En oversigt af protokollen er vist i Figur 1.. Molekylær Biologi 1.. Construct Design Brug Gene Composer software til at designe protein konstruere og codon manipuleret syntetiske gensekvenser. Brugen af Gene Composer software er blevet tilbudt i detaljer andetsteds 3.. Brug Justering Viewer modulet og Construct design Modul at sammenligne protein alignments og definere protein konstruktion. Juster mål aminosyresekvens til både den primære og 3D strukturelle elementer fra homologer i protein data bank (PDB), hvis den er tilgængelig (figur 2). Brug tilpasningen oplysninger til at foretage struktur-styrede konstruere designs ved at vælge nye termini baseret på bevarelse af den primære struktur og 3D strukturer homologer. Design insert PCR (IPCR) og vektor-PCR (vPCR) amplimere (klemme primere). Brug Gene Composer s protein-til-DNA-algoritme, back-oversætte konstruktionen aminosyresekvens i codon manipuleret nukleinsyresekvens. Brug den korrekte kodonanvendelse tabel (CUT) for at optimere sekvens til ekspression i E. coli. Stort set klone insertet i pET28 vektor modificeret til at inkorporere en N-terminal 6x histidinmærke og Smt3/SUMO fusionsprotein der giver mulighed for nem oprensning. Placer syntetisk gen ordre med DNA 2.0 og bestille primere fra integrerede DNA Technologies. 2.. Polymerase Ufuldstændig primerforlængelse (PIPE) Kloning Forbered Primere og gener Centrifuger producents plader indeholdende primere ved 1.000 rpm i 1 min. Bring primerkoncentration til 100 uM og der tilsættes 50 ul TE buffer. Fortynd primere til 10 uM med deioniseret (DI) vand i en 96-brønds V-bundplade. Centrifuger producents gen i en 1,5 ml rør ved 1.300 rpm i 1 min. <li> Brug TE-puffer, bringe DNA-koncentration af hvert rør til 50 ng / ul. I 1,5 ml rør, gør fortyndinger af hver primer til 10 ng / ul. Store primere og gener ved -20 ° C, når de ikke er i brug. Forbered Indsæt PCR (IPCR) Optø et hætteglas Pfu Master Mix på is, holde gener og grundere ved stuetemperatur. Opret en pladediagram tildele brønde til et sæt primere og konstruere. Tilføj 13 pi af DI vand i hver brønd af en 96-brønds PCR-plade. Tilsættes 5 ul fremad og 5 pi af revers primer til hver reaktion i 96-brønds plade ifølge pladediagram, sikrer at ændre tip mellem hver brønd. Tilsæt 2 ul af hver fuld længde genet til dens korrekte godt efter pladen kortet. Tilsæt 25 gl Pfu masterblandingen hver brønd, sikrer at ændre tip mellem hver brønd. Cycle reaktionerne ved hjælp af følgende PCR-forhold: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 sek 50 ° C 45 sek 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Gentag trin bd i 25 cyklusser. Overfør 10 ul af hver IPCR reaktion på en ny 96-brønds PCR-plade. Tilføj 3 ul 6X belastning farvestof til hver prøve. Adskil hver prøve på en 1% TAE EtBr agarosegel ved 110 V ved siden af en 100-500 bps DNA stigen at bekræfte fragment forstærkning. Opbevar IPCR produkt ved -20 ° C, når de ikke er i brug (undgå fryse tø så meget som muligt). 3.. Forbered Vector PCR (vPCR) Start overnight kultur af transformeret E. coli med pET28 vektorplasmid. Podes to 5 ml rør af 2-YT bouillon med 50 ug / ml kanamycin. Grow kulturer natten over ved 37 ° C i ryster ved 220 rpm. Spin ned kulturer efter vækst natten ved centrifugering ved 3.000 rpm i 15 min. Brug en Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit at udvinde pET28 vektor fra bakterielle pellets i henhold til producentens anvisninger. Setup restriktionsenzymfordøjelser af ekstraheret pET28 plasmid. Tilføj 2.2 pi 10X BamHI-buffer og 1 pi BamHI og HindIII til 20 ul pET28 vektor. Inkuber reaktion i 1 time ved 37 ° C. Separat fordøjelse produkt på en gel. Der henvises til trin 2.2.10. Skær vektor band fra gel og rense det ved hjælp af QIAquick gelekstraktionskit henhold til producentens anvisninger. Ved hjælp af en NanoDrop, kvantificere DNA koncentration. Fortynd skåret vektor og 10 ng / ul. Opbevar ved -20 ° C, når den ikke er i brug. Forbered vPCR primere. Centrifuge IDT leverede oligonucliotides i 1 min ved 1.300 rpm. Bring koncentrationen til 100 uM med DI vand. Forbered 10 uM fortynding af både frem og bak primere i en 1,5 ml rør. Store primere og primer fortyndinger ved -20 ° C. Tø Pfu Master Mix på is og tø skabelon og primere ved stuetemperatur. Setup vPCR reaktioner i en 96-brønds PCR-plade: I første række på en 96-brønds plade kombinerer 60 ul af både frem og bak vPCR primere og 24 pi fordøjet pET28 skabelon (10 ng / ul). Med en 12-spids multikanalpipette, 12 ul af primer og template masterblandingen overføre til hver resterende godt af pladen. Dette burde resultere i 12 pi af primer og template stamblandingen i hver brønd i pladen. Tilføj 13 pi af DI vand til hver brønd. Tilsæt 25 gl Pfu Master Mix til hver brønd. Cycle reaktionerne gennem PCR betingelser, der anvendes i trin 2.2.7. Pool alle de vPCR reaktioner i en 15 ml Falcon rør. Kontroller fragment forstærkning ved at adskille 10 pi pooled PCR-produkt på en gel (forventet længde spaltet pET28 vektorer cirka 6 kb). Der henvises til trin 2.2.10. Forbered fusionere plader. Alikvot 3 pi vPCR produkt i hver brønd i en 96-brønds V-bundplade. Opbevar plader på -20 ° C, indtil fusionerer med IPCR produkt. 4.. Flet IPCR og vPCR Products Tø IPCR produkter og præ-alikvoter vPCR 96-brønds fusionere plade ved stuetemperatur. Tilføj 3 ul af hvert IPCR produkt til sin respektive brønd sammenfletningen pladen. Omdan fusionere plade i Top Ti kemisk kompetente celler. Tilsæt 2 ul af hver merge reaktion i en enkelt 50 gl tube producents kemisk kompetente celler og fortsætte med producentens medfølgende protokol. Forbered overnatskulturer for hver konstruktion fra transformation plade. Alikvot 5 ml TB bouillon (med 50 ug / ml kanamycin) fra en 25 ml steril beholder i hver brønd i en dyb brønd blok. Brug Sterile teknik, vælge en isoleret koloni fra hver transformation plade og pode den relevante brønd i dybe brønd blok. Dæk blokken med en Airpore dæksel. Ryst blok ved 220 rpm ved 37 ° C natten over. Pellet celler ved centrifugering blokken i 30 minutter ved 4.000 omdrejninger pr. Hæld supernatanten og dup toppen af blokken tørt med en papirserviet. Mini-prep anvendelse af en Qiagen 96-brønds vakuum apparatet ifølge producentens anvisninger. 5.. Forberedelse Glycerol Lagre af succesfuldt Klonede Constructs Transformering held klonede sekvens valideret DNA i BL21 (DE3) kemisk kompetente celler ifølge producentens anvisninger. For hver konstruktion, vælge en enkelt isoleret koloni fra BL21 (DE3) transformation og podes i 1 ml 2-YT-bouillon (med 50 ug / ml kanamycin). Ryste kulturer ved 220 rpm i 3-4 timer ved 37 ° C. Mærke et 1,5 mlrør med skruelåg med den unikke konstruktion identifikationsnummer, cellestamme og dato. Tilsæt 500 ml 50% glycerol og 500 pi af cellekultur og vend adskillige gange. Øjeblikkelig lagring glycerol lager på tøris eller i en -80 ° C fryser. 6.. Expression Testing Lysis Buffe r Wash Buffer Elution Buffer 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCI 10 mM Imidazol 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 gl / ml Benzonase 1 mg / ml lysozym 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCI 20 mM Imidazol 0,05% Tween 20 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCI 250 mM Imidazol 0,05% Tween 20 * Add Benzonase, lysozym,og proteaseinhibitor umiddelbart før lysering. Streak en prøve fra glycerol lager på kanamycin selektiv agar og inkuberes natten over ved 37 ° C. Start et ikke-inducerende præ-kultur i en 96-brønds rundbundet blok, podes 1,2 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) suppleret med 0,5% glucose med en frisk dyrket E. coli isolere. Grow overnight ryster ved 220 rpm ved 37 ° C. Efter vækst natten, begynde induktion kulturer ved at pode 1,2 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) suppleret med Novagen Natekspressen System 1 (ifølge producentens protokol) med 40 ul af præ-kultur. Grow de små induktion kulturer ved 20 ° C i 48 timer, ryster ved 220 rpm. Harvest celler ved centrifugering ved 4.000 rpm i 15 min, hæld supernatanten og opbevares ved -20 ° C i mindst 1 time inden behandling. I 96-brønds blok, resuspender cellepellets i 300 pi lysisbuffer. </li> Cellerne inkuberes i lysepuffer ved stuetemperatur i 30 min efterfulgt af mekanisk lysering ved kraftig rystning i 30 minutter ved stuetemperatur. Præcisere rålysat ved centrifugering i 30 minutter ved 4.000 rpm ved 4 ° C. Brug en multikanals pipette til at overføre 200 pi af den klarede lysat (opløselig fraktion) til en 96-brønds fladbundet bakke (Qiagen). For hver brønd indeholdende en prøven, tilsættes 40 ul Ni-NTA magnetiske perler (Qiagen). Ryst forsigtigt pladen på en rocker i 1 time ved 16 ° C. Placer pladen på et magnetisk indlæg plade (Qiagen) og fjern ubundne fraktion. Pas på ikke pipetteres nogen af de Ni-NTA-perler. Tag pladen fra posten pladen og forsigtigt resuspenderet perlerne i 200 pi vaskebuffer. Pipetteres op og ned i 30 sekunder og derefter placere pladen tilbage på posten plade. Fjern vaskebufferen og gentag trin 6.12. Fjern pladen fra post plade og elueres Ni-NTA bundet target protein ved vask med 50 ul elueringspuffer i 5 min. Returnere flad bundplade til magnetisk indlæg plade og overføre elueringen til en frisk 96-brønds V-bundplade. Overfør 20 ul af elueringen til en frisk 96-brønds V-bundplade og reagere med 1 pi ULP1 protease. Ifølge producentens protokol, det eluerede og elueret + Ulp1 fraktionen analysere ved kapillarelektroforese hjælp af en LabChip 90. Alternativt kan alle fraktioner fra udtrykket test analyseres via SDS-PAGE. 7.. Large Scale Fermentering Brug en steril pipettespids at opnå en skraber fra et glycerol-bestand, pode 100 ml TB bouillon (med 50 mg / ml kanamycin) og vokse natten over. Ryst ved 220 rpm og 37 ° C. Efter vækst natten, udvide præ-kultur ved inokulering 1 L TB bouillon med EMD autoinduktionen opløsninger (se producentens protokol) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L forvirret kolbe med 10 ml afpræ-kultur (1:100 fortynding). Ryst de udvidede 1 L kulturer ved 37 ° C, ændre temperaturen af rysteinkubator til 20 ° C, når en optisk densitet på 0,6 (OD600) er nået. Efter vækst natten, tage en repræsentativ 10 ml alikvot fra hver konstruktion til ekspression test. Høst cellepasta ved centrifugering ved 5.000 rpm i 15 min og kassér supernatanten. Freeze cellepasta ved -80 ° C. Proteinoprensning Buffere: Lysis Buffer Buffer A (Ligevægtsindstilling) Buffer B (eluering) Dimensionering Column Buffer 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM Imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 5 pi Benzonase 100 mg Lysozym 3 proteasehæmmer Tabletter (EDTA-fri) 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 10 mM Imidazol 1 mM TCEP 50 mM arginin 0,25% glycerol 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 200 mM Imidazol 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCI 1% glycerol 1 mM TCEP * Tilføj Benzonase, lysozym og proteasehæmmere tabletter til hver 150 ml prøve umiddelbart før lysering. 8.. Cellelyse Gør 2 L lysisbuffer, ikke tilføje lysozym, proteasehæmmere tabletter eller benzonase (hver prøve vil blive lyseret separat i 150 ml lysisbuffer). Thaw og resuspender celle indsætte lysis buffer ved en 1:5 masse: volumen-forholdet ved kraftig omrøring i 30 min ved 4 ° C. Break bidder løs fra siderne af bægerglasset med en ren spatel. I løbet af denne periode forberede Ni og dialysis Buffere På is, lysere cellerne ved hjælp af en Misonix sonikator (70% effekt, 2 sek on / 1 sek off pulser for 3 min), og hvirvl forsigtigt container for at undgå overophedning. Gem et lille (200 ul) portion af rålysat til fremtidig analyse. Tydeliggøre rålysat ved centrifugering ved 18.000 xg i 35 min ved 4 ° C, indsamle supernatanten og gemme en lille (200 ul) portion til fremtidig analyse. Opbevares pellet ved 4 ° C, indtil det bekræftes proteinet er blevet lyseret i den opløselige fraktion. 9.. Pre-run Protein Maker Setup Med proteinet maker tændt og softwaren åbne initialisere instrumentet. Når initialiseret, vedhæfte et 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelat søjle (Ni søjle) på en separat linje i gantry for hver af prøverne. Kør 3-4 søjlevolumener (CV) ækvilibreringspuffer gennem hver kolonne. Prime ækvilibrering og elueringspuffer linjer. Equilibrspiste kolonnerne ved sugning buffer A gennem kolonnen gang. 10.. Nikkel 1 (NI1) Kolonne Vask hver kolonne med 20 ml Milli-Q vand for at fjerne storage buffer. Løb 5 ml buffer B og 25 ml buffer A for ligevægt. Læg den klaret lysat indeholdende opløst protein i kolonnerne med en hastighed på 2 ml / min følg derefter med en 15 ml vask med buffer A. Eluere bundne protein i en trinvis gradient med buffere A og B ved følgende forhold ærbødigt: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Saml hver elueringsfraktion separat. Analyser: eluerede fraktioner, rålysat, afklaret lysate og gennemstrømning ved SDS-PAGE. Pool fraktioner indeholdende protein og bruge en NanoDrop at måle A280 til omtrent bestemme mængden af protein til stede. 11.. ULP1 Spaltning Hold en lille portion (250 ul) af NI1 kolonne pulje til efterfølgende gelanalyse. Bringe restenaf NI1 pulje til 10 ml og tilsættes ubiquitin-lignende protease 1 (ULP1) ved 1 gl / 5 mg totalt protein for at fjerne His-SMT affinitetsmærke. Dialysere NI1 pool + ULP1 mod 2 liter puffer A i 4 timer ved 4 ° C i en 10 kDa molekylvægt (MWCO) på en røre plade ved 4 ° C. Efter dialyse kørt SDS-PAGE af NI1 pool og NI1 pool + ULP1 at afgøre, om ULP1 spaltning var vellykket. 12.. Nikkel 2 (Ni2) Kolonne Load kløvet protein i samme Ni kolonnen og gentag trin 9.3 på en reduceret strømningshastighed på 1 ml / min. Det spaltede off tag vil binde til søjlen, og Tagless målprotein vil nu strømme-igennem. Saml gennemstrømningen i en frisk beholder. Vask Ni kolonne med 3 ml buffer A efterfulgt af 5 ml buffer B til eluering al Hans-mærket og uspecifikt bundet protein. Saml hver fraktion separat. Kør SDS-PAGE af Ni2 gennemstrømning, vaske og Ni2 elueringsfraktionerne at verificere ULP1 spaltning og at PRotein er til stede i gennemløbet. Brug en NanoDrop at måle A280 til groft bestemme tilstedeværelsen af protein. 13.. Koncentrerer Koncentrer Ni2 gennemstrømning (og Ni2 eluering hvis proteinet er til stede) til 5 ml med en Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugerør. Spin i 10 minutters intervaller ved 4.000 rpm ved 4 ° C. Bland med en pipette mellem hver tur til at forhindre protein fra over-koncentrere langs membranen. 14.. Gelpermeationskromatografi (SEC) Opsætning af en Sephacryl S-100 10/30 GL kolonne (GE Healthcare) ved ækvilibrering med 200 ml SEC puffer ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min på en AKTApurifier systemet (GE Healthcare). Forbered 10 ml superloops til brug på SEC kolonnen i henhold til producentens anvisninger. Ved hjælp af en 5 ml sprøjte, indlæse prøver på superloops og begynde SEC løb. Overvåg UV-absorbans trace ved 280 nm, mens indsamling lille volumen frhandlinger. Kør SEC fraktioner via SDS-PAGE. Pool SEC fraktioner viser de højeste intensitet bands. Koncentrer pooled SEC fraktioner. Der henvises til trin 13.1. Alikvot protein i 100 ul prøver flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Krystallisering 15.. Proteinkrystallisation Pre-fylde hvert reservoir af en 96-brønds Kompakt Jr krystallisering plade (Emerald Bio) med 80 pi krystallisering skærm (Emerald Bio) valg. Fortynd protein med dimensionering puffer til 2-20 mg / ml og opbevares på is. Dispensér 0,4 pi af protein og 0,4 ul af krystallisering skærmen i hver af de 96 brønde og dække med krystalklart fugebånd (Manco). Opbevar pladen ved 16 ° C, mens kontrol for proteinkrystallisation periodisk i løbet af de næste par uger under et dissektionsmikroskop. 16.. Crystal Høst </ P> Skabe et kryobeskyttelsesmiddel fra moderluden og ethylenglycol. Skær klar tape dækker godt med målproteinet krystal. Til en tom brønd, 1,6 ul af tilsvarende krystalliserende tilstand tilføje og kombinere med 0,4 pi ethylenglycol gav en slutkoncentration på 20% ethylenglycol og 80% krystallisering tilstand. Bemærk: at optimere krystal diffraktion prøve forskellige kryobeskyttelsesmidler såsom glycerol, olier, lav MW polyethylenglycoler, og / eller ved varierende procentdele af kryobeskyttelsesmiddel. Før høst afkøle en ALS-style pucken i en Dewar fyldt med flydende nitrogen og dæk med låg. Harvest krystal ved at placere en CryoLoop med den indre diameter matcher størrelsen af krystal på en magnetisk Crystal Wand (Hampton Research) og øse det direkte fra brønden løsning. Umiddelbart dyppe CryoLoop med den høstede krystal i kryoprotektant derefter nedsænkes i ALS-style pucken at blinke fryse crystal. Gentag for et ønsket antal krystaller. 17.. Crystal Screening / Dataindsamling Når høsten er færdig bruge en puck tryllestav at placere magnetiske cryo pucken låg på ALS pucken. Med bøjede tang, vend pucken på hovedet. Overfør pucken til en Rigaku ACTOR Dewar, skrue en Puck Pusher på pucken, og punch låget forlader det i Dewar med knappenåle opad. Brug JDirector software skærm hver krystal under følgende parametre: stråle slids indstillet til 0,5 grader, detektor afstand indstillet til 50 mm, billede trin til 70 grader, og eksponering længde indstillet til 30 sek. Kør Mosflm på test billeder, du har optaget med JDirector at bestemme, hvad den bedste krystal og strategi er for dataindsamling. Saml et komplet datasæt baseret på dine resultater fra Mosflm. 18.. Databehandling / Structure Bestemmelse Kør XDS / XScale 4 for at behandle datasættet. Åbn CCP4 suite software. Kør Phaser 5 til at beregne en molekylær erstatning løsning med en høj homologi søgemodel, når de foreligger. I dette tilfælde brugte vi PDBID 3CW4 som en søgning model 6.. Kør Refmac 7 at forfine din molekylære model mod den observerede refleksion indsamlet i datasættet. Endelig resolution bør baseres off af den højeste skallen og bestemmes af følgende parametre: R faktor> 50%, I / sigma> 2, og fuldstændighed> 90%. Byg en 3-dimensionel elektrontæthed model med den molekylære grafik software blishøne 8.. Før deponering af strukturen i FBF validere det med MolProbity 9-software til at kontrollere, at kvaliteten af strukturen er egnet til deponering.