовательности обратной трансляции и подвергали многих шагов инженерной 3, в результате чего кодона последовательности согласованных оптимизированные для экспрессии в E. палочки. Из продуктов IPCR (рис. 3б), в общей сложности тридцать четыре конструкции были успешно клонировали в модифицированный вектор pET28 системы 10 с N-концевым 6х His-Smt тег сплав использованием труб клонирование 3, как показано на фиг.3а. Краткая информация о клонировании рабочий процесс представлен на рисунке 4.
После успешного клонирования, микро-масштабе экспрессии белка каждой конструкции была испытана в BL21 (DE3) E.кишечной клетки. Клетки выращивали в ТБ среде с добавлением Novagen Ночной экспресс 1 средний (в соответствии с протоколом производителя) в течение 48 часов при 20 ° C при встряхивании на инкубаторе при 220 оборотах в минуту. После культивирования клетки собирали и тестировали на экспрессии растворимого белка с помощью капиллярного электрофореза с суппорт LabChip 90. Четырнадцать из тридцати четырех PB2 конструкций привело к растворимым белком-мишенью и вступил крупномасштабных брожения. Крупномасштабные культур каждой конструкции были выращены в ТБ среде с добавлением Ночной экспресс Novagen в 1 средний в соответствии с протоколом производителя. После культивирования клетки собирали центрифугированием и хранили при -80 ° С. Крупномасштабные экспрессии белка каждой культуры была подтверждена с помощью SDS-PAGE анализ (рис. 5) перед выполнением крупномасштабных очистки.
Белки чайник был использован для проведения параллельной очистки четырнадцать PB2 конструкций. Очищенная лизатам др.L четырнадцать конструкции были проходить через никель-хелатной колонке. После определения того, какие фракции содержат белок-мишень в ДСН-ПААГ, соответствующие фракции объединяли для каждого образца и концентрацию каждого определялась 280 считывания. Удаление 6х His-Smt тег проводили добавление ULP1 последующим диализа в течение ночи и второй столбец никель. Подтверждение His-Smt тег удаление проводили SDS-PAGE (фиг. 6), и каждый образец концентрировали на Amicon 10 кДа Ультра центрифужную пробирку. После концентрирования помощью Amicon Ультра центрифужные пробирки, каждый образец был запущен на размеры колонки для достижения кристаллографической чистоты. Вторая концентрация были проведены для повышения концентрации белка до уровня, необходимого для кристаллизации. Все четырнадцать конструкции были успешно очищается и вступил в кристаллизации испытаний.
Кристаллизацию инициируют оттаиванием ранее фрОзень белка. Кристаллизация проводилась в условиях контролируемой комнате при 16 ° С со специально разработанными пластин (Emerald био) для сидения падение диффузии водяного пара (рис. 7). Первоначальный отбор проводился с четырьмя разреженных матриц экранов; JCSG +, пакт, мастер полном объеме, и CryoFull (Emerald BIO), после расширенной стратегии Ньюмен. 0,4 мкл раствора белка была затем смешивали с 0,4 мкл crystallant (или резервуар раствора) из соответствующего резервуара использованием 96-луночных Компактный младший кристаллизации пластин (Emerald Bio). Из четырнадцати очищенные образцы девять из них дали кристаллы, пригодные для исследования дифракции (рис. 8). В доме дифракции набор данных был собран на пяти из девяти конструкциями кристаллизовались при Cu К диапазон частот с помощью Ригаку SuperBright FR-E + с вращающимся анодом рентгеновский генератор оснащен осмиевой VARIMAX HF оптики и Сатурн 944 + CCD детектором (рис. 9 ). Каждый набор данных был обработан с XDS / XSCALE 4 < / Вир> и масштабируется до принятия окончательного решения. Попытки решить структур молекулярного замещения проводились с Phaser 5 из CCP4 люкс 7. Окончательные модели были получены после уточнения в REFMAC 7 и ручное восстановление с Кут 11. Структуры были оценены и с поправкой на геометрию и фитнес-центр с MolProbity 9. Общей сложности четыре структуры PB2 субъединицы были определены (рис. 10) и хранение в PDB. Рисунок 11 иллюстрирует общий результат на каждом этапе в трубопровод МТПП.
Рисунок 1. Обзор SSGCID гена на элемент структуры путем для нескольких целей параллельной обработки на Изумрудном Bio.
Рисунок 2. Выравнивание и просмотра Белки Построить модуль проектирования программного обеспечения в генной Composer. Аминокислотный построить базу целевых показана на зеленый (среднее окно) и структуры управляемых усечения альтернативных конструкций показаны на золото (нижнее окно). Выравнивание нескольких гриппа вирусного PB2 последовательности показана сравнению с последовательностью и элементов вторичной структуры С-концевой домен из PDBID 3CW4. Знание доменной структуры и элементы вторичной структуры позволяет N-концевые усечения должны быть выбраны в течение расчетного модуля композитор Гена щелкнув правой кнопкой мыши на нужном аминокислотный остаток. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3а. Труб клонирование проиллюстрировано, где синтетический вставки гена (оранжевый) усиливается предназначенный вперед (красно-оранжевого линии) и обратный (оранжево-синие линии) праймеры для генерации вставить ПЦР материала. Вектор экспрессии амплифицированных с обратным (красно-черных линий ) и вперед (сине-черные линии) затравки при векторе ПЦР материала. Конечных продуктов последовательностей IPCR дополняют концевые последовательности продуктов vPCR (красный IPCR дополняет красный vPCR и синий IPCR дополняет синее vPCR). Это позволяет IPCR и vPCR продукты для отжига с образованием плазмиды, которые реплицируются на превращение в хозяина BL21 (DE3) химически компетентных E. кишечной клетки.
Рисунок 3b. Агарозном геле анализ IPCR производства тс из PB2 субъединицы. IPCR неудачи можно рассматривать как слабые или грязный полосы, в то время как успешные продукты IPCR представлены надежные групп. IPCR качества продукции в общем случае может быть связано с клонирование успеха. Молекулярные маркеры вес в килодальтонах. Рисунок воспроизведен из Raymond соавт., 2011 12.
Рисунок 4. Генноинженерные шаги целевых PB2 белка проводили с использованием программного обеспечени дл генного композитора. После инженерии последовательности нуклеиновой кислоты была создана для каждого целевого 6-7 альтернативные конструкции белка были разработаны для каждого из них. Многоцелевой параллельной обработки на начальных этапах проектных и клонирования генов привело к конструкции 34, 14 из которых были жизнеспособны цели, которые производятся растворимых белков в E. палочки.
Re 5 "SRC =" / files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Представитель SDS-PAGE анализа больших масштабов ферментацию показывает сильную экспрессию белка (ожидаемый размер 25,76 кДа), что примерно на 50% растворимый (дорожка 4) и около 50% расщепление 6х His-метку из Smt элюированный белок (дорожка 7).
Рисунок 6. SDS-PAGE результаты для трех конструкций полимеразы PB2 субъединицы Lane 1, молекулярно-массового маркеров (обозначенный в левой кДа). Дорожки 2, 6 и 10, объединенных белка из никеля 1 колонны; дорожках 3, 7 и 11, проточный расщепленного белка в буфере из никеля 2; дорожки 4, 8 и 12, удаление 6х His-Smt тег в буфер Б из никеля 2.
d/4225/4225fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Схема диффузии паров сидит капельным методом. Капельным методом сидели для кристаллизации белков подпадает под категорию диффузии пара. Этот способ влечет за собой очищенный образец белка и осадителя, чтобы уравновесить с большой резервуар, содержащий аналогичных условиях в более высокой концентрации. Поскольку вода испаряется из образца белка и переводах в водохранилище, осадка концентрация увеличивается до оптимального уровня для кристаллизации белков.
Рисунок 8. Белковых кристаллов полимеразы PB2 субъединицы из штамма вируса гриппа.
Рисунок 9. Рентгеноструктурный изображение полимеразы PB2 субъединицыштамма вируса гриппа.
Рисунок 10. Лента диаграммы молекул в кристалле асимметричный блок 4 PB2 структур. Вторичные структуры окрашены в радужной шаблон с соответствующими кодами PDB. (А) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (б) 3KHW (A / Мексика / InDRE4487/2009/H1N1) (с) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (D) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).
Рисунок 11. Результат анализа для гриппа PB2 цели способами, описанными. Структурнотрубопровода электронной определение проиллюстрировано на пять шагов: клонирование, растворимость, очистки, кристаллизации и определения структуры.
Discussion
Многоцелевой Параллельная обработка
Структура проектирования на основе наркотиков играет важную роль в лекарственных препаратах. SSGCID посвящен обеспечению научного сообщества с трехмерной структуры белка из NIAID категории патогенов переменного тока. Создание таких структурных широкого доступа к информации, в конечном счете служат для ускорения на основе структуры разработке лекарственных препаратов.
Первым важным шагом подхода МТПП является конструкцией дизайна. Несколько конструкций каждой целевой белок увеличивает вероятность успешного определения структуры и увеличивает поворот. Это неизбежно, что некоторые белки конструкции не удастся во время этапа трубопровода. Реализация метода трубы клонирование поддерживает MTPP метод, позволяя генерации много конструкций в 96-луночном формате без трудоемких стадий очистки. Сопряжение PIPE клонирования с возможностью анализа экспрессии белков в том же 96-луночный формат (суппорт ЛабораторииЧип 90) далее ускоряет общий поток. Спаривание этих методов обеспечивает быструю идентификацию конструкций, которые производят растворимого белка, который обеспечивает успех крупномасштабного производства и очистки белков.
Важным аспектом для успеха МТПП высокой пропускной представляет собой белок, чайник (патент США № 6818060, изумруд BIO) инструмента. Белки Maker представляет собой 24-канальный параллельный жидкостной хроматографии система, разработанная специально для повышения эффективности высокой пропускной производства белков и связанных с ними структурных геномных исследовательских задач трубопровода. С помощью описанных выше протоколом для белка чайник, преимущества очевидны по сравнению с одной системы FPLC линии. Один человек может очистить до 48 целей в пределах параллельной восемь часов. В отличие, один человек с помощью одной системы FPLC линия может только очищают не более четырех целей в те же сроки. Высокие уровни чистоты для каждой целевойдостигнуты с белком в данной программе являются критическим фактором в более поздних успех растущей белковых кристаллов для структурного анализа.
Ограничения и устранение неисправностей
Решение трехмерной структуры с помощью рентгеновской кристаллографии многоступенчатая усилий со многими проблемами, одной из которых является невозможность получения большого количества растворимого белка-мишени. Одна из стратегий, которые могут быть реализованы, чтобы преодолеть растворимость проблемы является использование альтернативного вида микроорганизмов, как E. кишечной клетки не способны выполнять несколько важных эукариотических пост-трансляционных модификаций. Выражение в различных дрожжей, насекомых и млекопитающих клеточных линий, которые способны выполнять эти посттрансляционных модификаций часто приемлемой альтернативой. Белки-мишени иногда выражаются, но полностью нерастворимые в стандартных условиях лизиса. Белки Maker может быть ценным ресурсом для быстрого тестирования альтернативных условиях лизиса клеток, как описано в Смит и др.. 2011 13. Эта стратегия часто необходимо держать целей, движущихся по трубопроводу. В любом структурной геномики трубопровода, стандартизированные протоколы не могут быть пригодны для каждой цели, которая поставляется по трубопроводу и задач может потребоваться отдельные оптимизации. Например, мы решили использовать 20% этиленгликоля для каждого криопротекторе. В случаях, когда это условие не подходит, альтернативные криопротекторы или концентраций возможно, должны быть проверены.
Из-за уникального характера каждого отдельного целевой белок, ограничивающий скорость и непредсказуемым шагом в определении структуры кристаллизации. Смещения МТПП трубопровода обычно низкого успеха кристаллизации белков с оптимизацией от начальной редкие экраны матрицы. Каждый исходный кристалл ударил из коммерчески доступных экранов редкие матрицы дальнейшая оптимизация E-экран Builder (Emerald BIO). Оптимизация экран предназначен ARкруглый условие начального удара кристаллов, изменение концентрации буферов, солей и добавок. Успешная оптимизация экранов получить кристаллы, пригодные для дифракционных исследований и определения структуры.
Программа структурной геномики выдвинутые Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) предоставляет финансирование Emerald Bio и три других Тихоокеанском Северо-Западе учреждений, которые вместе являются SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, Университета Вашингтона и Pacific Northwest National Laboratory) . Каждый член консорциума была выбрана за их опыт в применении государством в самых современных технологий, необходимых для достижения целей NIAID структурной геномики программы. На сегодняшний день SSGCID на хранение 461 структур в PDB рейтинге его как седьмой по величине вкладчиком в мире, и в 2011 году, наиболее продуктивным. Протоколы и методологии SSGCID снабжены намерением управлятьнаучного сообщества и увековечения исследования инфекционных заболеваний.
Disclosures
Авторы являются сотрудниками Emerald Bio, Inc
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов SSGCID консорциума. Достижение целей в SSGCID стало возможным благодаря огромным усилиям всех членов команды в Изумрудном Bio. Это исследование было профинансировано в соответствии с Федеральным HHSN272200700057C договору № от Национального института аллергии и инфекционных болезней, Национальные институты здравоохранения и Департамент здравоохранения и социальных служб.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | IDT | ||
| Genes | DNA 2.0 | ||
| TE buffer | Qiagen | provided in kit | |
| 96-well half skirt PCR plates | VWR | 10011-248 | |
| PFU Master Mix | |||
| 6X Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 10X TAE | Teknova | T0280 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | |
| pET28 vector | |||
| 2-YT Broth | VWR | 101446-848 | |
| Kanamycin | Teknova | K2151 | |
| Restriction Enzymes | Fermentas | ||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Top 10 chemically comp cells | Invitrogen | C4040-06 | |
| Disposable Troughs (Sterile, 25 ml) | VWR | 89094-662 | |
| Airpore covers (Rayon films for bio cultures) | VWR | 60941-086 | |
| 24-well blocks | VWR | 13503-188 | |
| QIAvac 96 | Qiagen | 19504 | |
| BL21(DE3) cells chemcomp (phageR) | NEB | C2527H | |
| 50% Glycerol | VWR | 100217-622 | |
| TB Media | Teknova | T7060 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | ||
| 1 M Tris pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| 5 M NaCl | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Aldrich | G7893-4L | |
| CHAPS | JT Baker | 4145-01 | |
| Imidazole | Sigma | 56749-1KG | |
| TCEP | Amresco | K831-10G | |
| L-arginine | Amresco | 0877-500G | |
| Benzonase | EMD | 70746-3 | |
| Lysozyme | USB | 1864525GM | |
| 10 kDa MWCO dialysis tubing | Thermo | 68100 | |
| Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators | Millipore | UFC901024 | |
| HisTrap FF columns | GE | 17-5255-01 | |
| HiTrap Chelating columns | GE | 17/0408-01 | |
| Compact Jr crystallization plates | Emerald Bio | EBS-XJR | |
| Crystalization screens | Emerald Bio | ||
| Ethylene Glycol 100% | Emerald Bio | EBS-250-EGLY | |
| Crystal Wand Magnetic Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
| Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm | Hampton Research | HR4-955 | |
| ALS style puck | |||
| Puck Wand | |||
| Bent Tongs | |||
| Puck Pusher |
References
- Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature. PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).
- Yamada, S., et al. Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus. PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).
- Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis. BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).
- Kabsch, W. Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. Phaser crystallographic software. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).
- Kuzuhara, T., Kise, D., et al. Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue. J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).
- Murshudov, G. N., Skubàk, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).
- Cowtan, K. Recent developments in classical density modification. Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).
- Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).
- Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).
- Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease. Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).
- Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification. Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).
