Una panoramica del protocollo è presentato nella figura 1. Biologia Molecolare 1. Costruire design Utilizzare software Composer Gene per progettare costrutto proteine e codone ingegnerizzati sequenze di geni sintetici. L'uso di software Composer Gene è stato offerto in dettaglio altrove 3. Utilizza il modulo Viewer Allineamento e Costruire Design del modulo per confrontare sequenze proteiche allineamenti e definire costrutto proteine. Allineare bersaglio sequenza amminoacidica a entrambi gli elementi strutturali primari e 3D da omologhi nella Protein Data Bank (PDB), se disponibili (Figura 2). Utilizzare le informazioni di allineamento per fare i disegni costrutto struttura a guida scegliendo nuovi termini sulla base di conservazione della struttura primaria e strutture 3D di omologhi. Progettazione inserto PCR (IPCR) e vettore PCR (vPCR) amplimeri (terminale primer). Utilizzando Gene CAlgoritmo proteina-a-DNA di omposer, back-tradurre la sequenza amminoacidica costrutto ingegnerizzato in codone sequenza di acido nucleico. Utilizzare la corretta tabella codon usage (CUT) per ottimizzare sequenza per l'espressione in E. coli. Praticamente clonare inserto in pET28 vettore modificato per incorporare un tag N-terminale Istidina 6x e proteina di fusione Smt3/SUMO che consente una facile purificazione. Mettere ordine gene sintetico con DNA 2.0 e ordine primer dalle tecnologie del DNA integrati. 2. Polimerasi incompleta Primer Extension (PIPE) Clonazione Preparare Primer e geni Centrifugare le piastre forniti dal produttore contenenti primer a 1.000 rpm per 1 min. Portare concentrazione dei primer a 100 micron e aggiungere 50 microlitri di buffer TE. Diluire primer a 10 micron con deionizzata (DI) in una piastra a 96 pozzetti fondo a V. Centrifugare il gene fornito dal produttore in una provetta da 1,5 ml a 1.300 rpm per 1 min. <li> Usando tampone TE, portare la concentrazione di DNA di ciascun tubo a 50 ng / mL. In provette da 1,5 ml, fare diluizioni di ciascun primer a 10 ng / ml. Conservare primer e geni a -20 ° C quando non in uso. Preparare Inserisci PCR (IPCR) Scongelare una fiala di Pfu Master Mix su ghiaccio; mantenere i geni e primer a temperatura ambiente. Creare una mappa piastra assegnazione pozzi per un set di primer e costruire. Aggiungere 13 ml di acqua deionizzata in ogni pozzetto di una piastra PCR da 96 pozzetti. Aggiungere 5 ml di avanti e 5 ml di primer reverse per ciascuna reazione nella piastra a 96 pozzetti secondo la mappa piastra, assicurando cambiare punte tra ogni pozzetto. Aggiungere 2 ml di ogni gene piena lunghezza adeguata al suo bene secondo la mappa piastra. Aggiungere 25 ml di Pfu Master Mix per ogni bene, assicurando a cambiare punte tra ogni bene. Ciclo le reazioni utilizzando le seguenti condizioni di PCR: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 sec 50 ° C 45 sec 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Ripetere i passaggi bd per 25 cicli. Trasferire 10 ml di ogni reazione IPCR ad una nuova piastra PCR da 96 pozzetti. Aggiungere 3 ml di colorante carico 6X per ogni campione. Separare ogni campione su una% TAE EtBr gel di agarosio 1 a 110 V, accanto a un 100-500 bps scaletta del DNA per confermare frammento di amplificazione. Conservare IPCR prodotto a -20 ° C, quando non in uso (evitare congelamento scongelamento per quanto possibile). 3. Preparare PCR Vector (vPCR) Inizio cultura durante la notte di trasformare E. coli con pET28 vettore plasmidico. Inoculare due provette da 5 ml di brodo 2-YT con 50 mg / ml di kanamicina. Grow culture durante la notte a 37 ° C in agitatore a 220 giri al minuto. Spin down colture dopo la crescita durante la notte per centrifugazione a 3000 rpm per 15 min. Utilizzare un Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit per estrarre pET28 vettore dal pellet batterico in base alle istruzioni del produttore. Setup enzimi di restrizione digestioni di estratti pET28 plasmide. Aggiungere 2,2 ml di tampone BamHI 10X e 1 ml di BamHI e HindIII per 20 l di pET28 vettore. Incubare la reazione per 1 ora a 37 ° C. Prodotto di digestione separato su un gel. Fare riferimento al punto 2.2.10. Tagliare banda vettore dal gel e purificarla con il QIAquick Gel Extraction Kit secondo le istruzioni del produttore. Utilizzando un NanoDrop, quantificare la concentrazione di DNA. Diluire tagliato vettore a 10 ng / ml. Conservare a -20 ° C, quando non in uso. Preparare primer vPCR. Centrifugare IDT oligonucliotides forniti per 1 min a 1.300 giri al minuto. Portare la concentrazione di 100 mM con acqua deionizzata. Preparare 10 micron diluizione di entrambi i primer forward e reverse in una provetta da 1,5 ml. Conservare primer e diluizioni di primer a -20 ° C. Scongelare Pfu Master Mix su ghiaccio e disgelo modello e primer a temperatura ambiente. Reazioni vPCR di installazione in una piastra PCR da 96 pozzetti: Nella prima riga di una piastra a 96 pozzetti combinano 60 pl di entrambi i primers vPCR avanti e inversa e 24 pl di digerito pET28 dima (10 ng / ml). Usando una pipetta multicanale 12-tip, trasferire 12 microlitri del primer e master mix modello a ogni residua pozzetto della piastra. Ciò dovrebbe tradursi in 12 microlitri di primer e template master mix in ciascun pozzetto della piastra. Aggiungere 13 ml di acqua deionizzata in ogni pozzetto. Aggiungere 25 ml di Pfu Master Mix in ciascun pozzetto. Ciclo le reazioni attraverso le condizioni di PCR utilizzati nella fase 2.2.7. Pool tutte le reazioni vPCR in una provetta Falcon 15. Verificare frammento di amplificazione separando 10 ml di prodotto in pool PCR su un gel (lunghezza prevista del digerito pET28 vettoreè di circa 6 KB). Fare riferimento al punto 2.2.10. Preparare unire le piastre. Aliquota 3 ml di prodotto vPCR in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo a V. Conservare le piastre a -20 ° C fino a fusione con il prodotto IPCR. 4. Unisci IPCR e vPCR Prodotti Prodotti IPCR disgelo e pre-aliquotate vPCR 96 pozzetti fondono piastra a temperatura ambiente. Aggiungere 3 ml di ogni prodotto IPCR al suo rispettivo pozzetto della piastra di unione. Trasforma unire piastra in Top Ten cellule competenti chimicamente. Aggiungere 2 ml di ogni reazione di fusione in un unico tubo da 50 ml di cellule chimicamente competenti del fornitore e procedere con il protocollo fornito dal produttore. Preparare le culture durante la notte per ogni costrutto dalla piastra di trasformazione. Un'aliquota 5 ml di brodo TB (con 50 pg / ml kanamicina) da un serbatoio 25 ml sterile in ciascun pozzetto di un blocco ben profondo. Utilizzando steriLe tecniche, scegliere una colonia isolata da ogni piatto trasformazione e inoculare il bene appropriata del blocco pozzo profondo. Coprite il blocco con un coperchio Airpore. Agitare blocco a 220 rpm a 37 ° C per una notte. Cellule pellet mediante centrifugazione del blocco per 30 min a 4000 rpm. Eliminare il sopranatante e picchiettare la parte superiore del blocco di asciugare con un tovagliolo di carta. Mini-prep usando un Qiagen 96 pozzetti apparato vuoto secondo le istruzioni del produttore. 5. Preparazione Glicerina Azioni di costrutti clonati con successo Trasformare clonato con successo sequenza di DNA validato in BL21 (DE3) cellule chimicamente competenti in base alle istruzioni del produttore. Per ogni costrutto, scegliere una singola colonia isolata dal (DE3) trasformazione e inoculare BL21 in 1 ml di 2-YT brodo (con 50 mg / ml kanamicina). Agitare culture a 220 rpm per 3-4 ore a 37 ° C. Etichettare un 1,5 mlprovetta con tappo a vite con il numero unico costrutto di identificazione, ceppo cellula, e la data. Aggiungere 500 ml di glicerolo al 50% e 500 ml di coltura cellulare e capovolgere varie volte. Memorizzare immediatamente magazzino glicerolo in ghiaccio secco o in un congelatore ° -80 C. 6. Expression Testing Lysis Buffe r Tampone di lavaggio Tampone di eluizione 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 300 mM di NaCl 10 mM imidazolo 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 microlitri / ml Benzonase 1 mg / ml di lisozima 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0 300 mM di NaCl 20 mM imidazolo 0,05% Tween 20 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM di NaCl 250 mM imidazolo 0,05% Tween 20 * Aggiungi Benzonase, lisozima,e inibitore di proteasi immediatamente prima lisi. Streak un campione dal magazzino glicerolo su kanamicina agar selettivo e incubare una notte a 37 ° C. Avviare un non-indurre pre-coltura in un blocco 96 pozzetti a fondo tondo; inoculare 1,2 ml TB brodo (con 50 mg / ml kanamicina) supplementato con 0,5% di glucosio con una E. freschi coltivati coli isolano. Cresce durante la notte agitazione a 220 rpm a 37 ° C. Dopo una crescita overnight, avviare culture induzione inoculando 1,2 ml di brodo TB (con 50 mg / ml kanamicina) supplementato con Novagen Overnight sistema Express 1 (secondo il protocollo del produttore) con 40 pl di pre-coltura. Far crescere le culture induzione di piccola scala a 20 ° C per 48 ore, agitazione a 220 rpm. Celle di raccolta per centrifugazione a 4000 rpm per 15 minuti, versare il surnatante e conservare a -20 ° C per almeno 1 ora prima della lavorazione. Nel blocco 96 pozzetti, risospendere il pellet di cellule in 300 microlitri tampone di lisi. </li> Incubare le cellule in tampone di lisi a temperatura ambiente per 30 minuti seguita da lisi meccanica da agitando vigorosamente per 30 min a temperatura ambiente. Chiarire il lisato grezzo mediante centrifugazione per 30 min a 4000 rpm a 4 ° C. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 200 microlitri di lisato chiarificato (frazione solubile) per un vassoio 96 pozzetti a fondo piatto (Qiagen). Per ciascun pozzetto contenente un campione, aggiungere 40 microlitri perline Ni-NTA (Qiagen magnetici). Agitare delicatamente la piastra su una sedia a dondolo per 1 ora a 16 ° C. Posizionare la piastra su un piatto posto magnetica (Qiagen) e rimuovere la frazione solubile non legato. Fare attenzione a non pipettare nessuna delle perline Ni-NTA. Rimuovere la piastra dalla piastra posta e delicatamente risospesi le perline in 200 microlitri di tampone di lavaggio. Pipettare su e giù per 30 secondi e poi mettere la piastra posteriore sulla piastra posta. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere il punto 6.12. Rimuovere la piastra di lamiera posta ed eluire il Ni-NTA legato target proteina mediante lavaggio con 50 microlitri tampone di eluizione per 5 min. Ritorno piatto fondo piatto per piatto messaggio magnetica e trasferire l'eluizione di una nuova piastra a 96 pozzetti fondo a V. Trasferire 20 microlitri della eluizione di una fresca 96 pozzetti fondo a V e reagiscono con 1 microlitri ULP1 proteasi. Secondo il protocollo del produttore, analizzare la frazione eluita ed eluita + Ulp1 mediante elettroforesi capillare utilizzando un LabChip 90. In alternativa, tutte le frazioni dalla sperimentazione espressione possono essere analizzati mediante SDS-PAGE. 7. Grande Fermentazione Scala Utilizzare un puntale sterile per ottenere un graffio da un glicerolo magazzino, inoculare 100 ml di brodo di TB (con 50 mg / ml di kanamicina) e crescere durante la notte. Agitare a 220 rpm e 37 ° C. Dopo una crescita overnight, espandere precoltura inoculando 1 L di brodo TB con soluzioni dell'autoinduzione EMD (cfr. protocollo del produttore) (con 50 mg / ml kanamicina) in un pallone da 2 L confuso con 10 ml dipre-cultura (diluizione 1:100). Agitare le colture espanse 1 L a 37 ° C; modificare la temperatura della agitazione incubatore a 20 ° C quando viene raggiunta una densità ottica di 0,6 (OD 600). Dopo la crescita durante la notte, prendere un rappresentante 10 ml aliquota da ogni costrutto per la prova di espressione. Cella Harvest pasta per centrifugazione a 5000 rpm per 15 minuti e scartare il surnatante. Cella di congelamento incollare a -80 ° C. Purificazione delle proteine Buffer: Lysis Buffer Buffer A (equilibrazione) Buffer B (eluizione) Dimensionamento Colonna Buffer 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% Glicerina 0,02% CHAPS 10 mM imidazolo 1 mM TCEP 50 mM di arginina 5 Benzonase microlitri 100 mg lisozima 3 proteasi Compresse serotonina (EDTA-libero) 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazolo 1 mM TCEP 50 mM di arginina 0,25% Glicerina 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazolo 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% Glicerina 1 mM TCEP * Aggiungi Benzonase, lisozima, e compresse di inibitori della proteasi per ogni campione da 150 ml immediatamente prima di lisi. 8. Cell Lysis Fare 2 L di tampone di lisi, non aggiungere lisozima, compresse inibitore della proteasi o benzonasi (ogni campione saranno lisate separatamente in 150 ml di tampone di lisi). Disgelo e risospendere cella incolla in tampone di lisi in una massa 01:05: rapporto in volume da vigorosamente agitazione per 30 min a 4 ° C. Rompere pezzi sciolti dai lati del bicchiere con una spatola pulita. Durante questo periodo di tempo, preparare Ni e Dialysis Buffer Sul ghiaccio, lisare le cellule utilizzando un sonicatore Misonix (il 70% di potenza, 2 sec a / 1 sec spento impulsi per 3 min) e delicatamente contenitore girandola per evitare il surriscaldamento. Salvare un piccolo (200 ml) aliquota del lisato grezzo per le analisi future. Chiarire il lisato grezzo per centrifugazione a 18.000 xg per 35 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e salvare un piccolo (200 ml) aliquota per le analisi future. Conservare pellet a 4 ° C fino a quando si conferma la proteina è stata lisate nella frazione solubile. 9. Proteine Setup Maker Pre-run Con il produttore di proteina attivata e il software aperto, inizializzare lo strumento. Una volta inizializzato, allegare uno 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF colonna Nichel-chelato (Ni colonna) in una linea separata del gantry per ciascuno dei campioni. Esegui volumi di colonna 3-4 (CV) di tampone di equilibrazione attraverso ogni colonna. Primo il raggiungimento dell'equilibrio e linee tampone di eluizione. Equilibrate le colonne aspirando buffer A attraverso la colonna una volta. 10. Nickel 1 (NI1) Colonna Lavare ciascuna colonna con 20 ml di acqua Milli-Q per rimuovere tampone di conservazione. Esegui 5 ml di tampone B e 25 ml di tampone A per il raggiungimento dell'equilibrio. Caricare il lisato chiarificato contenente proteina solubilizzata nelle colonne a una velocità di 2 ml / min poi seguire da un lavaggio 15 ml con tampone A. Eluire le proteine in un gradiente passo con i buffer A e B con i seguenti rapporti rispettosamente: 5 ml 95:5, 60:40 5 ml, 10 ml di 0:100. Raccogliere separatamente ogni frazione di eluizione. Analizzare: frazioni eluite, lisato grezzo, lisato chiarificato e flow-through mediante SDS-PAGE. Pool frazioni contenenti la proteina e utilizzare un NanoDrop alla misura A 280 per determinare approssimativamente la quantità di proteine presenti. 11. ULP1 Decolleté Mantenere una piccola aliquota (250 microlitri) del pool NI1 colonna per la successiva analisi del gel. Portare il restodella piscina NI1 a 10 ml e aggiungere ubiquitina-proteasi come 1 (ULP1) a 1 ml / 5 mg di proteine totali per rimuovere il tag affinità His-Smt. Dializzare la piscina NI1 + ULP1 contro 2 L di tampone A per 4 ore a 4 ° C in 10 kDa cutoff peso molecolare (MWCO) su una piastra di agitazione a 4 ° C. Dopo la dialisi, eseguire SDS-PAGE di NI1 piscina e NI1 piscina + ULP1 per determinare se ULP1 scissione ha avuto successo. 12. Nickel 2 (Ni2) Colonna Caricare proteina spaccati sulla stessa colonna Ni e ripetere il passo 9,3 ad una portata ridotta di 1 ml / min. Il tag off spaccati si legherà alla colonna e la proteina bersaglio tagless sarà ora a flusso continuo. Raccogliere il flusso passante in un contenitore fresco. Lavare la colonna di Ni con 3 ml di tampone A seguito da 5 ml di tampone B per eluire tutto His-tagged proteine e non specifico legato. Raccogliere separatamente ogni frazione. Esegui SDS-PAGE di Ni2 flow-through, lavare e Ni2 frazioni di eluizione per verificare ULP1 scissione e che protein è presente nel flusso passante. Utilizzare un NanoDrop per misurare A 280 per determinare o meno la presenza di proteine. 13. Concentrando Concentrare il flusso passante Ni2 (e Ni2 eluizione se proteina è presente) a 5 ml con una Ultra 10 kDa MWCO provetta da centrifuga Amicon. Spin a intervalli di 10 min a 4000 rpm a 4 ° C. Mescolare con una pipetta tra ogni giro per evitare che le proteine da un'eccessiva concentrazione lungo la membrana. 14. Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) Impostare una Sephacryl S-100 10/30 GL colonna (GE Healthcare) da equilibrare con 200 ml di tampone SEC ad una portata di 0,5 ml / min su un sistema AKTApurifier (GE Healthcare). Preparare 10 ml superloops per l'uso su colonna SEC in base alle istruzioni del produttore. Usando una siringa da 5 ml, caricare i campioni su superloops e iniziare la corsa SEC. Monitorare la traccia UV-assorbanza a 280 nm, mentre la raccolta piccolo volume frazioni. Esegui frazioni SEC tramite SDS-PAGE. PISCINA La SEC frazioni che mostrano le bande di intensità più elevati. Concentrato frazioni SEC in pool. Fare riferimento al punto 13.1. Proteine aliquota in 100 campioni microlitri, Flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. CRISTALLIZAZIONE 15. Proteine Cristallizzazione Pre-riempire ogni serbatoio di una piastra a 96 pozzetti cristallizzazione compatta Jr (Emerald Bio) con 80 ml di schermo cristallizzazione (Emerald Bio) di scelta. Diluire proteina con il dimensionamento del buffer di 2-20 mg / ml e conservare il ghiaccio. Dispensare 0.4 ml di proteine e 0,4 microlitri della schermata cristallizzazione in ciascuno dei 96 pozzi e coprire con cristallo trasparente nastro di tenuta (Manco). Conservare la piastra a 16 ° C durante il controllo per la cristallizzazione della proteina periodicamente nel corso delle prossime settimane sotto un microscopio da dissezione. 16. Cristallo raccolta </ P> Creare un crioprotettore dalle acque madri e glicole etilenico. Tagliare il nastro adesivo trasparente che copre il bene con il cristallo di proteina bersaglio. Per un pozzetto vuoto, aggiungere 1,6 microlitri della corrispondente condizione di cristallizzazione e si combinano con 0,4 ml di glicole etilenico producendo una concentrazione finale del 20% di glicole etilenico e 80% cristallizzando condizione. Nota: per ottimizzare diffrazione a cristallo provare diversi crioprotettori come: glicerolo, oli, glicoli di polietilene a bassa MW, e / o in percentuali variabili del crioprotettore. Prima della raccolta raffreddare un puck ALS-stile in un dewar pieno di azoto liquido e coprire con il coperchio. Raccogliere il cristallo ponendo un CryoLoop con il diametro interno adeguamento delle dimensioni del cristallo su una bacchetta di cristallo magnetico (Hampton Research) e scoop direttamente dalla soluzione bene. Immergere immediatamente il CryoLoop con il cristallo raccolto nel cryoprotectant poi immergere nella puck ALS-style a lampeggiare congelare il crystal. Ripetere per un numero desiderato di cristalli. 17. Collezione Screening / Dati di cristallo Una volta che la raccolta è completa usare una bacchetta puck per posizionare il disco magnetico crio coperchio sulla SLA puck. Con pinze piegate, capovolgere il disco a testa in giù. Trasferire il disco ad un Rigaku ATTORE dewar, avvitare un Pusher Puck sul disco, e perforare il coperchio lasciandolo nel dewar con perni a faccia in su. Utilizzando il software di JDirector, schermo ogni cristallo con i seguenti parametri: fessura fascio impostato a 0,5 gradi, la distanza rivelatore impostato a 50 mm, passo immagine a 70 gradi, e la lunghezza di esposizione impostato a 30 sec. Eseguire Mosflm sulle immagini di prova che hai scattato con JDirector per determinare quale sia la migliore strategia è di cristallo e per la raccolta dati. Raccogliere un set di dati completo, sulla base di risultati di Mosflm. 18. Elaborazione / Determinazione Struttura dati Esegui XDS / XSCALE 4 per elaborare il set di dati. Aprire il software CCP4 privato. Esegui Phaser 5 per calcolare una soluzione di sostituzione molecolare utilizzando un modello di ricerca ad alta omologia, se disponibile. In questo caso abbiamo usato il 3CW4 PDBID come modello di ricerca 6. Esegui Refmac 7 per affinare il modello molecolare contro la riflessione raccolti nel dataset. Risoluzione finale deve essere basato fuori del guscio più alta e determinata dai seguenti parametri: Fattore R> 50%, I / sigma> 2, e la completezza> 90%. Costruire un modello di densità elettronica 3-Dimensional con il software di grafica molecolare COOT 8. Prima di depositare la struttura nel PPB convalidare con un software MolProbity 9 per verificare la qualità della struttura è adatta per la deposizione.